Name: isolation, characterization, and total dna extraction to identify endophytic fungi in mycoheterotrophic plants
Uploaded: 2023-05-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants at JoVE.com

Мы благодарим FAPESP (2015/26479-6) и CNPq (447453/2014-9). JLSM благодарит CNPq за гранты на повышение производительности (303664/2020-7). MPP благодарит Capes (стипендия магистратуры, процесс 88887.600591/2021-00) и CNPq.

1. Отбор проб растений
<ol><li>Отбор проб для методов, зависящих от языка и региональных параметров<ol><li>Осторожно выкопайте подземные органы; Это могут быть корни, стебли, корневища или органы хранения растения, подлежащего сбору. Помимо очень плотных почв, эти пробы собирают вруч...

<ol>
	<li>de Azevedo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+microorganisms.">Endophytic microorganisms.</a> Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).</li><li>Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+endophytic+microbes:+endophytism+defined.">An overview of endophytic microbes: endophytism defined.</a> Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).</li><li>Schulz, B., Boyle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+Endophytes.">What are Endophytes.</a> Microbial Root Endophytes. , 1-13 (2006).</li><li>Smith, S. E., Read, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mycorrhizal Symbiosis. , (2008).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Ma, X., Kang, J., Nontachaiyapoom, S., Wen, T., Hyde, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-mycorrhizal+endophytic+fungi+from+orchids.">Non-mycorrhizal endophytic fungi from orchids.</a> Current Science. 109 (1), 72-87 (2015).</li><li>Favre-Godal, Q., Gourguillon, L., Lordel-Madeleine, S., Gindro, K., Choisy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchids+and+their+mycorrhizal+fungi:+an+insufficiently+explored+relationship.">Orchids and their mycorrhizal fungi: an insufficiently explored relationship.</a> Mycorrhiza. 30 (1), 5-22 (2020).</li><li>Sun, X., Guo, L. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+fungal+diversity:+review+of+traditional+and+molecular+techniques.">Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques.</a> Mycology. 3 (1), 65-76 (2012).</li><li>Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+techniques+for+interpreting+fungal+colonization+in+mycoheterotrophic+plants+tissues+and+symbiotic+germination+of+seeds.">Microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), e63777 (2022).</li><li>Ara&#250;jo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endophytic microorganisms: Theoretical and Practical Aspects of Isolation and Characterization. 1st ed. 1, 257 (2014).</li><li>de Souza, R. S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+bacterial+and+fungal+communities+assemblages+of+sugarcane+microbiome.">Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome.</a> Scientific Reports. 6, 28774 (2016).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Ara&#250;jo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+and+interactions+between+endophytic+bacteria+and+fungi+isolated+from+leaf+tissues+of+citrus+rootstocks.">Variability and interactions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks.</a> Canadian Journal of Microbiology. 47 (3), 229-236 (2001).</li><li>Castellani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+researches+on+the+long+viability+and+growth+of+many+pathogenic+fungi+and+some+bacteria+in+sterile+distilled+water.">Further researches on the long viability and growth of many pathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water.</a> Mycopathologia. 20 (1-2), 1-6 (1963).</li><li>Currah, R. S., Zelmer, C. D., Hambleton, S., Richardson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+from+orchid+mycorrhizas.">Fungi from orchid mycorrhizas.</a> Orchid Biology: Reviews and Perspectives, VII. , 117-170 (1997).</li><li>Freitas, E. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+mycorrhizal+Tulasnella+associated+with+epiphytic+and+rupicolous+orchids+from+the+Brazilian+Atlantic+Forest,+including+four+new+species.">Diversity of mycorrhizal Tulasnella associated with epiphytic and rupicolous orchids from the Brazilian Atlantic Forest, including four new species.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7069 (2020).</li><li>Sato, M., Inaba, S., Noguchi, M., Nakagiri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vermiculite+as+a+culture+substrate+greatly+improves+the+viability+of+frozen+cultures+of+ectomycorrhizal+basidiomycetes.">Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes.</a> Fungal Biology. 124 (8), 742-751 (2020).</li><li>Pereira, O. L., Kasuya, M. C. M., Borges, A. C., Ara&#250;jo, E. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+molecular+characterization+of+mycorrhizal+fungi+isolated+from+neotropical+orchids+in+Brazil.">Morphological and molecular characterization of mycorrhizal fungi isolated from neotropical orchids in Brazil.