Name: isolation, characterization, and total dna extraction to identify endophytic fungi in mycoheterotrophic plants
Uploaded: 2023-05-05T12:00:00
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Wir danken für die Finanzierung durch FAPESP (2015/26479-6) und CNPq (447453/2014-9). JLSM bedankt sich bei CNPq für Produktivitätszuschüsse (303664/2020-7). MPP bedankt sich bei Capes (Master-Stipendium, Prozess 88887.600591/2021-00) und CNPq.

1. Entnahme von Pflanzenproben
<ol><li>Probenentnahme für kulturabhängige Methoden<ol><li>Graben Sie vorsichtig die unterirdischen Organe aus; Dabei kann es sich um Wurzeln, Stängel, Rhizome oder Speicherorgane der zu sammelnden Pflanze handeln. Abgesehen von sehr kompakten Böden sollten Sie diese Proben von Hand sammeln. HINWEIS: Die Verwendung von Werkzeugen wie Kellen oder Schaufeln in diesem Schritt ist nicht ratsam, da sie die empfindlichen Strukturen mykoheterotropher Pflanzen beschädigen...

<ol>
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Die oberflächliche Entwesung von Pflanzenproben ist eine der kritischsten Phasen des vorgestellten Protokolls. Keine Kontamination des PDA-Geschirrs mit Tropfen aus dem letzten Waschgang ist sehr wünschenswert. Bakterien werden häufig als Verunreinigungen in den Isolierschalen beobachtet, in der Regel mehr als luftgetragene sporulierende Pilze, wenn man bedenkt, dass endophytische Bakterien auch in Pflanzengeweben häufig vorkommen 3,11. Daher ist die Zugabe v...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
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Juliana Lischka Sampaio Mayer

