Name: isolation, characterization, and total dna extraction to identify endophytic fungi in mycoheterotrophic plants
Uploaded: 2023-05-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants at JoVE.com

Agradecemos el financiamiento de la FAPESP (2015/26479-6) y del CNPq (447453/2014-9). JLSM agradece al CNPq por las becas de productividad (303664/2020-7). El MPP agradece a la Capes (beca de maestría, proceso 88887.600591/2021-00) y al CNPq.

1. Recogida de muestras de plantas
<ol><li>Recopilación de muestras para métodos dependientes de la referencia cultural<ol><li>Excava cuidadosamente los órganos subterráneos; Estos pueden ser raíces, tallos, rizomas u órganos de almacenamiento de la planta que se va a recolectar. Aparte de los suelos muy compactos, recoja estas muestras a mano. NOTA: El uso de herramientas como llanas o cucharas en este paso es desaconsejable, ya que puede dañar las estructuras frágiles de las plantas micohe...

<ol>
	<li>de Azevedo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+microorganisms.">Endophytic microorganisms.</a> Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).</li><li>Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+endophytic+microbes:+endophytism+defined.">An overview of endophytic microbes: endophytism defined.</a> Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).</li><li>Schulz, B., Boyle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+Endophytes.">What are Endophytes.</a> Microbial Root Endophytes. , 1-13 (2006).</li><li>Smith, S. E., Read, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mycorrhizal Symbiosis. , (2008).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Ma, X., Kang, J., Nontachaiyapoom, S., Wen, T., Hyde, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-mycorrhizal+endophytic+fungi+from+orchids.">Non-mycorrhizal endophytic fungi from orchids.</a> Current Science. 109 (1), 72-87 (2015).</li><li>Favre-Godal, Q., Gourguillon, L., Lordel-Madeleine, S., Gindro, K., Choisy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchids+and+their+mycorrhizal+fungi:+an+insufficiently+explored+relationship.">Orchids and their mycorrhizal fungi: an insufficiently explored relationship.</a> Mycorrhiza. 30 (1), 5-22 (2020).</li><li>Sun, X., Guo, L. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+fungal+diversity:+review+of+traditional+and+molecular+techniques.">Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques.</a> Mycology. 3 (1), 65-76 (2012).</li><li>Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+techniques+for+interpreting+fungal+colonization+in+mycoheterotrophic+plants+tissues+and+symbiotic+germination+of+seeds.">Microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), e63777 (2022).</li><li>Ara&#250;jo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endophytic microorganisms: Theoretical and Practical Aspects of Isolation and Characterization. 1st ed. 1, 257 (2014).</li><li>de Souza, R. S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+bacterial+and+fungal+communities+assemblages+of+sugarcane+microbiome.">Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome.</a> Scientific Reports. 6, 28774 (2016).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Ara&#250;jo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+and+interactions+between+endophytic+bacteria+and+fungi+isolated+from+leaf+tissues+of+citrus+rootstocks.">Variability and interactions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks.</a> Canadian Journal of Microbiology. 47 (3), 229-236 (2001).</li><li>Castellani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+researches+on+the+long+viability+and+growth+of+many+pathogenic+fungi+and+some+bacteria+in+sterile+distilled+water.">Further researches on the long viability and growth of many pathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water.</a> Mycopathologia. 20 (1-2), 1-6 (1963).</li><li>Currah, R. S., Zelmer, C. D., Hambleton, S., Richardson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+from+orchid+mycorrhizas.">Fungi from orchid mycorrhizas.</a> Orchid Biology: Reviews and Perspectives, VII. , 117-170 (1997).</li><li>Freitas, E. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+mycorrhizal+Tulasnella+associated+with+epiphytic+and+rupicolous+orchids+from+the+Brazilian+Atlantic+Forest,+including+four+new+species.">Diversity of mycorrhizal Tulasnella associated with epiphytic and rupicolous orchids from the Brazilian Atlantic Forest, including four new species.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7069 (2020).</li><li>Sato, M., Inaba, S., Noguchi, M., Nakagiri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vermiculite+as+a+culture+substrate+greatly+improves+the+viability+of+frozen+cultures+of+ectomycorrhizal+basidiomycetes.">Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes.</a> Fungal Biology. 124 (8), 742-751 (2020).</li><li>Pereira, O. L., Kasuya, M. C. M., Borges, A. C., Ara&#250;jo, E. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+molecular+characterization+of+mycorrhizal+fungi+isolated+from+neotropical+orchids+in+Brazil.">Morphological and molecular characterization of mycorrhizal fungi isolated from neotropical orchids in Brazil.