</a> Canadian Journal of Botany. 83 (1), 54-65 (2005).</li><li>Riddell, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+stained+mycological+preparations+obtained+by+slide+culture.">Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture.</a> Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).</li><li>Walsh, T. J., Hayden, R. T., Larone, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Larone's Medically Important Fungi: A Guide to Identification. , (2018).</li><li>Microscopy: Chemical Reagents. British Mycological Society Available from: <a target="_blank" href="https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents">https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents</a> (2022)</li><li>Senanayake, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+approaches+in+studying+fungi:+Collection,+examination,+isolation,+sporulation+and+preservation.">Morphological approaches in studying fungi: Collection, examination, isolation, sporulation and preservation.</a> Mycosphere. 11 (1), 2678-2754 (2020).</li><li>Slifkin, M., Cumbie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congo+red+as+a+fluorochrome+for+the+rapid+detection+of+fungi.">Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi.</a> Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).</li><li>Raeder, U., Broda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+DNA+from+filamentous+fungi.">Rapid preparation of DNA from filamentous fungi.</a> Letters in Applied Microbiology. 1 (1), 17-20 (1985).</li><li>Martins, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+endophytic+microorganisms.">Molecular characterization of endophytic microorganisms.</a> Endophytic microorganisms: theoretical and practical aspects of isolation and characterization. 1st edition. , 189-211 (2014).</li><li>Rayner, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mycological+Colour+Chart.">A Mycological Colour Chart.</a> Commonwealth Mycological Institute. , (1970).</li><li>Kornerup, A., Wanscher, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methuen Handbook of Colour. Methuen handbook of colour. , (1967).</li><li>Ridgway, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Color Standards and Color Nomenclature. , (1912).</li><li>McGinnis, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Handbook of Medical Mycology. , (2012).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 251-255 (2012).</li><li>Smith, D., Onions, A. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+some+preservation+techniques+for+fungi.">A comparison of some preservation techniques for fungi.</a> Transactions of the British Mycological Society. 81 (3), 535-540 (1983).</li><li>Ryan, M. J., Smith, D., Jeffries, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decision-based+key+to+determine+the+most+appropriate+protocol+for+the+preservation+of+fungi.">A decision-based key to determine the most appropriate protocol for the preservation of fungi.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16 (2), 183-186 (2000).</li><li>Lalaymia, I., Cranenbrouck, S., Declerck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+and+preservation+of+ectomycorrhizal+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi.">Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Mycorrhiza. 24 (5), 323-337 (2014).</li><li>Zettler, L. W., Corey, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhizal+fungi:+isolation+and+identification+techniques.">Orchid mycorrhizal fungi: isolation and identification techniques.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses-Methods and Protocols. , 27-59 (2018).</li><li>Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factors+affecting+the+reproducibility+of+micro-volume+DNA+mass+quantification+in+Nanodrop+2000+spectrophotometer.">The factors affecting the reproducibility of micro-volume DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer.</a> Optik. 145, 555-560 (2017).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Schoch, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+ribosomal+internal+transcribed+spacer+(ITS)+region+as+a+universal+DNA+barcode+marker+for+Fungi.">Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6241-6246 (2012).</li><li>White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+and+direct+sequencing+of+fungal+ribosomal+RNA+genes+for+phylogenetics.">Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18 (1), 315-322 (1990).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Ranjard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacterial+and+fungal+soil+communities+by+automated+ribosomal+intergenic+spacer+analysis+fingerprints:+biological+and+methodological+variability.">Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (10), 4479-4487 (2001).</li><li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+technologies-the+next+generation.">Sequencing technologies-the next generation.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (1), 31-46 (2010).</li></ol>