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Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Endophytische Pilze sind per Definition solche, die das Innere von Pflanzenorganen und -geweben in unauffälligen Infektionen besiedeln (d. h. ohne ihrem Wirt Schaden zuzufügen)1,2. Diese Pilze können neutral oder vorteilhaft mit Wirtspflanzen interagieren, können Resistenzen gegen Krankheitserreger und ungünstige Umweltbedingungen verleihen und zur Synthese nützlicher Verbindungen für die Pflanze beitragen (z. B. Wachstumsfaktoren und andere Phytohormone)1,3. Mykorrhiza-Endophyten sind Pilze, die Mykorrhiza-Assoziationen mit der Pflanze eingehen und am Nährstofftransfer beteiligtsind 4. Bei Orchidaceae ist die Interaktion mit Mykorrhiza-Endophyten grundlegend für die Samenkeimung bei der überwiegenden Mehrheit der Arten und die Etablierung von Keimlingen bei allen Pflanzen der Familie5. In solchen Kontexten stellen mykoheterotrophe Orchideen einen Fall von völliger Abhängigkeit von ihren Mykorrhizapartnern dar, da sie während ihres gesamten Lebenszyklus auf die Übertragung von Mineralstoffen und Kohlenstoffverbindungen durch diese Pilze angewiesen sind6. Daher ist die Isolierung und Identifizierung assoziierender Pilze eine grundlegende Grundlage für die Untersuchung mykoheterotropher Lebensstrategien. Darüber hinaus ist wenig über die Rolle von Pilzendophyten in mykoheterotrophen Pflanzen oder gar über die tatsächliche Diversität dieser Pilze bekannt 7,8.
Die Untersuchung endophytischer Pilze kann mit verschiedenen Techniken durchgeführt werden, die traditionell als kulturunabhängig oder -abhängig beschrieben werden, zum Beispiel: (a) direkte Beobachtung, (b) Pilzisolierung und morphologische und/oder molekulare Identifizierung und (c) Gesamt-DNA-Extraktion von Pflanzengeweben und molekulare Identifizierung9. In direkter Beobachtung (a) können endophytische Pilze noch im Inneren von Pflanzenzellen und -geweben mittels Licht- oder Elektronenmikroskopie untersucht werden9, da verschiedene Mikroskopieprotokolle von Pena-Passos et al.10 detailliert beschrieben werden. Mit Hilfe von Isolationsmethoden (b) können pilzliche Endophyten nach ihren Kolonien, Hyphen und der Morphologie der Fortpflanzungs- oder Resistenzstruktur charakterisiert werden. Darüber hinaus ist es über Isolationstechniken möglich, die molekulare Identifizierung von Isolaten durch DNA-Extraktion, Amplifikation molekularer Identifizierungssequenzen (Barcodes oder Fingerabdrücke) und Sequenzierung durchzuführen11. Die letztgenannte Technik (c) ermöglicht die molekulare Identifizierung endophytischer Pilze mittels DNA-Extraktion im Inneren von Pflanzengeweben (Metabarcoding), gefolgt von der Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung12.
Darüber hinaus können Pilzisolate in symbiotischen Keimversuchen unter Verwendung von Samen von autotrophen oder mykoheterotrophen Orchideen eingesetzt werden. Ein Beispiel für eine solche Anwendung ist die von Sisti et al.13 durchgeführte Untersuchung, die die Keimung und die Anfangsstadien der Protokormentwicklung bei Pogoniopsis schenckii, einer mykoheterotrophen Orchidee, in Verbindung mit einigen ihrer Isolate, die nicht-mykorrhiza-endophytische Pilze enthalten, beschreibt. Das angewandte symbiotische Keimungsprotokoll wird detailliert beschrieben und in einem Video von Pena-Passos et al.10 vorgestellt. Die Isolierung von Pilzen in Assoziation mit verschiedenen Pflanzenorganen ermöglicht vielfältige Untersuchungsschwerpunkte hinsichtlich der Natur von Pflanzen-Pilz-Interaktionen (z.B. um entweder ökologische oder physiologische Aspekte der Assoziation zu verstehen, sowie Untersuchungen zum Nährstofftransfer von Pilzen auf die Pflanze)9.
Die in Abschnitt 1 vorgestellten Methoden basieren auf einer Sammlung von unterirdischen Organproben, da diese Organe die größten Schwierigkeiten bei der Entnahme aufweisen und von großem Interesse sind, da sie von Mykorrhiza-Endophyten besiedelt werden. Beide enthaltenen Protokolle (Schritte 1.1 und 1.2) können jedoch auf andere mykoheterotrophe Pflanzenorgane (z. B. Rhizome, Blütenstängel und Früchte) angewendet werden. Die in Schritt 1.1 beschriebene Entnahmemethodik ist für die Isolierung endophytischer Pilze (Abschnitt 2) zur morphologischen Charakterisierung (Abschnitte 4 und 5) und/oder die Gesamt-DNA-Extraktion zur Identifizierung von Isolaten (Abschnitt 6) vorgesehen. Andererseits ist die in Schritt 1.2 beschriebene Entnahmemethodik ausschließlich der Gesamt-DNA-Extraktion von Pflanzengeweben für Metabarcoding-Techniken zugeordnet (Abschnitt 7). In Abschnitt 3 werden vier Methoden zur Lagerung und Konservierung von Fadenpilzen vorgestellt, zwei für die kurzfristige Lagerung (3-6 Monate) und die anderen beiden für die langfristige Lagerung (>1 Jahr). Die morphologische Charakterisierung (Abschnitte 4 und 5) kann mit der molekularen Identifizierung verbunden werden, um sie zu untermauern und wichtige Informationen über die Makro- und Mikromorphologie von Pilzen zu liefern. Abbildung 1 fasst die im Folgenden beschriebenen kollektiven Methoden zusammen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65135/65135fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung der vorgestellten Methoden. Pflanzensammlung und Pilzisolierung, Konservierung und molekulare Identifizierung durch kulturabhängige und -unabhängige Methoden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65135/65135fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for materials sterilization in many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;&#160;</td>
			<td>Merck/Eppendorf</td>
			<td>5810 G</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td>(for samples collection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>75768</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR114831</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>100983</td>
			<td>It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass test tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS7082516</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>20411</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>563935</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td>(for preparing LPCB - hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactophenol blue solution (LPCB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61335</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(class I, from any company, for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for hyphae observation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MB Spin Columns</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl blue (cotton blue)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5528</td>
			<td>(for preparing LPCB - hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HS4323</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (2 mL)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR780546</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(for preservation of fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)</td>
			<td>Merck/Pyrex</td>
			<td>SLW1480/10D</td>
			<td>(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)</td>
			<td>Merck/Aldrich</td>
			<td>Z740618</td>
			<td>(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, &#947;-irradiated, non-autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)</td>
			<td>Merck/Brand</td>
			<td>BR455732</td>
			<td>(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, &#947;-irradiated, non-autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1037</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247464</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247502</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>P2182</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerBead tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid mounting medium (Entellan)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.0796</td>
			<td>(for fungi slide culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>717185</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(commercial product, for superficial desinfestation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>(for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td>(for installation of plant fragments)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoblock</td>
			<td>Merck/Eppendorf</td>
			<td>EP5362000035</td>
			<td>(or from other companies)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer and cell lyzer</td>
			<td>SPEX SamplePrep</td>
			<td></td>
			<td>2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Harleco</td>
			<td>364-M</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531</td>
			<td>(for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Solution (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1699</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unhulled rice grains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(for cryopreservation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shaped glass rod</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Sigma-Aldrich/BenchMixer</td>
			<td>BMSBV1000</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>(for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and total dna extraction to identify endophytic fungi in mycoheterotrophic plants

