Name: the serial anesthesia array for the high-throughput investigation of volatile agents using drosophila melanogaster
Uploaded: 2023-02-24T13:10:00
Duration: 6 min 27 s
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Ringraziamo Mark G. Perkins, Pearce Laboratory, Dipartimento di Anestesiologia, Università del Wisconsin-Madison, per la costruzione del prototipo SAA. Il lavoro è supportato dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) con R01GM134107 e dal fondo di ricerca e sviluppo del Dipartimento di Anestesiologia, Università del Wisconsin-Madison.

NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali utilizzati nel protocollo.
1. Costruzione dell'ASA
<ol><li>Realizzate il telaio tagliando il legno e assemblandolo utilizzando le quote indicate nella Figura 1A.</li>
	<li>Modificare i tappi conici dei tubi da 50 ml.<ol><li>Praticare due fori in ciascun cappuccio con una punta da 9/32 pollici. Carteggiare i fori per pulire la plastica lacera. Carteggiare la parte superiore del cappuccio per irruvidire la superficie (questo aiuta con l'adesione della colla).</li>
		<li>Tagliare 5 mL di pipette sierologiche a misura (3 in per l'afflusso e 1,5 in per il deflusso) incidendo la plastica e quindi rompendola pulita sulla linea segnata. Carteggiare le estremità delle pipette tagliate/rotte.</li>
		<li>Incollare la rete ai tubi (consentire il corretto tempo di asciugatura per l'adesivo). Tagliare la rete alle dimensioni del tubo dopo che l'adesivo si asciuga.</li>
		<li>Inserire i tubi nei fori dei cappucci conici con entrambi i tubi che si estendono (3/4 in) sopra il tappo; assicurarsi che il tubo di afflusso si estenda più a lungo nel tubo rispetto al deflusso (Figura 1B).</li>
		<li>Applicare la colla sulla parte superiore dei tappi attorno ai tubi per fissare le parti insieme (lasciare il tempo di asciugatura adeguato per l'adesivo prima di continuare).</li>
	</ol></li>
	<li>Fissate i tappi al telaio e instradate il tubo (Figura 1C).<ol><li>Fissare i lacci dei cavi adesivi al telaio (3,25 in distanziamento, da centro a centro).</li>
		<li>Fissare i tappi al telaio utilizzando fascette zip; Taglia corto il tag della cravatta con zip.</li>
		<li>Tagliare e collegare le lunghezze (9 pollici) dei tubi Tygon ai tubi di afflusso/deflusso su ciascun tappo modificato (Figura 1D). A partire dall'estremità a monte, collegare prima all'afflusso e quindi successivamente collegare i tubi dal deflusso all'afflusso della posizione successiva.</li>
		<li>Aggiungere un indicatore di flusso al "flusso" più a valle (posizione 10, Figura 1E).</li>
		<li>Mettere un tubo conico da 50 mL nella prima posizione e riempirlo con acqua appena sotto il tubo di afflusso (Figura 1F).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare l'interfacciamento per il vaporizzatore. Rimuovere gli stantuffi, tagliare le tacche da due siringhe erogatrici da 10 ml (1/2 di profondità x 1/4 di larghezza, Figura 1G) e inserirle nell'afflusso e nel deflusso del vaporizzatore con le tacche rivolte direttamente verso la parte anteriore del vaporizzatore per allinearsi con i fori (Figura 1H). Facoltativo: incollare le siringhe modificate in posizione. Se conveniente, utilizzare un collettore commerciale (vedere la tabella dei materiali per un'opzione).</li>
	<li>Collega l'intero sistema. Utilizzare i tubi Tygon per collegare i componenti insieme nel seguente ordine: serbatoio del gas di trasporto con regolatore > misuratore di portata specifico per gas > vaporizzatore > SAA (Figura 1C).</li>
	<li>Riempire le posizioni vuote sull'array con tubi conici vuoti da 50 ml. Accendere il serbatoio del gas, aprire il flussometro a ~ 2 L / min e accendere il vaporizzatore allo 0%. Confermare il flusso di gas attraverso il sistema controllando il flussometro a monte del vaporizzatore e l'indicatore di flusso a valle dell'ultima camera del SAA per il flusso. In alternativa, inserire l'estremità del tubo a valle nell'acqua e cercare le bolle. NOTA: Poiché il sistema non è pressurizzato, una colonna d'acqua più alta di un paio di centimetri interromperà il flusso. Se non c'è flusso all'estremità a valle dell'array, controllare quanto segue: il vaporizzatore deve essere acceso per consentire il flusso; controllare che il regolatore del serbatoio e i misuratori di portata consentano il flusso; controllare le posizioni dell'array per assicurarsi che i tubi siano avvitati saldamente; e verificare la presenza di perdite intorno all'adesivo sui tappi modificati.