Поверхностная дезинсекция образцов растений является одним из наиболее ответственных этапов в представленном протоколе. Крайне желательно отсутствие загрязнений в посуде КПК каплями от последней стирки. Бактерии часто наблюдаются в качестве загрязняющих веществ в изоляционных чаш?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Эндофитные грибы – это, по определению, те, которые обитают внутри органов и тканей растений при незаметных инфекциях (т.е. не причиняя вреда своему хозяину)1,2. Эти грибы могут нейтрально или благотворно взаимодействовать с растениями-хозяевами, могут обеспечивать устойчивость к патогенам и неблагоприятным условиям окружающей среды, а также могут способствовать синтезу полезных для растения соединений (например, факторов роста и других фитогормонов)1,3. Микоризные эндофиты – это грибы, которые устанавливают микоризные ассоциации с растением, принимая участие в переносе питательных веществ4. У Orchidaceae взаимодействие с микоризными эндофитами имеет основополагающее значение для прорастания семян у подавляющего большинства видов и укоренения проростков у всех растений семейства5. В таких условиях микогетеротрофные орхидеи представляют собой случай полной зависимости от своих микоризных партнеров, поскольку они зависят от переноса минеральных питательных веществ и углеродных соединений этими грибами в течение всего своегожизненного цикла. Поэтому выделение и идентификация ассоциативных грибов является фундаментальной базой при исследовании микогетеротрофных жизненных стратегий. Более того, мало что известно о роли грибных эндофитов в микогетеротрофных растениях или даже о реальном разнообразии этих грибов 7,8.
Исследование эндофитных грибов может проводиться с помощью различных методов, традиционно описываемых как независимые от культуры или зависимые, например: (а) прямое наблюдение, (б) выделение грибов и морфологическая и/или молекулярная идентификация, и (в) полная экстракция ДНК растительных тканей и молекулярная идентификация9. При непосредственном наблюдении (а) эндофитные грибы могут быть исследованы еще в недрах растительных клеток и тканей с помощью световой или электронной микроскопии9, поскольку различные протоколы микроскопии подробно описаны Pena-Passos et al.10. С помощью методов выделения (b) эндофиты грибов могут быть охарактеризованы в соответствии с их колониями, гифами и морфологией репродуктивной структуры или структуры резистентности. Кроме того, с помощью методов выделения можно проводить молекулярную идентификацию изолятов путем экстракции ДНК, амплификации молекулярных идентификационных последовательностей (штрих-кодов или отпечатков пальцев) и секвенирования11. Последний метод (c) позволяет проводить молекулярную идентификацию эндофитных грибов с помощью экстракции ДНК во внутренней части растительных тканей (метабаркодирование) с последующей подготовкой библиотеки и секвенированием12.
Кроме того, грибные изоляты могут быть применены в симбиотических испытаниях проращивания с использованием семян автотрофных или микогетеротрофных орхидей. Примером такого применения является исследование, проведенное Sisti et al.13, описывающее прорастание и начальные стадии развития протокорма у микогетеротрофной орхидеи Pogoniopsis schenckii в ассоциации с некоторыми из ее изолятов, включающих немикоризные эндофитные грибы. Применяемый протокол проращивания симбиоза подробно описан и представлен в видео Pena-Passos et al.10. Выделение грибов в ассоциации с различными органами растений позволяет по-разному исследовать природу взаимодействия растений и грибов (например, понять экологические или физиологические аспекты ассоциации, а также исследовать перенос питательных веществ от грибов к растению)9.
Методики, представленные в разделе 1, основаны на сборе образцов подземных органов, поскольку эти органы представляют наибольшие трудности при сборе и представляют большой интерес, поскольку их колонизируют микоризные эндофиты. Тем не менее, оба включенных протокола (шаги 1.1 и 1.2) могут быть применены к другим микогетеротрофным органам растений (например, корневищам, цветочным стеблям и плодам). Методика сбора, описанная на шаге 1.1, предназначена для выделения эндофитных грибов (раздел 2) для морфологической характеристики (разделы 4 и 5) и/или выделения общей ДНК для идентификации изолятов (раздел 6). С другой стороны, методология сбора, описанная в шаге 1.2, предназначена исключительно для тотальной экстракции ДНК растительных тканей для методов метабаркодирования (раздел 7). В разделе 3 представлены четыре способа хранения и консервации нитчатых грибов: два для кратковременного хранения (3-6 месяцев) и два других для длительного хранения (>1 год). Морфологическая характеристика (разделы 4 и 5) может быть связана с молекулярной идентификацией для ее усиления и получения важной информации о макро- и микроморфологии грибов. На рисунке 1 обобщены коллективные методологии, описанные ниже.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65135/65135fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематическое обобщение представленных методов. Сбор растений и выделение, консервация и молекулярная идентификация растений с помощью культурно-зависимых и независимых методологий. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65135/65135fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for materials sterilization in many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;&#160;</td>
			<td>Merck/Eppendorf</td>
			<td>5810 G</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td>(for samples collection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>75768</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR114831</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>100983</td>
			<td>It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass test tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS7082516</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>20411</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>563935</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td>(for preparing LPCB - hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactophenol blue solution (LPCB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61335</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(class I, from any company, for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for hyphae observation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MB Spin Columns</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl blue (cotton blue)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5528</td>
			<td>(for preparing LPCB - hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HS4323</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (2 mL)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR780546</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(for preservation of fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)</td>
			<td>Merck/Pyrex</td>
			<td>SLW1480/10D</td>
			<td>(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)</td>
			<td>Merck/Aldrich</td>
			<td>Z740618</td>
			<td>(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, &#947;-irradiated, non-autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)</td>
			<td>Merck/Brand</td>
			<td>BR455732</td>
			<td>(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, &#947;-irradiated, non-autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1037</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247464</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247502</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>P2182</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerBead tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid mounting medium (Entellan)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.0796</td>
			<td>(for fungi slide culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>717185</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(commercial product, for superficial desinfestation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>(for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td>(for installation of plant fragments)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoblock</td>
			<td>Merck/Eppendorf</td>
			<td>EP5362000035</td>
			<td>(or from other companies)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer and cell lyzer</td>
			<td>SPEX SamplePrep</td>
			<td></td>
			<td>2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Harleco</td>
			<td>364-M</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531</td>
			<td>(for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Solution (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1699</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unhulled rice grains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(for cryopreservation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shaped glass rod</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Sigma-Aldrich/BenchMixer</td>
			<td>BMSBV1000</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>(for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and total dna extraction to identify endophytic fungi in mycoheterotrophic plants

