Name: isolation, characterization, and total dna extraction to identify endophytic fungi in mycoheterotrophic plants
Uploaded: 2023-05-05T12:00:00
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Nous remercions les financements de la FAPESP (2015/26479-6) et du CNPq (447453/2014-9). JLSM remercie le CNPq pour les subventions à la productivité (303664/2020-7). Le MPP remercie Capes (bourse de maîtrise, processus 88887.600591/2021-00) et CNPq.

1. Prélèvement d’échantillons de plantes
<ol><li>Prélèvement d’échantillons pour les méthodes dépendantes de la culture<ol><li>Creusez soigneusement les organes souterrains ; Il peut s’agir de racines, de tiges, de rhizomes ou d’organes de stockage de la plante à collecter. En dehors des sols très compacts, collectez ces échantillons à la main. REMARQUE : L’utilisation d’outils tels que des truelles ou des pelles dans cette étape est déconseillée, car elle peut endommage...

<ol>
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La désinfestation superficielle des échantillons de plantes est l’une des étapes les plus critiques du protocole présenté. Il est fortement souhaitable qu’il n’y ait pas de contamination de la vaisselle PDA par des gouttes provenant du dernier lavage. Les bactéries sont fréquemment observées en tant que contaminants dans les boîtes d’isolement, généralement plus que les champignons sporulants en suspension dans l’air, étant donné que les bactéries endophytes sont également...

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Juliana Lishcka Sampaio Mayer
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Juliana Lischka Sampaio Mayer