</a> Canadian Journal of Botany. 83 (1), 54-65 (2005).</li><li>Riddell, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+stained+mycological+preparations+obtained+by+slide+culture.">Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture.</a> Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).</li><li>Walsh, T. J., Hayden, R. T., Larone, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Larone's Medically Important Fungi: A Guide to Identification. , (2018).</li><li>Microscopy: Chemical Reagents. British Mycological Society Available from: <a target="_blank" href="https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents">https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents</a> (2022)</li><li>Senanayake, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+approaches+in+studying+fungi:+Collection,+examination,+isolation,+sporulation+and+preservation.">Morphological approaches in studying fungi: Collection, examination, isolation, sporulation and preservation.</a> Mycosphere. 11 (1), 2678-2754 (2020).</li><li>Slifkin, M., Cumbie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congo+red+as+a+fluorochrome+for+the+rapid+detection+of+fungi.">Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi.</a> Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).</li><li>Raeder, U., Broda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+DNA+from+filamentous+fungi.">Rapid preparation of DNA from filamentous fungi.</a> Letters in Applied Microbiology. 1 (1), 17-20 (1985).</li><li>Martins, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+endophytic+microorganisms.">Molecular characterization of endophytic microorganisms.</a> Endophytic microorganisms: theoretical and practical aspects of isolation and characterization. 1st edition. , 189-211 (2014).</li><li>Rayner, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mycological+Colour+Chart.">A Mycological Colour Chart.</a> Commonwealth Mycological Institute. , (1970).</li><li>Kornerup, A., Wanscher, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methuen Handbook of Colour. Methuen handbook of colour. , (1967).</li><li>Ridgway, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Color Standards and Color Nomenclature. , (1912).</li><li>McGinnis, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Handbook of Medical Mycology. , (2012).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 251-255 (2012).</li><li>Smith, D., Onions, A. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+some+preservation+techniques+for+fungi.">A comparison of some preservation techniques for fungi.</a> Transactions of the British Mycological Society. 81 (3), 535-540 (1983).</li><li>Ryan, M. J., Smith, D., Jeffries, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decision-based+key+to+determine+the+most+appropriate+protocol+for+the+preservation+of+fungi.">A decision-based key to determine the most appropriate protocol for the preservation of fungi.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16 (2), 183-186 (2000).</li><li>Lalaymia, I., Cranenbrouck, S., Declerck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+and+preservation+of+ectomycorrhizal+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi.">Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Mycorrhiza. 24 (5), 323-337 (2014).</li><li>Zettler, L. W., Corey, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhizal+fungi:+isolation+and+identification+techniques.">Orchid mycorrhizal fungi: isolation and identification techniques.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses-Methods and Protocols. , 27-59 (2018).</li><li>Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+factors+affecting+the+reproducibility+of+micro-volume+DNA+mass+quantification+in+Nanodrop+2000+spectrophotometer.">The factors affecting the reproducibility of micro-volume DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer.</a> Optik. 145, 555-560 (2017).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Schoch, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+ribosomal+internal+transcribed+spacer+(ITS)+region+as+a+universal+DNA+barcode+marker+for+Fungi.">Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6241-6246 (2012).</li><li>White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+and+direct+sequencing+of+fungal+ribosomal+RNA+genes+for+phylogenetics.">Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18 (1), 315-322 (1990).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Ranjard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacterial+and+fungal+soil+communities+by+automated+ribosomal+intergenic+spacer+analysis+fingerprints:+biological+and+methodological+variability.">Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (10), 4479-4487 (2001).</li><li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+technologies-the+next+generation.">Sequencing technologies-the next generation.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (1), 31-46 (2010).</li></ol>