Микогетеротрофные растения представляют собой одну из самых крайних форм микоризной зависимости, полностью утратив свою автотрофную способность. Так же важны, как и любой другой жизненно важный ресурс, грибы, с которыми эти растения тесно связаны, необходимы для них. Таким образом, некоторые из наиболее актуальных методов в изучении микогетеротрофных видов позволяют исследовать ассоциированные грибы, особенно те, которые обитают в корнях и подземных органах. В этом контексте обычно применяются методы идентификации культурально-зависимых и культурально-независимых эндофитных грибов. Изоляция эндофитов грибов обеспечивает средства для их морфологической идентификации, анализа их разнообразия и сохранения инокулатуры для применения в симбиотическом проращивании семян орхидей. Однако известно, что существует большое разнообразие некультивируемых грибов, населяющих ткани растений. Таким образом, методы молекулярной идентификации, не зависящие от культуры, обеспечивают более широкий охват видового разнообразия и численности. Целью данной статьи является методологическое сопровождение, необходимое для запуска двух процедур исследования: культурно-зависимой и независимой. Что касается культурально-зависимого протокола, то подробно описаны процессы сбора и хранения образцов растений от мест сбора до лабораторных помещений, а также выделение нитчатых грибов из подземных и надземных органов микогетеротрофных растений, ведение коллекции изолятов, морфологически охарактеризовать гифы методом культивирования на предметных стеклах и молекулярная идентификация грибов методом тотальной экстракции ДНК. Детальные процедуры, включающие в себя независимые от культуры методики, включают сбор образцов растений для метагеномного анализа и извлечение общей ДНК из органов ахлорофилловых растений с использованием коммерческого набора. Наконец, протоколы непрерывности (например, полимеразная цепная реакция [ПЦР], секвенирование) также предлагаются для анализа, и здесь представлены методы.