Mykoheterotrophe Pflanzen stellen eine der extremsten Formen der Mykorrhizaabhängigkeit dar, da sie ihre autotrophe Kapazität vollständig verloren haben. Die Pilze, mit denen diese Pflanzen eng verbunden sind, sind für sie so wichtig wie jede andere lebenswichtige Ressource. Daher sind einige der relevantesten Techniken zur Untersuchung mykoheterotropher Arten diejenigen, die die Untersuchung assoziierter Pilze ermöglichen, insbesondere solcher, die Wurzeln und unterirdische Organe bewohnen. In diesem Zusammenhang werden häufig Techniken zur Identifizierung kulturabhängiger und kulturunabhängiger endophytischer Pilze eingesetzt. Die Isolierung von Pilzendophyten bietet die Möglichkeit, sie morphologisch zu identifizieren, ihre Diversität zu analysieren und Inokula für Anwendungen in der symbiotischen Keimung von Orchideensamen zu erhalten. Es ist jedoch bekannt, dass es eine große Vielfalt von nicht kultivierbaren Pilzen gibt, die Pflanzengewebe bewohnen. Kulturunabhängige molekulare Identifizierungstechniken bieten somit eine breitere Abdeckung der Artenvielfalt und -häufigkeit. Ziel dieses Beitrags ist es, die methodische Unterstützung zu geben, die notwendig ist, um zwei Untersuchungsverfahren zu starten: ein kulturabhängiges und ein unabhängiges. In Bezug auf das kulturabhängige Protokoll werden die Prozesse der Entnahme und Pflege von Pflanzenproben von den Entnahmestellen bis hin zu Laboreinrichtungen detailliert beschrieben, zusammen mit der Isolierung filamentöser Pilze aus unterirdischen und luftigen Organen mykoheterotropher Pflanzen, der Aufbewahrung einer Sammlung von Isolaten, der morphologischen Charakterisierung von Hyphen durch Objektträgerkulturmethoden und der molekularen Identifizierung von Pilzen durch vollständige DNA-Extraktion. Zu den detaillierten Verfahren, die kulturunabhängige Methoden umfassen, gehören die Entnahme von Pflanzenproben für metagenomische Analysen und die Extraktion von Gesamt-DNA aus achlorophyllösen Pflanzenorganen mit einem kommerziellen Kit. Schließlich werden auch Kontinuitätsprotokolle (z. B. Polymerase-Kettenreaktion [PCR], Sequenzierung) für Analysen vorgeschlagen und Techniken vorgestellt.

In Anbetracht der Tatsache, dass im Isolationsprotokoll eine Kontamination durch das bei der letzten Wäsche verwendete Wasser vorliegt und die Kontamination auch in den Petrischalen mit inokulierten Fragmenten festgestellt wird, können je nach Art der Verunreinigung unterschiedliche Maßnahmen ergriffen werden (Tabelle 1). Dieser Vorgang muss von Anfang an wiederholt werden, wenn es sich um stark sporulierende Pilzverunreinigungen handelt, die auch ein beschleunigtes Wa...

