Name: isolation, characterization, and total dna extraction to identify endophytic fungi in mycoheterotrophic plants
Uploaded: 2023-05-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants at JoVE.com

FAPESP(2015/26479-6)及びCNPq(447453/2014-9)からの資金提供に感謝します。JLSMは、生産性助成金(303664/2020-7)を提供してくれたCNPqに感謝します。MPPはCapes(修士号奨学金、プロセス88887.600591 / 2021-00)とCNPqに感謝します。

1. 植物サンプル採取
<ol><li>培養依存法のサンプル採取<ol><li>地下の臓器を慎重に掘ります。これらは、収集する植物の根、茎、根茎、または貯蔵器官であり得る。非常にコンパクトな土壌とは別に、これらのサンプルを手作業で収集します。 注:このステップでこてやスコップなどのツールを使用することは、菌従属栄養植物の脆弱な構造を損傷し、非内生菌による組織汚染?...

<ol>
	<li>de Azevedo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+microorganisms.">Endophytic microorganisms.</a> Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).</li><li>Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+endophytic+microbes:+endophytism+defined.">An overview of endophytic microbes: endophytism defined.</a> Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).</li><li>Schulz, B., Boyle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+Endophytes.">What are Endophytes.</a> Microbial Root Endophytes. , 1-13 (2006).</li><li>Smith, S. E., Read, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mycorrhizal Symbiosis. , (2008).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Ma, X., Kang, J., Nontachaiyapoom, S., Wen, T., Hyde, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-mycorrhizal+endophytic+fungi+from+orchids.">Non-mycorrhizal endophytic fungi from orchids.</a> Current Science. 109 (1), 72-87 (2015).</li><li>Favre-Godal, Q., Gourguillon, L., Lordel-Madeleine, S., Gindro, K., Choisy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchids+and+their+mycorrhizal+fungi:+an+insufficiently+explored+relationship.">Orchids and their mycorrhizal fungi: an insufficiently explored relationship.</a> Mycorrhiza. 30 (1), 5-22 (2020).</li><li>Sun, X., Guo, L. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+fungal+diversity:+review+of+traditional+and+molecular+techniques.">Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques.</a> Mycology. 3 (1), 65-76 (2012).</li><li>Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+techniques+for+interpreting+fungal+colonization+in+mycoheterotrophic+plants+tissues+and+symbiotic+germination+of+seeds.">Microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), e63777 (2022).</li><li>Ara&#250;jo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endophytic microorganisms: Theoretical and Practical Aspects of Isolation and Characterization. 1st ed. 1, 257 (2014).</li><li>de Souza, R. S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+bacterial+and+fungal+communities+assemblages+of+sugarcane+microbiome.">Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome.</a> Scientific Reports. 6, 28774 (2016).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Ara&#250;jo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+and+interactions+between+endophytic+bacteria+and+fungi+isolated+from+leaf+tissues+of+citrus+rootstocks.">Variability and interactions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks.</a> Canadian Journal of Microbiology. 47 (3), 229-236 (2001).</li><li>Castellani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+researches+on+the+long+viability+and+growth+of+many+pathogenic+fungi+and+some+bacteria+in+sterile+distilled+water.">Further researches on the long viability and growth of many pathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water.</a> Mycopathologia. 20 (1-2), 1-6 (1963).</li><li>Currah, R. S., Zelmer, C. D., Hambleton, S., Richardson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+from+orchid+mycorrhizas.">Fungi from orchid mycorrhizas.</a> Orchid Biology: Reviews and Perspectives, VII. , 117-170 (1997).</li><li>Freitas, E. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+mycorrhizal+Tulasnella+associated+with+epiphytic+and+rupicolous+orchids+from+the+Brazilian+Atlantic+Forest,+including+four+new+species.">Diversity of mycorrhizal Tulasnella associated with epiphytic and rupicolous orchids from the Brazilian Atlantic Forest, including four new species.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7069 (2020).</li><li>Sato, M., Inaba, S., Noguchi, M., Nakagiri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vermiculite+as+a+culture+substrate+greatly+improves+the+viability+of+frozen+cultures+of+ectomycorrhizal+basidiomycetes.">Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes.</a> Fungal Biology. 124 (8), 742-751 (2020).</li><li>Pereira, O. L., Kasuya, M. C. M., Borges, A. C., Ara&#250;jo, E. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+molecular+characterization+of+mycorrhizal+fungi+isolated+from+neotropical+orchids+in+Brazil.">Morphological and molecular characterization of mycorrhizal fungi isolated from neotropical orchids in Brazil.</a> Canadian Journal of Botany. 83 (1), 54-65 (2005).</li><li>Riddell, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+stained+mycological+preparations+obtained+by+slide+culture.">Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture.</a> Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).</li><li>Walsh, T. J., Hayden, R. T., Larone, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Larone's Medically Important Fungi: A Guide to Identification. , (2018).</li><li>Microscopy: Chemical Reagents. British Mycological Society Available from: <a target="_blank" href="https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents">https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents</a> (2022)</li><li>Senanayake, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+approaches+in+studying+fungi:+Collection,+examination,+isolation,+sporulation+and+preservation.">Morphological approaches in studying fungi: Collection, examination, isolation, sporulation and preservation.</a> Mycosphere. 11 (1), 2678-2754 (2020).</li><li>Slifkin, M., Cumbie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congo+red+as+a+fluorochrome+for+the+rapid+detection+of+fungi.">Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi.</a> Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).</li><li>Raeder, U., Broda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+DNA+from+filamentous+fungi.">Rapid preparation of DNA from filamentous fungi.</a> Letters in Applied Microbiology. 1 (1), 17-20 (1985).</li><li>Martins, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+endophytic+microorganisms.">Molecular characterization of endophytic microorganisms.</a> Endophytic microorganisms: theoretical and practical aspects of isolation and characterization. 1st edition. , 189-211 (2014).</li><li>Rayner, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mycological+Colour+Chart.">A Mycological Colour Chart.</a> Commonwealth Mycological Institute. , (1970).</li><li>Kornerup, A., Wanscher, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methuen Handbook of Colour. Methuen handbook of colour. , (1967).</li><li>Ridgway, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Color Standards and Color Nomenclature. , (1912).</li><li>McGinnis, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Handbook of Medical Mycology. , (2012).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 251-255 (2012).</li><li>Smith, D., Onions, A. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+some+preservation+techniques+for+fungi.">A comparison of some preservation techniques for fungi.</a> Transactions of the British Mycological Society. 81 (3), 535-540 (1983).</li><li>Ryan, M. J., Smith, D., Jeffries, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decision-based+key+to+determine+the+most+appropriate+protocol+for+the+preservation+of+fungi.">A decision-based key to determine the most appropriate protocol for the preservation of fungi.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16 (2), 183-186 (2000).</li><li>Lalaymia, I., Cranenbrouck, S., Declerck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+and+preservation+of+ectomycorrhizal+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi.">Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Mycorrhiza. 24 (5), 323-337 (2014).</li><li>Zettler, L. W., Corey, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhizal+fungi:+isolation+and+identification+techniques.">Orchid mycorrhizal fungi: isolation and identification techniques.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses-Methods and Protocols. , 27-59 (2018).</li><li>Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factors+affecting+the+reproducibility+of+micro-volume+DNA+mass+quantification+in+Nanodrop+2000+spectrophotometer.">The factors affecting the reproducibility of micro-volume DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer.</a> Optik. 145, 555-560 (2017).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Schoch, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+ribosomal+internal+transcribed+spacer+(ITS)+region+as+a+universal+DNA+barcode+marker+for+Fungi.">Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6241-6246 (2012).</li><li>White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+and+direct+sequencing+of+fungal+ribosomal+RNA+genes+for+phylogenetics.">Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18 (1), 315-322 (1990).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Ranjard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacterial+and+fungal+soil+communities+by+automated+ribosomal+intergenic+spacer+analysis+fingerprints:+biological+and+methodological+variability.">Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (10), 4479-4487 (2001).</li><li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+technologies-the+next+generation.">Sequencing technologies-the next generation.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (1), 31-46 (2010).</li></ol>

植物サンプルの表面的な駆除は、提示されたプロトコルの最も重要な段階の1つです。最後の洗浄からの滴でPDA皿に汚染しないことが強く望まれます。内生菌が植物組織内でも一般的であることを考慮すると、細菌は隔離皿の汚染物質として頻繁に観察され、通常は空気中の胞子形成菌よりも多くなります3,11。したがって、臓器片を設置する際の培...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