В протоколе изоляции, учитывая наличие загрязнения от воды, использованной при последней промывке, а также обнаружение загрязнения в чашках Петри с инокулированными фрагментами, могут быть предприняты различные действия в зависимости от типа загрязняющего вещества ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants at JoVE.com

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Целью настоящей статьи является предоставление подробных и адекватных протоколов выделения растительно-ассоциированных эндофитных грибов, долговременной консервации изолятов, морфологической характеристики и экстракции общей ДНК для последующей молекулярной идентификации и метагеномного анализа.

Выделение, характеристика и выделение общей ДНК для идентификации эндофитных грибов в микогетеротрофных растениях

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

Методы, представленные здесь, полезны для изучения сообщества эндофитных грибов, ассоциированных с различными органами растений. Выделение эндофитных грибов позволяет их идентифицировать, а также ценно при других методах, таких как симбиотическое проращивание. Для начала приготовьте от восьми до 10 сантиметров питательной среды КПК чашки Петри, дополненные тремя миллилитрами на литр антибиотика.Проверьте наличие загрязнения, инкубируя питательную среду в чашках Петри при температуре 36 градусов Цельсия в течение 24 часов перед использованием. На следующий день поверхностно дезинфицируют здоровые михогетеротрофные фрагменты растений по стандартной процедуре и помещают их в стерильную чашку Петри. Для оценки эффективности поверхностной дезинсекции образцов посев нескольких капель дистиллированной воды, использованной во время последней промывки образцов на КПК.Затем с помощью пламенного скальпеля и щипцов разделите образцы на кусочки толщиной 0,2 сантиметра. Разделите образцы, чтобы увеличить площадь поверхности, контактирующей со средой. Поместите пять фрагментов подземных органов в планшет с ОАП с антибиотиком как можно дальше друг от друга, не касаясь краев чашки.Запечатайте чашки Петри пищевой пленкой и храните их в темноте при температуре от 25 до 27 градусов Цельсия в течение пяти дней. За сутки до субкультивирования приготовьте пятисантиметровые чашки Петри, используя пять-семь граммов на литр АА-среды, и инкубируйте пластины при температуре 36 градусов Цельсия в течение 24 часов. Чтобы очистить грибковые изоляты, дифференцируйте колонии пластин PDA по цвету, характеру роста, текстуре и формату краев.Затем разграничите края колоний на нижней стороне посуды. Также идентифицируйте колонии с помощью кода. Используя кончик автоклавной деревянной зубочистки, извлеките небольшое количество мицелия из краев идентифицированной грибковой колонии и исчеркните пластину AA, образовав три полосы на расстоянии одного сантиметра друг от друга и краев чашки.Наклейте на табличку АА соответствующий код с помощью бумаги для наклеек и карандаша. Перед инкубацией в темноте запечатайте пластины при температуре от 25 до 27 градусов Цельсия в течение трех дней. После инкубации внимательно наблюдайте за пластинами, чтобы выявить тонкие гифы, образующие отдельные колонии.Разграничьте площадь отдельных колоний с помощью перманентного маркера. Отрежьте часть среды, содержащей колонию, с помощью автоклавной зубочистки, и перенесите срезанный объем в центр новой планшета Петри КПК без антибиотиков. После маркировки чашек Петри кодами изолятов запечатайте их пищевой пленкой и выдержите в темноте при температуре от 25 до 27 градусов Цельсия в течение семи-14 дней.Чтобы начать консервацию грибковых изолятов по методу Кастеллани, добавьте 0,5 миллилитра дистиллированной воды в автоклавную двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. С помощью автоклавной зубочистки срежьте 0,5 на 0,5 сантиметра кубовидную среду от краев мицелия уже выращенных очищенных изолятов. Поместите от четырех до шести кубоидов в пробирки микроцентрифуги с дистиллированной водой.