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Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Der vorliegende Artikel zielt darauf ab, detaillierte und adäquate Protokolle für die Isolierung pflanzenassoziierter endophytischer Pilze, die Langzeitkonservierung von Isolaten, die morphologische Charakterisierung und die Gesamt-DNA-Extraktion für die anschließende molekulare Identifizierung und metagenomische Analyse bereitzustellen.

Isolierung, Charakterisierung und Gesamt-DNA-Extraktion zur Identifizierung endophytischer Pilze in mykoheterotrophen Pflanzen

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

Die hier vorgestellten Techniken sind nützlich, um die endophytische Pilzgemeinschaft zu untersuchen, die mit verschiedenen Pflanzenorganen assoziiert ist. Die Isolierung endophytischer Pilze ermöglicht ihre Identifizierung und ist wertvoll für andere Techniken wie die symbiotische Keimung. Bereiten Sie zunächst acht bis zehn Zentimeter langes PDA-Nährmedium Petrischalen vor, die mit drei Millilitern pro Liter Antibiotikum ergänzt werden.Prüfen Sie das Nährmedium auf Kontamination, indem Sie das Nährmedium vor der Verwendung 24 Stunden lang bei 36 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag gesunde mychoheterotrophe Pflanzenfragmente nach einem Standardverfahren oberflächlich desinfizieren und in eine sterile Petrischale legen. Um die Wirksamkeit der oberflächlichen Entwesung von Proben zu bewerten, werden einige Tropfen destilliertes Wasser geimpft, das während des letzten Waschens der Proben auf PDA verwendet wurde.Anschließend werden die Proben mit einem geflammten Skalpell und einer Pinzette in 0,2 Zentimeter dicke Stücke zerlegt. Schneiden Sie die Proben ab, um die Oberfläche zu vergrößern, die mit dem Medium in Kontakt kommen soll. Legen Sie fünf Fragmente der unterirdischen Organe so weit wie möglich auseinander in die mit Antibiotika ergänzte PDA-Platte, ohne die Schalenränder zu berühren.Verschließen Sie die Petrischalen mit Frischhaltefolie und lagern Sie sie fünf Tage lang im Dunkeln bei 25 bis 27 Grad Celsius. Bereiten Sie einen Tag vor der Subkultivierung fünf Zentimeter lange Petrischalen mit fünf bis sieben Gramm pro Liter AA-Medium vor und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 36 Grad Celsius. Um Pilzisolate zu reinigen, unterscheiden Sie die PDA-Plattenkolonien nach Farbe, Wachstumsmuster, Textur und Randformat.Begrenzen Sie dann die Kolonieränder auf der Unterseite der Schale. Identifizieren Sie die Kolonien auch mit einem Code. Entnehmen Sie mit der Spitze eines autoklavierten hölzernen Zahnstochers eine winzige Menge Myzel von den Rändern der identifizierten Pilzkolonie und streifen Sie die AA-Platte auf, so dass drei Streifen entstehen, die einen Zentimeter voneinander und von den Kanten der Schale entfernt sind.Beschriften Sie das AA-Schild mit dem entsprechenden Code mit Aufkleberpapier und Bleistift. Versiegeln Sie die Platten, bevor Sie sie drei Tage lang im Dunkeln bei 25 bis 27 Grad Celsius inkubieren. Beobachten Sie nach der Inkubation die Platten genau, um feine Hyphen zu identifizieren, die einzelne Kolonien bilden.Begrenzen Sie das Gebiet der einzelnen Völker mit einem Permanentmarker. Schneiden Sie einen Teil des Mediums, das die Kolonie enthält, mit einem autoklavierten Zahnstocher ab und übertragen Sie das Schnittvolumen ohne Antibiotika in die Mitte einer neuen PDA-Petriplatte. Nachdem Sie die Petrischalen mit den Codes der Isolate beschriftet haben, verschließen Sie sie mit Frischhaltefolie und bewahren Sie sie sieben bis 14 Tage lang im