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65144/65144fig01.jpg"> Figura 1: Costruzione dell'ASA. (A) Schema, con misure, del telaio in legno che sostiene l'ASA. (B) Sezione schematizzata, con misurazioni, di un tappo modificato con tubi di afflusso e deflusso costituiti da pipette sierologiche da 5 ml. (C) SAA assemblato (riprodotto da Olufs et al.5) (D) Dettagli di un tappo conico modificato da 50 mL che mostra i tubi di afflusso e di deflusso. (E) Deflusso a valle (posizione 10) con l'indicatore di flusso. (F) Tubo riempito d'acqua a monte (posizione 1) per umidificare il gas di trasporto. La freccia rossa indica il livello dell'acqua. (G) Siringa di erogazione modificata da 10 mL per il collettore di fortuna. Il cerchio rosso evidenzia la tacca di ritaglio situata tra i segni di 8 ml e 10 ml (o 1/2 pollice x 1/4 di pollice). (H) Vista posteriore del vaporizzatore Tec7 che mostra l'inserimento e l'orientamento delle siringhe modificate. In questa vista è presente una sola siringa per mostrare, a sinistra, il foro (freccia rossa) che deve essere allineato con la tacca della siringa modificata. Nota: il disallineamento di questa tacca di taglio e l'apertura di deflusso interromperanno la somministrazione dell'anestetico. Questa parte è un potenziale punto debole in questo sistema personalizzato. Se i fondi sono disponibili, dovrebbe essere utilizzato un collettore commerciale. Abbreviazione: SAA = array di anestesia seriale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65144/65144fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
2. Prima dell'esposizione all'anestetico
<ol><li>Ventiquattro ore o più prima dell'esposizione all'anestetico, ordinare le coorti di mosche secondo necessità per l'esperimento usando il metodo preferito (ad esempio, CO2 o etere).</li>
</ol>3. Funzionamento dell'ASA
<ol><li>Trasferire le mosche dai flaconcini alimentari in tubi conici vuoti da 50 mL (senza CO2).<ol><li>Contare e registrare eventuali mosche morte prima dell'esposizione.</li>
	</ol></li>
	<li>Sganciare e avvitare tubi conici da 50 mL con mosche sull'SAA.</li>
	<li>Accendere il gas di trasporto e impostare la portata desiderata. NOTA: In genere utilizziamo 1-2 L/min.</li>
	<li>Impostare il vaporizzatore anestetico sulla concentrazione desiderata. NOTA: In genere usiamo il 2% per l'isoflurano e il 3,5% per il sevoflurano, che sono dosi equipotenti nei mammiferi10.</li>
	<li>Esporre le mosche per la durata desiderata (min: 15 min). NOTA: Si raccomanda un tempo minimo di esposizione di 15 minuti per evitare possibili variazioni nell'equilibrio tra le posizioni dell'ASA. In questo sistema, ci vogliono 2-3 minuti perché gli anestetici si equilibrino in tutte le posizioni.</li>
	<li>Al termine dell'esposizione, lavare il sistema con un flusso di gas fresco (vaporizzatore impostato allo 0%) a 1,5 L/min per 5 minuti corrispondenti a circa 10x volumi del volume totale SAA.</li>
</ol>4. Elenco di controllo prima di iniziare un esperimento
<ol><li>Aprire completamente il regolatore ad alta pressione (sulla parte superiore del serbatoio dell'aria), quindi chiuderlo di mezzo giro per garantire il flusso di gas di trasporto.</li>
	<li>Seguire i tubi per ogni linea per i) misuratori di portata e ii) vaporizzatore (assicurarsi che l'afflusso / deflusso siano collegati correttamente) e iii) controllare il livello di anestetico nei vaporizzatori.</li>
	<li>Dopo aver caricato le camere con i soggetti, controllare che l'aria/gas scorra con il bubble test o l'indicatore di flusso. NOTA: Alcuni vaporizzatori non consentono il flusso d'aria quando il quadrante è in posizione spenta.</li>
	<li>Quando il gas sta fluendo, verificare che sia il flussometro che l'indicatore di flusso a valle indichino il flusso.</li>
	<li>Alla fine dell'esperimento, consentire 4-5 minuti di flusso d'aria per lavare l'anestetico.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jevtovic-Todorovic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+common+anesthetic+agents+causes+widespread+neurodegeneration+in+the+developing+rat+brain+and+persistent+learning+deficits.">Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (3), 876-882 (2003).</li><li>Vutskits, L., Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lasting+impact+of+general+anaesthesia+on+the+brain:+Mechanisms+and+relevance.">Lasting impact of general anaesthesia on the brain: Mechanisms and relevance.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (11), 705-717 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. 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A., Perouansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+complex+I+mutations+predispose+Drosophila+to+isoflurane+neurotoxicity.">Mitochondrial complex I mutations predispose Drosophila to isoflurane neurotoxicity.</a> Anesthesiology. 133 (4), 839-851 (2020).</li><li>Johnson-Schlitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetic+preconditioning+of+traumatic+brain+injury+is+ineffective+in+a+Drosophila+model+of+obesity.">Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).