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Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Les champignons endophytes sont, par définition, ceux qui habitent l’intérieur des organes et des tissus végétaux lors d’infections discrètes (c’est-à-dire sans causer de dommages à leur hôte)1,2. Ces champignons peuvent interagir de manière neutre ou bénéfique avec les plantes hôtes, peuvent conférer une résistance aux agents pathogènes et aux conditions environnementales défavorables, et peuvent contribuer à la synthèse de composés bénéfiques pour la plante (par exemple, les facteurs de croissance et d’autres phytohormones)1,3. Les endophytes mycorhiziens sont des champignons qui établissent des associations mycorhiziennes avec la plante, participant au transfert des nutriments4. Chez les Orchidaceae, l’interaction avec les endophytes mycorhiziens est fondamentale pour la germination des graines chez la grande majorité des espèces, et l’établissement des plantules chez toutes les plantes de la famille5. Dans de tels contextes, les orchidées mycohétérotrophes représentent un cas de dépendance totale vis-à-vis de leurs partenaires mycorhiziens, car elles dépendent du transfert de nutriments minéraux et de composés carbonés par ces champignons pendant tout leur cycle de vie6. Par conséquent, l’isolement et l’identification des champignons associés est une base fondamentale lors de l’étude des stratégies de vie mycohétérotrophes. De plus, on sait peu de choses sur les rôles des endophytes fongiques chez les plantes mycohétérotrophes ou même sur la diversité réelle de ces champignons 7,8.
L’étude des champignons endophytes peut être menée à l’aide de différentes techniques, traditionnellement décrites comme indépendantes ou dépendantes de la culture, par exemple : (a) l’observation directe, (b) l’isolement fongique et l’identification morphologique et/ou moléculaire, et (c) l’extraction totale de l’ADN des tissus végétaux et l’identification moléculaire9. Dans l’observation directe (a), les champignons endophytes peuvent être étudiés alors qu’ils sont encore à l’intérieur des cellules et des tissus végétaux par microscopie optique ou électronique9, car différents protocoles de microscopie sont détaillés par Pena-Passos et al.10. Par des méthodes d’isolement (b), les endophytes fongiques peuvent être caractérisés en fonction de leurs colonies, de leurs hyphes et de la morphologie de leur structure de reproduction ou de résistance. De plus, grâce à des techniques d’isolement, il est possible d’effectuer l’identification moléculaire des isolats par extraction d’ADN, amplification de séquences d’identification moléculaire (codes-barres ou empreintes digitales) et séquençage11. Cette dernière technique (c) permet l’identification moléculaire de champignons endophytes par extraction d’ADN à l’intérieur des tissus végétaux (métabarcoding), suivie d’une préparation et d’un séquençage de la bibliothèque12.
De plus, des isolats fongiques peuvent être appliqués dans des essais de germination symbiotique, en utilisant des graines d’orchidées autotrophes ou mycohétérotrophes. Un exemple d’une telle application est l’étude menée par Sisti et al.13, décrivant la germination et les premiers stades de développement du protocorme chez Pogoniopsis schenckii, une orchidée mycohétérotrophe, en association avec certains de ses isolats, comprenant des champignons endophytes non mycorhiziens. Le protocole de germination symbiotique appliqué est détaillé et présenté dans une vidéo par Pena-Passos et al.10. L’isolement des champignons en association avec différents organes végétaux permet d’orienter diverses recherches sur la nature des interactions plantes-champignons (par exemple, pour comprendre les aspects écologiques ou physiologiques de l’association, ainsi que des enquêtes sur le transfert des nutriments des champignons à la plante)9.
Les méthodologies présentées dans la section 1 sont basées sur une collecte d’échantillons d’organes souterrains, car ces organes présentent le plus de difficultés à collecter, et ils présentent un intérêt majeur puisque les endophytes mycorhiziens les colonisent. Cependant, les deux protocoles inclus (étapes 1.1 et 1.2) peuvent être appliqués à d’autres organes végétaux mycohétérotrophes (p. ex., rhizomes, tiges florales et fruits). La méthode de collecte décrite à l’étape 1.1 est destinée à l’isolement des champignons endophytes (section 2) pour la caractérisation morphologique (sections 4 et 5) et/ou à l’extraction totale de l’ADN pour l’identification des isolats (section 6). D’autre part, la méthodologie de collecte décrite à l’étape 1.2 est exclusivement attribuée à l’extraction totale de l’ADN des tissus végétaux pour les techniques de métabarcoding (section 7). Dans la section 3, quatre méthodes de stockage et de conservation des champignons filamenteux sont présentées, deux pour le stockage à court terme (3 à 6 mois) et les deux autres adéquates pour le stockage à long terme (>1 an). La caractérisation morphologique (sections 4 et 5) peut être associée à l’identification moléculaire pour la renforcer et fournir des informations importantes sur la macro- et micromorphologie fongique. La figure 1 résume les méthodologies collectives décrites ci-dessous.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65135/65135fig01.jpg"> Figure 1 : Résumé schématique des méthodes présentées. Collecte de plantes et isolement fongique, préservation et identification moléculaire par des méthodologies dépendantes et indépendantes de la culture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65135/65135fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for materials sterilization in many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;&#160;</td>
			<td>Merck/Eppendorf</td>
			<td>5810 G</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td>(for samples collection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>75768</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR114831</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>100983</td>
			<td>It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass test tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS7082516</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>20411</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>563935</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td>(for preparing LPCB - hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactophenol blue solution (LPCB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61335</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(class I, from any company, for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for hyphae observation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MB Spin Columns</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl blue (cotton blue)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5528</td>
			<td>(for preparing LPCB - hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HS4323</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (2 mL)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR780546</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(for preservation of fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)</td>
			<td>Merck/Pyrex</td>
			<td>SLW1480/10D</td>
			<td>(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)</td>
			<td>Merck/Aldrich</td>
			<td>Z740618</td>
			<td>(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, &#947;-irradiated, non-autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)</td>
			<td>Merck/Brand</td>
			<td>BR455732</td>
			<td>(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, &#947;-irradiated, non-autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1037</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247464</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247502</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>P2182</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerBead tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid mounting medium (Entellan)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.0796</td>
			<td>(for fungi slide culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>717185</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(commercial product, for superficial desinfestation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>(for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td>(for installation of plant fragments)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoblock</td>
			<td>Merck/Eppendorf</td>
			<td>EP5362000035</td>
			<td>(or from other companies)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer and cell lyzer</td>
			<td>SPEX SamplePrep</td>
			<td></td>
			<td>2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Harleco</td>
			<td>364-M</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531</td>
			<td>(for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Solution (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1699</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unhulled rice grains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(for cryopreservation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shaped glass rod</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Sigma-Aldrich/BenchMixer</td>
			<td>BMSBV1000</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>(for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and total dna extraction to identify endophytic fungi in mycoheterotrophic plants

