Den presenterte protokollen er en svært fleksibel metode for genommanipulasjon i museovidukten. Det tillater dannelsen av sporadisk muterte celler omgitt av uredigerte celler i immunkompetent miljø. Dette er en fordel å studere kreftinitiering.
Den største fordelen med denne teknikken er at den er høy tilpasningsevne ved å målrette mot et organ, område, region eller celletype interesse med lett utskiftbare sett med mutasjonskombinasjoner, alt uten absolutt behov for en muselinje. Denne metoden kan enkelt tilpasses for bruk i organer med lumen samt organparenchyma. For å begynne, trekk et glasskapillærrør inn i et skarpt punkt ved hjelp av en mikropipettetrekker.
Bruk et par koniske, ultra finspisstang, klipp den spisse enden av det trukne kapillærrøret under et dissekerende mikroskop for å skape en åpning. Sørg for at åpningen ikke er for stor, da det vil skade ovidukten og forhindre langsom injeksjon. Deretter ordner du det sterile kirurgiske utstyret, mikroskopet, mikromanipulatoren og elektroporatoren på en ren, steril benk eller inne i biosikkerhetsskapet.
Varm varmeputen på en plate og plasser den under et rent, fullt utstyrt bur. Hell steril 1X PBS i en petriskål. Bruk en ren saks til å klippe det absorberende papiret i firkanter på en etter en centimeter.
Slipp disse i PBS for å suge dem. Fest deretter den trukne kapillærnålen til klemmemonteringsmikromanipulatoren, stabilisert av et magnetisk feste. Pipett to mikroliter av injeksjonsoppløsningen på en steril petriskål.
Mens du observerer under mikroskopet, ta sakte opp en til to mikroliter av injeksjonsoppløsningen i mikroinjeksjonsnålen ved hjelp av den lufttrykkssprøyten festet til mikromanipulatoren. Unngå å ta opp bobler i nålen. Etter å ha bedøvet en seks til åtte uker gammel kvinnemus og administrert karprofen subkutant, plasser musen på det oppvarmede absorberende papiret med dorsalsiden vendt oppover.
Påfør øye smøremiddel til hvert øye for å forhindre tørking under operasjonen. Etter å ha bekreftet bedøvelsesstansen ved å klemme tåen med et par tang, fjern dorsalpels rundt det potensielle snittstedet og tørk den nakne huden med antiseptisk middel. Bruk en rett, butt tang til å klype den nakne huden og lage et centimeter langt snitt langs kroppens midtlinje ved hjelp av en steril saks.
Knip sammen og hold opp den ene siden av kuttstedet med et par sterile Ason-tanger. Deretter bruker du et par sterile, buede, takkede tanger, skiller huden forsiktig fra kroppsveggen, starter ved midtlinjesnittet og beveger seg sideveis. Etter å ha funnet fettputen under nyrene, bruk et par sterile, rette, butte tang for å klemme kroppsveggen rett over fettputen.
Lag et lite snitt i kroppsveggen ved hjelp av et par sterile, skarpe, spisse dissekerende saks, pass på å unngå blodkar. Mens du fortsatt klemmer kroppsveggen med rett, stump, tang, setter du inn et par sterile, butte, buede tang i snittet og utvider snittet som er opprettet i kroppsveggen. Ta tak i den synlige fettputen med den stumpe, buede, tangen og trekk den ut av hullet for å avsløre eggstokken, ovidukten og livmoren.
Hold reproduksjonssporet eksponert ved å klemme fettputen med en steril bulldogklemme. Plasser forsiktig den bedøvede musen med det reproduktive sporet eksponert på scenen av et dissekerende mikroskop. Juster mikromanipulatoren slik at injeksjonsnålen med oppløsningen observeres under mikroskopet.
Deretter manipulerer mikroskopet for enkelt å observere eggstokken, ovidukten og livmoren. Bruk et par sterile, koniske, ultrafinspissede tanger, hold regionen av ovidukten som skal injiseres. Regionen må justere seg etter retningen på mikroinjeksjonsnålen.
Juster mikromanipulatoren for å punktere ovidukten med mikroinjeksjonsnålen, samtidig som ovidukten mates på nålen ved hjelp av de koniske ultrafinspisstangene. Beveg forsiktig mikroinjeksjonsnålen for å bekrefte at den er satt inn i ovidukten. Injiser sakte en mikroliter av injeksjonsoppløsningen og 5% filtrert trypanblå inn i ovidukten, mens du observerer bevegelsen av den blå løsningen og utvidelsen av oviduktlumen.
Unngå å introdusere bobler i lumen. Etter injeksjon, fjern nålen fra ovidukten og dekk området som skal målrettes med et stykke absorberende papir som er fordypet i PBS. Ta tak i det forsugede papiret og området som skal målrettes med en elektrodepinsett og trekk vekk fra kroppen.
Elektroporer målområdet ved hjelp av tre unipolare pulser ved 30 volt i 50 millisekunder med intervaller på ett sekund. Etter elektroporering, fjern absorberende papir og legg musen tilbake på varmeputen. Løsne bulldog-klemmen og skyv det eksponerte reproduksjonssporet forsiktig tilbake under kroppsveggen.
Etter at begge oviduktene har blitt elektroporert og plassert tilbake under kroppsveggen, bruk en nålholder for å gripe nålen. Knip og hold opp den ene siden av kuttstedet ved hjelp av et par sterile, buede, taggete tang. Bruk deretter kanyleholderen til å manipulere suturen og lukke såret.
Flytt musen inn i et rent bur plassert på toppen av en varmepute og overvåke til musen er aktiv. Ved elektroporering ved bruk av tre eller en millimeter pinsett-type elektroder, ble det målrettede området merket med TdTomato begrenset til det distale oviduktepitelet. Med tre millimeter pinsett-type elektroder ble et mye større område av ampullene målrettet sammenlignet med å målrette bare den distale mest spissen, infundibulumet, ved hjelp av en millimeter pinsett-type elektroder.
I det målrettede området ble elektroporerte celler merket av TdTomato tilfeldig fordelt mellom ikke-elektroporerte celler. I tillegg ble elektroporerte celler begrenset til slimhinneepitelet og ikke observert i det underliggende stromale eller muskellaget. For å bekrefte CRISPR-mediert genomredigering, kan fluorescerende celler isoleres ved FACS-sortering for DNA-isolering og sekvensering.
Dette gjør at vi kan kvantifisere frekvensen av målrettede alleler, spore den unike kommunikasjonen mellom prøven for å følge in vivo koronal evolusjon av primærtumor og metastase i immunkompetent miljø.