内生菌は、定義上、目立たない感染症で植物の器官や組織の内部に生息する菌類です(つまり、宿主に害を及ぼすことなく)1,2。これらの真菌は、宿主植物と中立的または有益に相互作用し、病原体や不利な環境条件に対する耐性を与え、植物にとって有益な化合物(成長因子やその他の植物ホルモンなど)の合成に寄与する可能性があります1,3。菌根内生菌は、植物と菌根の関連を確立し、栄養伝達に関与する真菌です4。ラン科では、菌根内生菌との相互作用は、大多数の種で種子の発芽、および科のすべての植物で苗の確立の基本です5。このような文脈では、菌従属栄養性のランは、菌根のパートナーに関する完全な依存の事例を表しており、ライフサイクル全体にわたってこれらの真菌によるミネラル栄養素と炭素化合物の移行に依存しています6。したがって、関連菌類の単離と同定は、菌従属栄養生物の生命戦略を研究する際の基本的な基盤となります。さらに、菌従属栄養植物における真菌エンドファイトの役割や、これらの真菌の実際の多様性についてはほとんど知られていません7,8。
内生菌類の調査は、伝統的に培養非依存性または依存性として説明されているさまざまな手法 を介して 実施できます:たとえば、(a)直接観察、(b)真菌の単離および形態学的および/または分子的同定、および(c)植物組織の全DNA抽出および分子同定9。直接観察(a)では、内生菌は、植物細胞や組織の内部にいる間に、光学顕微鏡または電子顕微鏡法9によって調査される可能性があり、さまざまな顕微鏡プロトコルがPena-Passosらによって詳述されています10。単離法(b)により、真菌エンドファイトは、そのコロニー、菌糸、および生殖または抵抗構造の形態に従って特徴付けることができます。また、単離技術 により 、DNA抽出、分子同定配列(バーコードまたは指紋)の増幅、およびシーケンシングによる単離株の分子同定を行うことが可能です11。後者の技術(c)は、植物組織の内部でDNA抽出(メタバーコーディング)を行い、その後にライブラリの調製とシーケンシングを行う12。
さらに、真菌分離株は、独立栄養または菌従属栄養性のランからの種子を使用して、共生発芽試験に適用できます。このような応用の一例は、Sistiらによって実施された調査であり13、菌従属栄養性のランである Pogoniopsis schenckiiの発芽と原生皮発生の初期段階を、非菌根性内生菌を含むその分離株のいくつかに関連して説明しています。適用された共生発芽プロトコルは、Pena-Passosらによるビデオで詳細に説明されています10。異なる植物器官と関連して真菌を単離することで、植物と真菌の相互作用の性質に関する多様な研究の焦点が可能になります(例えば、関連性の生態学的または生理学的側面のいずれかを理解するため、および真菌から植物への栄養素の移動に関する調査)9。
セクション1で提示された方法論は、地下臓器サンプルの収集に基づいており、これらの臓器は収集が最も困難であり、菌根内生菌がコロニーを形成するため、非常に興味深いものです。ただし、含まれている両方のプロトコル(ステップ1.1および1.2)は、他の菌従属栄養植物器官(例、根茎、花茎、および果実)に適用できます。ステップ1.1で説明した収集方法は、形態学的特性評価(セクション4および5)のための内生菌(セクション2)および/または分離株同定のための全DNA抽出(セクション6)に指定されています。一方、ステップ1.2で説明した収集方法は、メタバーコーディング技術(セクション7)のための植物組織の全DNA抽出にのみ割り当てられます。セクション3では、糸状菌の保存と保存のための4つの方法が提示されており、2つは短期保存(3〜6か月)に、他の2つは長期保存(>1年)に適しています。形態学的特徴付け(セクション4および5)は、それを強化し、真菌のマクロおよびミクロモルフォロジーに関する重要な情報を提供するために、分子同定と関連している可能性があります。 図 1 は、以降に説明する集合的な方法論をまとめたものです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65135/65135fig01.jpg"> 図1:提示された方法の概略図。植物の収集と真菌の分離、保存、および培養依存および非依存の方法論による分子同定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65135/65135fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for materials sterilization in many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;&#160;</td>
			<td>Merck/Eppendorf</td>
			<td>5810 G</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td>(for samples collection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>75768</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR114831</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>100983</td>
			<td>It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass test tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS7082516</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>20411</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>563935</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td>(for preparing LPCB - hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactophenol blue solution (LPCB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61335</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(class I, from any company, for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for hyphae observation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MB Spin Columns</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl blue (cotton blue)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5528</td>
			<td>(for preparing LPCB - hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HS4323</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (2 mL)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR780546</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(for preservation of fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)</td>
			<td>Merck/Pyrex</td>
			<td>SLW1480/10D</td>
			<td>(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)</td>
			<td>Merck/Aldrich</td>
			<td>Z740618</td>
			<td>(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, &#947;-irradiated, non-autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)</td>
			<td>Merck/Brand</td>
			<td>BR455732</td>
			<td>(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, &#947;-irradiated, non-autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1037</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247464</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247502</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>P2182</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerBead tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid mounting medium (Entellan)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.0796</td>
			<td>(for fungi slide culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>717185</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(commercial product, for superficial desinfestation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>(for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td>(for installation of plant fragments)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoblock</td>
			<td>Merck/Eppendorf</td>
			<td>EP5362000035</td>
			<td>(or from other companies)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer and cell lyzer</td>
			<td>SPEX SamplePrep</td>
			<td></td>
			<td>2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Harleco</td>
			<td>364-M</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531</td>
			<td>(for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Solution (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1699</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unhulled rice grains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(for cryopreservation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shaped glass rod</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Sigma-Aldrich/BenchMixer</td>
			<td>BMSBV1000</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>(for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and total dna extraction to identify endophytic fungi in mycoheterotrophic plants