Les plantes mycohétérotrophes présentent l’une des formes les plus extrêmes de dépendance mycorhizienne, ayant totalement perdu leur capacité autotrophe. Aussi essentiels que toute autre ressource vitale, les champignons auxquels ces plantes s’associent intimement leur sont essentiels. Par conséquent, certaines des techniques les plus pertinentes dans l’étude des espèces mycohétérotrophes sont celles qui permettent d’étudier les champignons associés, en particulier ceux qui habitent les racines et les organes souterrains. Dans ce contexte, des techniques d’identification des champignons endophytes dépendants et indépendants de la culture sont couramment appliquées. L’isolement des endophytes fongiques permet de les identifier morphologiquement, d’analyser leur diversité et de maintenir les inocules pour des applications dans la germination symbiotique des graines d’orchidées. Cependant, on sait qu’il existe une grande variété de champignons non cultivables qui habitent les tissus végétaux. Ainsi, les techniques d’identification moléculaire indépendantes de la culture offrent une couverture plus large de la diversité et de l’abondance des espèces. L’objectif de cet article est d’apporter le soutien méthodologique nécessaire à la mise en place de deux procédures d’investigation : l’une dépendante de la culture et l’autre indépendante. En ce qui concerne le protocole dépendant de la culture, les processus de collecte et de conservation des échantillons de plantes des sites de collecte aux installations de laboratoire sont détaillés, ainsi que l’isolement des champignons filamenteux des organes souterrains et aériens des plantes mycohétérotrophes, la conservation d’une collection d’isolats, la caractérisation morphologique des hyphes par la méthodologie de culture sur lame et l’identification moléculaire des champignons par extraction totale de l’ADN. Englobant des méthodologies indépendantes de la culture, les procédures détaillées comprennent la collecte d’échantillons de plantes pour des analyses métagénomiques et l’extraction totale de l’ADN à partir d’organes végétaux achlorophylliens à l’aide d’un kit commercial. Enfin, des protocoles de continuité (p. ex., réaction en chaîne par polymérase [PCR], séquençage) sont également suggérés pour les analyses, et les techniques sont présentées ici.

Dans le protocole d’isolement, étant donné qu’il y a contamination par l’eau utilisée lors du dernier lavage et que la contamination est également détectée dans les boîtes de Pétri avec des fragments inoculés, différentes mesures peuvent être prises, selon le type de contaminant (tableau 1). Cette procédure doit être répétée dès le début en cas de contaminants fongiques très sporulants, qui présentent également une croissance accélérée, et de...

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Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Le présent article vise à fournir des protocoles détaillés et adéquats pour l’isolement des champignons endophytes associés aux plantes, la conservation à long terme des isolats, la caractérisation morphologique et l’extraction totale de l’ADN pour l’identification moléculaire ultérieure et les analyses métagénomiques.

Isolement, caractérisation et extraction totale de l’ADN pour identifier les champignons endophytes chez les plantes mycohétérotrophes