</li><li>Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Lasarev, M. R., Wassarman, D. A., Perouansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+and+genetic+background+influence+anaesthetic+effects+in+a+D.+melanogaster+model+of+blunt+trauma+with+brain+injury.">Ageing and genetic background influence anaesthetic effects in a D. melanogaster model of blunt trauma with brain injury.</a> British Journal of Anaesthesia. 125 (1), 77-86 (2020).</li><li>Scharenbrock, A. R., Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Wassarman, D. A., Perouansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+genetic+background,+anesthetic+agent,+and+oxygen+concentration+shape+blunt+traumatic+brain+injury+outcomes+in+Drosophila+melanogaster.">Interactions among genetic background, anesthetic agent, and oxygen concentration shape blunt traumatic brain injury outcomes in Drosophila melanogaster.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6926 (2020).</li><li>Fischer, J. A., Olufs, Z. P. G., Katzenberger, R. J., Wassarman, D. A., Perouansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+influence+mortality+in+a+Drosophila+model+of+blunt+trauma+with+traumatic+brain+injury.">Anesthetics influence mortality in a Drosophila model of blunt trauma with traumatic brain injury.</a> Anesthesia &amp; Analgesia. 126 (6), 1979-1986 (2018).</li><li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+closed+head+traumatic+brain+injury.">A Drosophila model of closed head traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4152-E4159 (2013).</li><li>Katzenberger, R. 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A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mito-nuclear+interactions+affecting+lifespan+and+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Leigh+syndrome.">Mito-nuclear interactions affecting lifespan and neurodegeneration in a Drosophila model of Leigh syndrome.</a> Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).</li><li>Johnson-Schlitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetic+preconditioning+of+traumatic+brain+injury+is+ineffective+in+a+Drosophila+model+of+obesity.">Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+postconditioning+reduces+ischemia-induced+nuclear+factor-kappaB+activation+and+interleukin+1beta+production+to+provide+neuroprotection+in+rats+and+mice.">Isoflurane postconditioning reduces ischemia-induced nuclear factor-kappaB activation and interleukin 1beta production to provide neuroprotection in rats and mice.</a> Neurobiology of Disease. 54, 216-224 (2013).</li><li>Leibovitch, B. A., Campbell, D. B., Krishnan, K. S., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+affect+ion+channels+change+the+sensitivity+of+Drosophila+melanogaster+to+volatile+anesthetics.">Mutations that affect ion channels change the sensitivity of Drosophila melanogaster to volatile anesthetics.</a> Journal of Neurogenetics. 10 (1), 1-13 (1995).</li><li>Tinklenberg, J. A., Segal, I. S., Guo, T. Z., Maze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+anesthetic+action+on+the+potassium+channels+of+the+Shaker+mutant+of+Drosophila.">Analysis of anesthetic action on the potassium channels of the Shaker mutant of Drosophila.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 625, 532-539 (1991).</li><li>Gamo, S., Ogaki, M., Nakashima-Tanaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+in+minimum+anesthetic+concentrations+in+Drosophila+melanogaster.">Strain differences in minimum anesthetic concentrations in Drosophila melanogaster.</a> Anesthesiology. 54 (4), 289-293 (1981).</li><li>Campbell, J. L., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visually-induced+jump+response+of+Drosophila+melanogaster+is+sensitive+to+volatile+anesthetics.">The visually-induced jump response of Drosophila melanogaster is sensitive to volatile anesthetics.</a> Journal of Neurogenetics. 12 (4), 241-251 (1998).</li><li>Perouansky, M., Hentschke, H., Perkins, M., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnesic+concentrations+of+the+nonimmobilizer+1,2-dichlorohexafluorocyclobutane+(F6,+2N)+and+isoflurane+alter+hippocampal+theta+oscillations+in+vivo.">Amnesic concentrations of the nonimmobilizer 1,2-dichlorohexafluorocyclobutane (F6, 2N) and isoflurane alter hippocampal theta oscillations in vivo.</a> Anesthesiology. 106 (6), 1168-1176 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

I passaggi critici nella costruzione del SAA includono la garanzia di raccordi ermetici per evitare perdite della miscela anestetica di gas. L'ASA deve essere alloggiato in una cappa aspirante per evitare la contaminazione dello spazio del laboratorio. Tutti gli elementi, dalle bombole del gas di trasporto all'indicatore di flusso a valle dell'ASA, devono essere controllati come indicato nella lista di controllo.