La desinfestación superficial de muestras de plantas es una de las etapas más críticas en el protocolo presentado. Es muy deseable que no se contaminen las antenas PDA con gotas del último lavado. Las bacterias se observan con frecuencia como contaminantes en las placas de aislamiento, generalmente más que los hongos esporulantes en el aire, considerando que las bacterias endófitas también son comunes dentro de los tejidos vegetales 3,11. Por lo tanto, la ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Los hongos endófitos son, por definición, aquellos que habitan en el interior de los órganos y tejidos de las plantas en infecciones discretas (es decir, sin causar daño a su huésped)1,2. Estos hongos pueden interactuar de forma neutra o beneficiosa con las plantas hospederas, pueden conferir resistencia a patógenos y condiciones ambientales desfavorables, y pueden contribuir a la síntesis de compuestos beneficiosos para la planta (por ejemplo, factores de crecimiento y otras fitohormonas)1,3. Los endófitos micorrícicos son hongos que establecen asociaciones micorrícicas con la planta, participando en la transferencia de nutrientes4. En Orchidaceae, la interacción con endófitos micorrícicos es fundamental para la germinación de semillas en la gran mayoría de las especies, y el establecimiento de plántulas en todas las plantas de la familia5. En tales contextos, las orquídeas micoheterótrofas representan un caso de dependencia total con respecto a sus socios micorrícicos, ya que dependen de la transferencia de nutrientes minerales y compuestos de carbono por parte de estos hongos durante todo su ciclo de vida6. Por lo tanto, el aislamiento e identificación de hongos asociados es una base fundamental a la hora de investigar estrategias de vida micoheterótrofas. Además, poco se sabe sobre el papel de los endófitos fúngicos en las plantas micoheterótrofas o incluso la diversidad real de estos hongos 7,8.
La investigación de hongos endófitos puede llevarse a cabo mediante diferentes técnicas, tradicionalmente descritas como independientes o dependientes del cultivo, por ejemplo: (a) observación directa, (b) aislamiento de hongos e identificación morfológica y/o molecular, y (c) extracción total de ADN de tejidos vegetales e identificación molecular9. En observación directa (a), los hongos endófitos pueden ser investigados mientras aún se encuentran en el interior de células y tejidos vegetales mediante microscopía óptica o electrónica9, ya que los diferentes protocolos de microscopía son detallados por Peña-Passos et al.10. Mediante métodos de aislamiento (b), los endófitos fúngicos pueden caracterizarse de acuerdo con sus colonias, hifas y morfología de la estructura reproductiva o de resistencia. Además, a través de técnicas de aislamiento, es posible llevar a cabo la identificación molecular de aislados a través de la extracción de ADN, la amplificación de secuencias de identificación molecular (códigos de barras o huellas dactilares) y la secuenciación11. Esta última técnica (c) permite la identificación molecular de hongos endófitos mediante la extracción de ADN en el interior de los tejidos vegetales (metacódigo de barras), seguida de la preparación y secuenciación de la biblioteca12.
Además, los aislados de hongos pueden aplicarse en ensayos de germinación simbiótica, utilizando semillas de orquídeas autótrofas o micoheterótrofas. Un ejemplo de esta aplicación es la investigación realizada por Sisti et al.13, describiendo la germinación y las etapas iniciales del desarrollo de protocormos en Pogoniopsis schenckii, una orquídea micoheterótrofa, en asociación con algunos de sus aislados, que comprenden hongos endófitos no micorrícicos. El protocolo de germinación simbiótica aplicado se detalla y presenta en un video de Pena-Passos et al.10. El aislamiento de hongos en asociación con diferentes órganos de la planta permite diversos enfoques de investigación con respecto a la naturaleza de las interacciones planta-hongo (por ejemplo, para comprender los aspectos ecológicos o fisiológicos de la asociación, así como indagaciones sobre la transferencia de nutrientes de los hongos a la planta)9.
Las metodologías presentadas en la sección 1 se basan en la recolección de muestras de órganos subterráneos, ya que estos órganos presentan más dificultades en la recolección, y son de gran interés ya que los endófitos micorrícicos los colonizan. Sin embargo, ambos protocolos incluidos (pasos 1.1 y 1.2) pueden aplicarse a otros órganos de plantas micoheterótrofas (p. ej., rizomas, tallos florales y frutos). La metodología de recolección descrita en el paso 1.1 está diseñada para aislar hongos endófitos (sección 2), para la caracterización morfológica (secciones 4 y 5) y/o la extracción total de ADN para la identificación aislada (sección 6). Por otro lado, la metodología de recolección descrita en el paso 1.2 se asigna exclusivamente a la extracción de ADN total de tejidos vegetales para técnicas de metabarcoding (sección 7). En la sección 3 se presentan cuatro métodos de almacenamiento y conservación de hongos filamentosos, dos para el almacenamiento a corto plazo (3-6 meses) y los otros dos adecuados para el almacenamiento a largo plazo (>1 año). La caracterización morfológica (secciones 4 y 5) puede asociarse con la identificación molecular para reforzarla y proporcionar información importante sobre la macro y micromorfología fúngica. En la Figura 1 se resumen las metodologías colectivas que se describen a continuación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65135/65135fig01.jpg"> Figura 1: Resumen esquemático de los métodos presentados. Recolección de plantas y aislamiento, preservación e identificación molecular de hongos mediante metodologías dependientes e independientes del cultivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65135/65135fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for materials sterilization in many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;&#160;</td>
			<td>Merck/Eppendorf</td>
			<td>5810 G</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td>(for samples collection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>75768</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR114831</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>100983</td>
			<td>It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Merck</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass test tubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS7082516</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>20411</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>563935</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td>(for preparing LPCB - hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactophenol blue solution (LPCB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61335</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(class I, from any company, for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(from any company, for hyphae observation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MB Spin Columns</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl blue (cotton blue)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5528</td>
			<td>(for preparing LPCB - hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HS4323</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (2 mL)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR780546</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(for preservation of fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)</td>
			<td>Merck/Pyrex</td>
			<td>SLW1480/10D</td>
			<td>(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)</td>
			<td>Merck/Aldrich</td>
			<td>Z740618</td>
			<td>(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, &#947;-irradiated, non-autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)</td>
			<td>Merck/Brand</td>
			<td>BR455732</td>
			<td>(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, &#947;-irradiated, non-autoclavable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1037</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247464</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247502</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>P2182</td>
			<td>(for many steps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerBead tubes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(purchased with DNeasy PowerSoil kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid mounting medium (Entellan)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.0796</td>
			<td>(for fungi slide culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>717185</td>
			<td>(for cryopreservation in unhulled rice grains)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(commercial product, for superficial desinfestation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12888-50</td>
			<td>(for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>(for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td>(for installation of plant fragments)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoblock</td>
			<td>Merck/Eppendorf</td>
			<td>EP5362000035</td>
			<td>(or from other companies)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer and cell lyzer</td>
			<td>SPEX SamplePrep</td>
			<td></td>
			<td>2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Harleco</td>
			<td>364-M</td>
			<td>(for hyphae staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9531</td>
			<td>(for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Solution (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1699</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unhulled rice grains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(for cryopreservation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shaped glass rod</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Sigma-Aldrich/BenchMixer</td>
			<td>BMSBV1000</td>
			<td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>(for cryopreservation in vermiculite)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and total dna extraction to identify endophytic fungi in mycoheterotrophic plants