菌従属栄養植物は、菌根依存の最も極端な形態の1つであり、独立栄養能力を完全に失っています。他の重要な資源と同様に、これらの植物が密接に関連している菌類は、彼らにとって不可欠です。したがって、菌従属栄養種の研究に最も関連性の高い技術のいくつかは、関連する真菌、特に根や地下器官に生息する真菌の調査を可能にするものです。これに関連して、文化依存性および培養非依存性の内生菌を同定する技術が一般的に適用される。真菌エンドファイトを単離することは、それらを形態学的に識別し、それらの多様性を分析し、ランの種子の共生発芽に応用するための接種を維持するための手段を提供します。しかし、植物組織に生息する非培養性真菌は多種多様であることが知られている。このように、培養に依存しない分子同定技術は、種の多様性と存在量をより広くカバーします。本稿は、文化依存型と独立型の2つの調査手順を開始するために必要な方法論的サポートを提供することを目的としています。培養依存性プロトコールに関しては、菌従属栄養植物の地下および空中器官からの糸状菌の単離、分離株の収集、スライド培養法による菌糸の形態学的特徴付け、および全DNA抽出による真菌の分子同定とともに、収集場所から実験室施設までの植物サンプルの収集と維持のプロセスが詳細に説明されています。培養に依存しない方法論を網羅する詳細な手順には、メタゲノム解析のための植物サンプルの収集や、市販のキットを使用したクロロフィル植物器官からの総DNA抽出が含まれます。最後に、連続性プロトコル(ポリメラーゼ連鎖反応[PCR]、シーケンシングなど)も分析に推奨されており、ここではその手法を紹介します。

分離プロトコルでは、最後の洗浄で使用した水からの汚染があり、その汚染が接種された断片を含むペトリ皿でも検出されることを考慮して、汚染物質の種類に応じて異なる措置が講じられる可能性があります(表1)。この手順は、増殖が加速する高度に胞子形成された真菌汚染物質、および選択した抗生物質に耐性のある激しく増殖する細菌の場合には?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants at JoVE.com

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

本稿では、植物関連内生菌の単離、分離株の長期保存、形態学的特性評価、およびその後の分子同定およびメタゲノム解析のための総DNA抽出のための詳細かつ適切なプロトコルを提供することを目的としています。

菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

ここで紹介する手法は、さまざまな植物器官に関連する内生菌群集を調査するのに役立ちます。内生菌の単離は、それらの同定を可能にし、共生発芽などの他の技術において貴重である。まず、1リットルあたり3ミリリットルの抗生物質を添加した8〜10センチメートルのPDA培地ペトリ皿を準備します。使用前にペトリ皿で36°Cで24時間培養して汚染を確認してください。翌日、標準的な手順で健康な菌従属栄養植物片を表面的に消毒し、滅菌ペトリ皿に入れます。サンプルの表面的な消毒の有効性を評価するには、PDAでサンプルを最後に洗浄する際に使用した数滴の蒸留水を接種します。次に、フレイムメスと鉗子を使用して、サンプルを0.2センチメートルの厚さに分割します。サンプルを切片化して、培地と接触する表面積を増幅します。抗生物質を添加したPDAプレートに、地下臓器の5つの断片を、皿の端に触れないようにできるだけ離して置きます。ペトリ皿をラップフィルムで密封し、摂氏25〜27度の暗闇で5日間保管します。継代培養の前日に、1リットルあたり5〜7グラムのAA培地を使用して5センチメートルのシャーレを調製し、プレートを摂氏36度で24時間インキュベートします。真菌分離株を精製するには、PDAプレートコロニーを色、増殖パターン、テクスチャー、およびマージンフォーマットで区別します。次に、皿の下側のコロニーの縁を区切ります。また、コロニーをコードで識別します。オートクレーブ処理した木製のつまようじの先端を使用して、同定された真菌コロニーの縁から少量の菌糸体を回収し、AAプレートに縞模様を付け、互いに1センチメートルの距離と皿の端に3つの線条を生成します。ステッカー紙と鉛筆を使用して、AAプレートに適切なコードでラベルを付けます。プレートを密封してから、摂氏25〜27度の暗闇で3日間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを注意深く観察して、個々のコロニーを形成する細かい菌糸を特定します。油性マーカーを使用して個々のコロニーの面積を区切ります。オートクレーブ滅菌したつまようじを使用してコロニーを含む培地の一部を切断し、切断した体積を抗生物質なしで新しいPDAペトリプレートの中央に移します。ペトリ皿に分離株のコードをラベル付けした後、ラップフィルムで密封し、摂氏25〜27度の暗闇で7〜14日間維持します。カステラーニ法で真菌分離株の保存を開始するには、オートクレーブ処理した2ミリリットルの微量遠心チューブに0.5ミリリットルの蒸留水を加えます。オートクレーブ滅菌したつまようじを使用して、すでに増殖した精製分離株の菌糸体縁から0.5×0.5センチメートルの直方体培地を切り取ります。蒸留水を入れた微量遠心チューブに4〜6個の直方体を置きます。チューブは、摂氏25度の暗闇で必要な限り保管してください。必要に応じて、直方体を回収し、新しいPDAディッシュの中央に置いて、保存された分離株を成長させます。トルイジンブルーO染色剤を清潔なスライドガラスに一滴垂らすことから、いじめマウント法を開始します。このような技術では、さまざまな染色を使用できます。オートクレーブ処理したつまようじを使用して、成長した分離株から菌糸を慎重に取り除き、染みの滴に入れます。カバースリップを置き、光学顕微鏡で分析します。粘着テープの取り付け方法の場合は、清潔なスライドガラスにラクトフェノール綿の青い染みを一滴垂らします。透明な粘着テープをスライドガラスに合う大きさにカットし、中央の汚れが落ちます。粘着ストリップの粘着面を菌糸体表面に向け、菌糸を押したり集めすぎたりせずに、菌糸を集めてみてください。次に、テープをスライドガラスに貼り付け、汚れが収集した菌糸に接触していることを確認します。テープの上に水滴を置き、カバースリップを置いてから、スライドを光学顕微鏡で分析します。断片の内部から出現する糸状菌菌の菌糸体の小群の成長は、PDA培地に菌従属栄養植物器官断片を接種してから5日後に観察された。精製された分離株の接種の7〜14日間に、純粋な真菌分離株コロニーの遠心増殖がPDA上で観察され、唯一の円形菌糸体を形成しました。コンタミネーションの可能性は容易に特定され、培地中での増殖形態の様相、色、および色素産生に関するコロニーの均質性が損なわれました。菌従属栄養性のラン(Wullschlaegelia aphylla)の紡錘状の根から単離されたコロニーは不透明で、培地中に拡散性の色素や滲出液はありませんでした。コロニーは上側が白っぽく灰色で、下側が茶色がかっていました。菌糸体は空中で豊富で、縁は不規則で空中でした。コロニーはビロードのような質感で、巨視的な構造のないしわだらけの地形でした。真菌の菌糸体をラクトフェノール綿青とトルイジンブルー-Oで染色すると、染色されていない菌糸体では見えにくかった構造が示され、同定が容易になりました。ここで紹介する真菌単離法は、真菌エンドファイトを同定するために緑色植物にも適用できます。単離された真菌は、共生発芽試験に使用できます。

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Bio - Rad社のTotal RNA Kitを使​​用してNeuroprecursor細胞からのRNA抽出

生物学

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

高スループットDNA抽出プレートの装填のための改変方法により、汚染の可能性を低減

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

植物の抽出物と分率から新しい抗菌分子と抗バイオフィルム分子を同定し、齲蝕を予防する体系的アプローチ

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

標的下およびタグ付け下での切断を用いた植物におけるH3K4me3修飾のプロファイリング

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

難治性物質の分解に関与する菌類の土壌生物多様性からの単離とスクリーニング

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

菌従属栄養植物組織における真菌のコロニー形成と種子の共生発芽を解釈するための顕微鏡技術

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...