Altri metodi di somministrazione di VGA ai moscerini sono complicati da utilizzare (l'inebriometro)21, hanno un basso throughput 22, non consentono l'esposizione simultanea di più popolazioni 23, non consentono un controllo preciso della concentrazione anestetica21 o hanno una lettura difficile da tradurre in termini clinicamente accettati 24.
L'attuale versione del SAA si basa su un vaporizzatore commerciale e, quindi, gli studi tossicologici sono limitati agli anestetici volatili. Se usato con altre sostanze volatili, un vaporizzatore potrebbe essere usato "off label" dopo aver calibrato l'uscita. In alternativa, potrebbe essere applicato un metodo diverso di vaporizzazione delle sostanze volatili, che richiederebbe misurazioni dedicate per titolare le concentrazioni del farmaco, come descritto in precedenza25.
A parte gli indicatori di flusso, non ci sono allarmi (cioè, se i serbatoi si svuotano, il flusso attraverso l'ASA verrà interrotto). A seconda dell'intensità dell'uso, potrebbe essere necessario pulire, serrare ed eventualmente sostituire il tubo Tygon. Abbiamo eseguito "manutenzione" sul nostro SAA originale due volte in 7 anni di utilizzo.
Questo metodo per anestetizzare i moscerini della frutta consente l'uso della cassetta degli attrezzi genetica disponibile per i ricercatori di Drosophila in un sistema ad alto rendimento. Coorti multiple di moscerini di diverse popolazioni (ad esempio, genotipo, età, sesso) possono essere esposte simultaneamente a concentrazioni anestetiche identiche e alla combinazione desiderata di gas vettore (aria, O 2, N2O, gas nobili) adatta alla domanda di ricerca in questione.
Mostriamo qui che la SAA è stata utile per rivelare cambiamenti inaspettati nella resilienza alla tossicità dell'isoflurano nella linea di volo ND2360114 e che le linee di volo di laboratorio standard differiscono nella loro risposta all'AP. L'identificazione di questi risultati è stata possibile grazie allo stretto controllo delle condizioni sperimentali e all'elevato rendimento della SAA.
La SAA può essere adattata per studiare gli effetti di altri composti organici volatili (COV) sugli insetti (ad esempio, le api mellifere). Per i COV con pressioni di vapore vicine a quelle degli anestetici volatili (isoflurano: 240 mmHg a 20 °C), potrebbero essere utilizzati vaporizzatori convenzionali, ma l'uscita dovrebbe essere calibrata. Il vaporizzatore commerciale per desflurano è riscaldato, offrendo potenzialmente ulteriore flessibilità.

L'esistenza di effetti anestetici collaterali (cioè effetti che non sono immediatamente osservabili ma possono avere conseguenze comportamentali ritardate) è generalmente accettata, ma la comprensione dei loro meccanismi e fattori di rischio rimane rudimentale 1,2. La loro manifestazione ritardata e la loro sottigliezza limitano il numero di variabili potenzialmente importanti che possono essere studiate nei modelli di mammiferi in tempi ragionevoli e ad un costo accettabile. Il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) offre vantaggi unici nel contesto della malattia neurodegenerativa3 e per lo screening tossicologico4 che non sono stati, ad oggi, applicati allo studio degli effetti collaterali anestetici.