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

Les techniques présentées ici sont utiles pour étudier la communauté de champignons endophytes associée à différents organes végétaux. L’isolement des champignons endophytes permet leur identification, et est précieux dans d’autres techniques telles que la germination symbiotique. Pour commencer, préparez des boîtes de Pétri de milieu de culture PDA de huit à 10 centimètres complétées par trois millilitres par litre d’antibiotique.Vérifiez la contamination en incubant les boîtes de Pétri du milieu de culture à 36 degrés Celsius pendant 24 heures avant utilisation. Le lendemain, désinfester superficiellement les fragments de plantes mychohétérotrophes saines à l’aide d’une procédure standard et les placer dans une boîte de Pétri stérile. Pour évaluer l’efficacité de la désinfestation superficielle des échantillons, inoculer quelques gouttes d’eau distillée utilisées lors du dernier lavage des échantillons sur PDA.Ensuite, à l’aide d’un scalpel flammé et d’une pince, sectionnez les échantillons en morceaux de 0,2 centimètre d’épaisseur. Sectionnez les échantillons pour amplifier la surface à mettre en contact avec le milieu. Placez cinq fragments d’organes souterrains dans la plaque PDA supplémentée en antibiotiques aussi loin que possible les uns des autres sans toucher les bords de la boîte.Scellez les boîtes de Pétri avec du film alimentaire et conservez-les à l’abri de la lumière entre 25 et 27 degrés Celsius pendant cinq jours. Un jour avant la sous-culture, préparez des boîtes de Pétri de cinq centimètres en utilisant cinq à sept grammes par litre de milieu AA et incubez les plaques à 36 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour purifier les isolats fongiques, différenciez les colonies de plaques PDA par la couleur, le modèle de croissance, la texture et le format des marges.Délimitez ensuite les marges de la colonie sur la face inférieure de la boîte. Identifiez également les colonies à l’aide d’un code. À l’aide de la pointe d’un cure-dent en bois autoclave, récupérez une infime quantité de mycélium sur les marges de la colonie fongique identifiée et striez la plaque AA, produisant trois stries à un centimètre les unes des autres et des bords de la boîte.Étiquetez la plaque AA avec le code approprié à l’aide de papier autocollant et d’un crayon. Scellez les plaques avant de les incuber dans l’obscurité à 25 à 27 degrés Celsius pendant trois jours. Après l’incubation, observez méticuleusement les plaques pour identifier les hyphes fins formant des colonies individuelles.Délimitez la zone des colonies individuelles à l’aide d’un marqueur permanent. Coupez une partie du milieu contenant la colonie à l’aide d’un cure-dent autoclavé et transférez le volume coupé au centre d’une nouvelle boîte de Petri PDA sans antibiotiques. Après avoir étiqueté les boîtes de Pétri avec les codes des isolats, scellez-les avec un film alimentaire et maintenez-les dans l’obscurité à 25 à 27 degrés Celsius pendant sept à 14 jours.Pour commencer la conservation des isolats fongiques avec la méthode de Castellani, ajoutez 0,5 millilitre d’eau distillée dans le tube de microcentrifugation autoclavé de deux millilitres. À l’aide d’un cure-dent autoclave, découpez un milieu cuboïde de 0,5 par 0,5 centimètre dans les marges du mycélium d’isolats purifiés déjà cultivés. Placez quatre à six cuboïdes dans les tubes de la microcentrifugeuse avec de l’eau distillée.Conservez les tubes dans l’obscurité à 25 degrés Celsius aussi longtemps que nécessaire. Si nécessaire, récupérez un parallélépipède et placez-le au centre d’une nouvelle boîte PDA pour faire pousser un isolat stocké. Commencez la méthode de montage par taquinage en plaçant une goutte d’une teinture Toluidine blue-O sur une lame de verre propre.Différentes teintures peuvent être utilisées dans une telle technique. À l’aide d’un cure-dent autoclave, retirez soigneusement quelques hyphes de l’isolat cultivé et placez-les dans la goutte de tache. Placez une lamelle et analysez-la au microscope optique.Pour la méthode de montage du ruban adhésif, placez une goutte d’une teinture bleue de coton lactophénol sur une lame de verre propre. Découpez une bande de ruban adhésif transparent d’une taille qui s’adapte bien à la lame de verre et à la goutte de tache centrale. Dirigez la surface collante de la bande adhésive vers la surface du mycélium et essayez de recueillir quelques hyphes sans en presser ou en collecter trop.Collez ensuite le ruban adhésif sur la lame de verre, en vous assurant que la tache est en contact avec les hyphes collectés. Placez une goutte d’eau au-dessus du ruban et placez une lamelle avant d’analyser la lame au microscope optique. La croissance de petits groupes de mycélium champignon filamenteux émergeant de l’intérieur des fragments a été observée après cinq jours d’inoculation du fragment d’organe végétal mychohétérotrophe sur le milieu PDA.Pendant sept à 14 jours d’inoculation de l’isolat purifié, la croissance centrifuge d’une colonie d’isolats fongiques purs a été observée sur PDA, formant un seul mycélium circulaire. D’éventuelles contaminations ont été facilement identifiées, compromettant l’homogénéité de la colonie en ce qui concerne son aspect de forme de croissance, sa couleur et sa production de pigments dans le milieu. Une colonie isolée des racines fusiformes de l’orchidée mychohétérotrophe, Wullschlaegelia aphylla, était opaque et ne contenait pas de pigments diffusibles ni d’exsudats dans le milieu.La colonie était blanchâtre à grise sur la face supérieure et brunâtre sur la face inférieure. Les mycéliums étaient aériens et abondants, et les marges étaient irrégulières et aériennes. La colonie avait une texture veloutée et une topographie ridée sans structures macroscopiques.Les structures qui n’étaient pas facilement visibles dans le mycélium non coloré ont été exposées après coloration du mycélium fongique avec du bleu de coton lactophénol et du bleu de Toluidine-O, facilitant leur identification. Les méthodes d’isolement fongique présentées ici peuvent également être appliquées aux plantes vertes pour identifier les endophytes fongiques. Les champignons isolés peuvent être utilisés dans des essais de germination symbiotique.

Research

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