Las plantas micoheterótrofas presentan una de las formas más extremas de dependencia micorrícica, habiendo perdido totalmente su capacidad autótrofa. Tan esencial como cualquier otro recurso vital, los hongos con los que estas plantas se asocian íntimamente son esenciales para ellas. De ahí que algunas de las técnicas más relevantes en el estudio de especies micoheterótrofas sean las que permiten la investigación de hongos asociados, especialmente aquellos que habitan en raíces y órganos subterráneos. En este contexto, se aplican comúnmente técnicas para identificar hongos endófitos dependientes e independientes del cultivo. El aislamiento de endófitos fúngicos proporciona un medio para identificarlos morfológicamente, analizar su diversidad y mantener los inóculos para aplicaciones en la germinación simbiótica de semillas de orquídeas. Sin embargo, se sabe que existe una gran variedad de hongos no cultivables que habitan en los tejidos vegetales. Por lo tanto, las técnicas de identificación molecular independientes del cultivo ofrecen una cobertura más amplia de la diversidad y abundancia de especies. El objetivo de este artículo es proporcionar el apoyo metodológico necesario para iniciar dos procedimientos de investigación: uno dependiente de la cultura y otro independiente. En cuanto al protocolo dependiente del cultivo, se detallan los procesos de recolección y mantenimiento de muestras de plantas desde los sitios de recolección hasta las instalaciones de laboratorio, junto con el aislamiento de hongos filamentosos de órganos subterráneos y aéreos de plantas micoheterótrofas, el mantenimiento de una colección de aislados, la caracterización morfológica de las hifas mediante la metodología de cultivo de portaobjetos y la identificación molecular de hongos mediante la extracción total de ADN. Abarcando metodologías independientes del cultivo, los procedimientos detallados incluyen la recolección de muestras de plantas para análisis metagenómicos y la extracción total de ADN de órganos de plantas aclorofílicas utilizando un kit comercial. Por último, también se sugieren protocolos de continuidad (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa [PCR], secuenciación) para los análisis, y aquí se presentan técnicas.