Abbiamo sviluppato il serial anesthesia array (SAA) per facilitare l'uso dei moscerini della frutta nello studio della farmacodinamica anestetica e della farmacogenetica. Un vantaggio chiave della SAA è l'esposizione simultanea a condizioni sperimentali identiche di più coorti. Se abbinato alla flessibilità sperimentale dei moscerini della frutta, l'elevata produttività della SAA consente l'esplorazione di variabili biologiche e ambientali su una scala impossibile nei modelli di mammiferi. 
In linea di principio, il SAA è semplicemente una serie di luoghi anestetizzanti collegati (camere fatte di fiale da 50 ml) attraverso le quali un gas vettore rilascia agenti volatili. La prima camera del sistema contiene acqua distillata attraverso la quale viene umidificato il gas di trasporto (le mosche sono sensibili alla disidratazione) e termina con un semplice indicatore di flusso che indica il flusso di gas attraverso il sistema. Reti sottili poste sulle aperture dei tubi di collegamento separano le camere per impedire la migrazione delle mosche tra le camere. Il numero di posizioni "in serie" è limitato dalla resistenza al flusso di gas non pressurizzato (tubi, reti). 
Abbiamo caratterizzato la cinetica di questo prototipo SAA in una precedente pubblicazione5. Sebbene le esatte proprietà farmacocinetiche varino tra i SAA, le basi rilevanti che sono state testate sperimentalmente sono le seguenti: (i) un flusso iniziale di 1,5-2 L/min equilibra tutte le camere (volume totale di ±550 ml) con la concentrazione desiderata di anestetico entro 2 minuti; ii) la concentrazione di vapore anestetico erogato alle camere non cambia sensibilmente tra la prima e l'ultima posizione, poiché la quantità di anestetico contenuta nel volume di gas in una singola camera (50 ml) supera di gran lunga la quantità assorbita da un numero qualsiasi di mosche; e (iii) una volta che le camere si sono equilibrate, il flusso di gas di trasporto può essere ridotto (50-100 ml / min o meno) per evitare sprechi e contaminazione dell'ambiente (gli anestetici volatili hanno proprietà di gas serra). Il flusso minimo necessario per mantenere una concentrazione stazionaria di vapore dipende principalmente dalla perdita del SAA, poiché l'assorbimento di vapore da parte delle mosche è trascurabile. In queste condizioni standard (2% di isoflurano e 1,5 L/min di flusso di gas di trasporto), le mosche sono anestetizzate, cioè immobili) in tutte le posizioni dell'array entro 3-4 minuti, con differenze impercettibili tra le posizioni. I VGA possono essere somministrati per minuti o ore e i nostri paradigmi di esposizione tipici sono compresi tra 15 minuti e 2 ore. Per lavare il sistema, il vaporizzatore viene spento e il flusso viene mantenuto per scambiare circa 10 volumi dell'array (1,5 L / min per 5 minuti). La velocità di eliminazione dell'anestetico varierà con la velocità di flusso impostata.
Gli agenti anestetici volatili interagiscono con numerosi bersagli ancora non identificati, incluso il sistema immuno-infiammatorio6. Il contributo dei singoli bersagli molecolari agli esiti primari rispetto a quelli collaterali (lo "stato anestetico" rispetto agli "effetti collaterali" a lungo e breve termine) è poco compreso. Pertanto, un sistema di mosca sensibile e ad alto rendimento è prezioso per informare gli esperimenti negli animali superiori, nonostante le ovvie differenze tra mosche e mammiferi7. Alcune differenze possono, infatti, essere vantaggiose; Ad esempio, il sistema immunitario della mosca differisce da quello degli animali superiori in quanto manca del braccio adattativo della risposta8. Sebbene questo possa sembrare un limite per la comprensione della malattia negli esseri umani, offre un'opportunità unica per studiare l'interazione dei VGA con la risposta immuno-infiammatoria innata in isolamento dalla risposta adattativa9. Ciò consente di studiare gli effetti farmacologici dei VGA sull'infiammazione e la loro modulazione da parte dei vari background genetici presenti in una popolazione.