Храните пробирки в темноте при температуре 25 градусов Цельсия столько, сколько потребуется. При необходимости восстановите кубоид и поместите его в центр новой чашки КПК, чтобы вырастить хранящийся изолят. Начните метод дразнящего монтажа, поместив каплю пятна Toluidine blue-O на чистое предметное стекло.В такой технике можно использовать разные морилки. С помощью автоклавной зубочистки аккуратно удалите несколько гиф из выращенного изолята, и поместите их в каплю пятна. Поместите обложку и проанализируйте ее под световым микроскопом.Для способа крепления клейкой лентой поместите каплю лактофеноловой хлопковой синей морилки на чистое предметное стекло. Отрежьте полоску прозрачной клейкой ленты по размеру, который подходит к предметному стеклу и центральному пятну хорошо капли. Направьте липкую поверхность клейкой полоски на поверхность мицелия и попытайтесь собрать несколько гиф, не нажимая и не собирая их слишком много.Затем приклейте ленту к предметному стеклу, убедившись, что пятно соприкасается с собранными гифами. Поместите каплю воды на ленту и поместите покровный листок, прежде чем анализировать предметное стекло под световым микроскопом. Рост небольших групп мицелия нитчатых грибов, выходящих из внутренней части фрагментов, наблюдался после пятидневного посева михогетеротрофного фрагмента органа растения на среду ФДА.В течение 7-14 дней инокуляции очищенного изолята на КПК наблюдался центробежный рост чистой колонии грибного изолята, образующей единственный кольцевой мицелий. Возможные загрязнения были легко идентифицированы, что нарушало однородность колонии в отношении формы роста, цвета и продукции пигмента в среде. Колония, выделенная из веретенообразных корней михогетеротрофной орхидеи Wullschlaegelia aphylla, была непрозрачной, без диффузных пигментов или экссудата в среде.Колония была от беловатой до серой с верхней стороны и буроватой с нижней. Мицелий был воздушным и обильным, а края неправильными и воздушными. Колония имела бархатистую текстуру и морщинистый рельеф без макроскопических структур.Структуры, которые были плохо видны в неокрашенном мицелии, были обнаружены после окрашивания мицелия гриба лактофенолом хлопковым синим и толуидином синим-О, что облегчало их идентификацию. Представленные здесь методы выделения грибов могут быть применены и к зеленым растениям для идентификации эндофитов грибов. Изолированные грибы могут быть использованы в симбиотических испытаниях по проращиванию.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

РНК Извлечение из Neuroprecursor ячеек с использованием Bio-Rad Всего РНК Kit

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды<em&gt; В пробирке</em&gt;, Чтобы определить Поступательное сайтов Пауза Наряду мРНК

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Модифицированные методы загрузки высокой пропускной способности пластин извлечения ДНК снижают потенциал загрязнения

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

Систематический подход к выявлению новых противомикробных и антибиопленных молекул из экстрактов растений и фракций для предотвращения кариеса зубов

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Профилирование модификации H3K4me3 в растениях с использованием расщепления под мишенями и меткой

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Выделение и характеристика интактной фикобилисомы в цианобактериях

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

Изоляция и скрининг из биоразнообразия почв на грибы, участвующие в деградации непокорных материалов

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Методы микроскопии для интерпретации грибковой колонизации в микогетеротрофных тканях растений и симбиотической прорастания семян

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...