En el protocolo de aislamiento, considerando que existe contaminación por el agua utilizada en el último lavado y que la contaminación también se detecta en las placas de Petri con fragmentos inoculados, se pueden tomar diferentes acciones, dependiendo del tipo de contaminante (Tabla 1). Este procedimiento debe repetirse desde el principio en caso de contaminantes fúngicos altamente esporulantes, que también presentan un crecimiento acelerado, y bacterias de multipl...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants at JoVE.com

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

El presente artículo tiene como objetivo proporcionar protocolos detallados y adecuados para el aislamiento de hongos endófitos asociados a plantas, la preservación a largo plazo de aislados, la caracterización morfológica y la extracción de ADN total para su posterior identificación molecular y análisis metagenómicos.

Aislamiento, caracterización y extracción de ADN total para identificar hongos endófitos en plantas micoheterótrofas

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

Las técnicas aquí presentadas son útiles para investigar la comunidad de hongos endófitos asociados a diferentes órganos de la planta. El aislamiento de hongos endófitos permite su identificación, y es valioso en otras técnicas como la germinación simbiótica. Para comenzar, prepare placas de Petri de ocho a 10 centímetros de medio de cultivo PDA suplementadas con tres mililitros por litro de antibiótico.Compruebe si hay contaminación incubando las placas de Petri del medio de cultivo a 36 grados centígrados durante 24 horas antes de su uso. Al día siguiente, infeste superficialmente los fragmentos de plantas micoheterótrofas sanas utilizando un procedimiento estándar y colóquelos en una placa de Petri estéril. Para evaluar la eficacia de la desinfestación superficial de las muestras, se deben inocular unas gotas de agua destilada utilizada durante el último lavado de las muestras en PDA.A continuación, con un bisturí flameado y unas pinzas, corta las muestras en trozos de 0,2 centímetros de grosor. Seccionar las muestras para amplificar el área de superficie para estar en contacto con el medio. Coloque cinco fragmentos de los órganos subterráneos en la placa de PDA suplementada con antibióticos lo más lejos posible sin tocar los bordes del plato.Selle las placas de Petri con film transparente y guárdelas en la oscuridad a 25 a 27 grados centígrados durante cinco días. Un día antes del subcultivo, prepare placas de Petri de cinco centímetros con cinco a siete gramos por litro de medio AA e incube las placas a 36 grados centígrados durante 24 horas. Para purificar los aislados de hongos, diferencie las colonias de placas PDA por color, patrón de crecimiento, textura y formato de margen.Luego delimite los márgenes de la colonia en la parte inferior del plato. También identifique las colonias con un código. Usando la punta de un palillo de madera esterilizado en autoclave, recupere una pequeña cantidad de micelio de los márgenes de la colonia de hongos identificada y estrie la placa AA, produciendo tres estrías a un centímetro de distancia entre sí y de los bordes del plato.Etiquete la placa AA con el código apropiado usando papel adhesivo y lápiz. Selle las placas antes de incubarlas en la oscuridad a 25 a 27 grados centígrados durante tres días. Después de la incubación, observe meticulosamente las placas para identificar hifas finas que forman colonias individuales.Delimite el área de las colonias individuales utilizando un marcador permanente. Corte una porción del medio que contiene la colonia con un palillo de dientes esterilizado en autoclave y transfiera el volumen cortado al centro de una nueva placa de Petri PDA sin antibióticos. Después de etiquetar las placas de Petri con los códigos de los aislados, séllelas con film transparente y manténgalas en la oscuridad a 25 a 27 grados centígrados durante siete a 14 días.Para comenzar la conservación de los aislados fúngicos con el método de Castellani, agregue 0,5 mililitros de agua destilada al tubo de microcentrífuga de dos mililitros esterilizado en autoclave. Con