Dunkeln bei 25 bis 27 Grad Celsius auf.Um die Konservierung der Pilzisolate mit Castellanis Methode zu beginnen, geben Sie 0,5 Milliliter destilliertes Wasser in das autoklavierte zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Schneiden Sie mit einem autoklavierten Zahnstocher ein 0,5 mal 0,5 Zentimeter großes quaderförmiges Medium aus den Myzelrändern bereits gezüchteter gereinigter Isolate ab. Vier bis sechs Quader in die Mikrozentrifugenröhrchen mit destilliertem Wasser geben.Lagern Sie die Röhrchen so lange wie nötig im Dunkeln bei 25 Grad Celsius. Entnehmen Sie bei Bedarf einen Quader und legen Sie ihn in die Mitte einer neuen PDA-Schale, um ein gelagertes Isolat zu züchten. Beginnen Sie mit der Tease-Mount-Methode, indem Sie einen Tropfen eines Toluidinblau-O-Flecks auf einen sauberen Objektträger geben.Bei einer solchen Technik können verschiedene Färbungen verwendet werden. Entferne mit einem autoklavierten Zahnstocher vorsichtig einige Hyphen aus dem gewachsenen Isolat und lege sie in den Fleck. Legen Sie ein Deckglas auf und analysieren Sie es unter einem Lichtmikroskop.Für die Klebeband-Montagemethode geben Sie einen Tropfen einer Lactophenol-Baumwollblau-Beize auf einen sauberen Objektträger. Schneiden Sie einen Streifen transparentes Klebeband in einer Größe zu, die gut auf den Objektträger und den zentralen Fleckentropfen passt. Führe die klebrige Oberfläche des Klebestreifens auf die Myzeloberfläche und versuche, einige Hyphen zu sammeln, ohne zu viele davon zu drücken oder zu sammeln.Kleben Sie dann das Klebeband auf den Objektträger und stellen Sie sicher, dass der Fleck mit den gesammelten Hyphen in Kontakt kommt. Geben Sie einen Tropfen Wasser über das Klebeband und legen Sie ein Deckglas auf, bevor Sie den Objektträger unter einem Lichtmikroskop analysieren. Das Wachstum kleiner Gruppen von filamentösen Pilzmyzelien, die aus dem Inneren der Fragmente austreten, wurde nach fünftägiger Inokulation des mychoheterotrophen Pflanzenorganfragments auf dem PDA-Medium beobachtet.Während der sieben- bis 14-tägigen Inokulation des gereinigten Isolats wurde das zentrifugale Wachstum einer reinen Pilzisolatkolonie auf PDA beobachtet, die ein einziges kreisförmiges Myzel bildete. Mögliche Kontaminationen konnten leicht identifiziert werden, was die Homogenität der Kolonie in Bezug auf das Aussehen der Wachstumsform, die Farbe und die Pigmentproduktion im Medium beeinträchtigte. Eine Kolonie, die aus den fusiformen Wurzeln der mychoheterotrophen Orchidee (Wullschlaegelia aphylla) isoliert wurde, war undurchsichtig und enthielt keine diffundierbaren Pigmente oder Exsudate im Medium.Die Kolonie war auf der Oberseite weißlich bis grau und auf der Unterseite bräunlich. Die Myzelien waren luftig und reichlich vorhanden, und die Ränder waren unregelmäßig und luftig. Die Kolonie hatte eine samtige Textur und eine faltige Topographie ohne makroskopische Strukturen.Die Strukturen, die im ungefärbten Myzel nicht leicht sichtbar waren, wurden nach der Färbung des Pilzmyzels mit Lactophenol-Baumwollblau und Toluidinblau-O gezeigt, was ihre Identifizierung erleichterte. Die hier vorgestellten Methoden zur Pilzisolierung können auch auf Grünpflanzen angewendet werden, um die Pilzendophyten zu identifizieren. Die isolierten Pilze können in symbiotischen Keimversuchen eingesetzt werden.

Research

JoVE Journal

Biology

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RNA Extraktion aus Neuroprecursor Zellen unter Verwendung des Bio-Rad Total RNA Kit

Forschung

Biologie

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