un palillo esterilizado en autoclave, corte un medio cuboide de 0,5 por 0,5 centímetros de los márgenes de micelio de aislados purificados ya cultivados. Coloque de cuatro a seis cuboides en los tubos de microcentrífuga con agua destilada.Guarde los tubos en la oscuridad a 25 grados centígrados durante el tiempo que sea necesario. Cuando sea necesario, recupere un cuboide y colóquelo en el centro de una nueva antena PDA para cultivar un aislado almacenado. Comience el método de montaje de cardán colocando una gota de un tinte azul de toluidina en un portaobjetos de vidrio limpio.Se pueden utilizar diferentes tinciones en dicha técnica. Con un palillo de dientes esterilizado en autoclave, retire con cuidado algunas hifas del aislado cultivado y colóquelas en la gota de mancha. Coloque una cubreobjetos y analícela bajo un microscopio óptico.Para el método de montaje con cinta adhesiva, coloque una gota de un tinte azul de algodón de lactofenol en un portaobjetos de vidrio limpio. Corta una tira de cinta adhesiva transparente del tamaño que se ajuste bien al portaobjetos de vidrio y a la caída del tinte central. Dirija la superficie pegajosa de la tira adhesiva hacia la superficie del micelio e intente recolectar algunas hifas sin presionar ni recolectar demasiadas.A continuación, pega la cinta al portaobjetos de vidrio, asegurándote de que la mancha esté en contacto con las hifas recogidas. Coloque una gota de agua sobre la cinta y coloque un cubreobjetos antes de analizar el portaobjetos bajo un microscopio óptico. El crecimiento de pequeños grupos de micelios de hongos filamentosos que emergen del interior de los fragmentos se observó después de cinco días de inoculación del fragmento de órgano de planta micoheterótrofo en el medio PDA.Durante siete a 14 días de inoculación del aislado purificado, se observó el crecimiento centrífugo de la colonia de aislado fúngico puro en PDA, formando un único micelio circular. Las posibles contaminaciones fueron fácilmente identificadas, comprometiendo la homogeneidad de la colonia en cuanto a su aspecto de forma de crecimiento, color y producción de pigmentos en el medio. Una colonia aislada de las raíces fusiformes de la orquídea micoheterótrofa, Wullschlaegelia aphylla, fue opaca sin pigmentos ni exudados difusibles en el medio.La colonia era de color blanquecino a gris en la parte superior y pardusca en la parte inferior. Los micelios eran aéreos y abundantes, y los márgenes eran irregulares y aéreos. La colonia tenía una textura aterciopelada y una topografía arrugada sin estructuras macroscópicas.Las estructuras que no eran fácilmente visibles en el micelio no teñido se exhibieron después de teñir el micelio fúngico con azul de algodón de lactofenol y azul de toluidina-O, facilitando su identificación. Los métodos de aislamiento fúngico presentados aquí también se pueden aplicar a plantas verdes para identificar los endófitos fúngicos. Los hongos aislados se pueden utilizar en ensayos de germinación simbiótica.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

La extracción de RNA a partir de células Neuroprecursor utilizando el kit de Bio-Rad ARN total

Investigación

Biología

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Los métodos modificados para la carga de placas de extracción de ADN de alto rendimiento reducen el potencial de contaminación

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

Enfoque sistemático para identificar nuevas moléculas antimicrobianas y antibiócidas de extractos y fracciones de plantas para prevenir caries dentales

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Elaboración de perfiles de modificación de H3K4me3 en plantas utilizando escisión bajo objetivos y etiquetado

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

Aislamiento y cribado de la biodiversidad del suelo para hongos involucrados en la degradación de materiales recalcitrantes

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Técnicas de microscopía para interpretar la colonización fúngica en tejidos de plantas micoheterótrofas y germinación simbiótica de semillas

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...