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			<td>Serial Anesthesia Array:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10C</td>
			<td>Polystyrene, 5mL serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td>Polypropylene, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable Tie Mounting Pad</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>6EEE6</td>
			<td>1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Syringe</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVE0</td>
			<td>10 mL with Luer-Lock Connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabric Mesh Netting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mm mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Indicator</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>8RH52</td>
			<td>5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Frame</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 feet of 2 inch x 3/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip Tie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#62;5inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Syringe</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVE0</td>
			<td>10 mL with Luer-Lock Connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Manifold and Vaporizers:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4 inch Equal Barbed Y Connector</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>BF-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic)</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>BF-9004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>FP-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmeter auxiliary mounting bracket</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>NonInvPart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>GF-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6&#39; color coded tubing X2. (Vaporizer not Included)</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>TT-17000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tec 7 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>GE Datex-Ohmeda</td>
			<td>1175-9101-000</td>
			<td>Agent-specific vaporizer (Isoflurane)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tec 7 Sevoflurane Vaporizer</td>
			<td>GE Datex-Ohmeda</td>
			<td>1175-9301-000</td>
			<td>Agent-specific vaporizer (Sevoflurane)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the serial anesthesia array for the high-throughput investigation of volatile agents using drosophila melanogaster

Gli anestetici generali volatili (VGA) sono utilizzati in tutto il mondo su milioni di persone di tutte le età e condizioni mediche. Alte concentrazioni di VGA (centinaia di micromolari a basso millimolare) sono necessarie per ottenere una soppressione profonda e non fisiologica della funzione cerebrale che si presenta come "anestesia" all'osservatore. L'intero spettro degli effetti collaterali innescati da concentrazioni così elevate di agenti lipofili non è noto, ma sono state notate interazioni con il sistema immuno-infiammatorio, sebbene il loro significato biologico non sia compreso.
Per studiare gli effetti biologici dei VGA negli animali, abbiamo sviluppato un sistema chiamato serial anesthesia array (SAA) per sfruttare i vantaggi sperimentali offerti dal moscerino della frutta (Drosophila melanogaster). Il SAA è costituito da otto camere disposte in serie e collegate a un afflusso comune. Alcune parti sono disponibili in laboratorio e altre possono essere facilmente fabbricate o acquistate. Un vaporizzatore, necessario per la somministrazione calibrata di VGA, è l'unico componente prodotto commercialmente. I VGA costituiscono solo una piccola percentuale dell'atmosfera che scorre attraverso l'ASA durante il funzionamento, poiché la maggior parte (in genere oltre il 95%) è costituita da gas di trasporto; Il vettore predefinito è Air. Tuttavia, l'ossigeno e qualsiasi altro gas possono essere studiati. 
Il principale vantaggio della SAA rispetto ai sistemi precedenti è che consente l'esposizione simultanea di più coorti di mosche a dosi esattamente titolabili di VGA. Concentrazioni identiche di VGA vengono raggiunte in pochi minuti in tutte le camere, fornendo così condizioni sperimentali indistinguibili. Ogni camera può contenere da una singola mosca a centinaia di mosche. Ad esempio, la SAA può esaminare simultaneamente otto diversi genotipi o quattro genotipi con diverse variabili biologiche (ad esempio, maschio vs femmina, vecchio vs giovane). Abbiamo utilizzato la SAA per studiare la farmacodinamica dei VGA e le loro interazioni farmacogenetiche in due modelli sperimentali di mosca associati a mutanti neuroinfiammatori-mitocondriali e lesioni cerebrali traumatiche (TBI).

Un link video SAA è fornito qui: Metodi di ricerca Perouansky - Dipartimento di Anestesiologia - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Il nostro laboratorio ha utilizzato il SAA per (i) studiare l'effetto del genotipo sulla sensibilità comportamentale agli anestetici5; (ii) schermare i mutanti mitocondriali per gli effetti collaterali degli anestetici11; e (iii) studiare la farmacodinamica dell'isoflurano e del sevoflurano sugli esiti delle lesioni cerebrali traumatiche (TBI)12,13,14,15,16,17. I risultati pubblicati dimostrano chiaramente che il background genetico influenza la farmacodinamica dei VGA clinicamente utilizzati sia per quanto riguarda il fenotipo convenzionale dell'anestesia che gli effetti collaterali della tossicità anestetica, nonché la protezione dei tessuti 5,11,13,14,15.
Esempio rappresentativo 1 (Figura 2):Deriva genetica nella resilienza alla tossicità dell'isoflurano rilevata da condizioni sperimentali riproducibili in modo affidabile La scoperta di un graduale cambiamento quantitativo nella mortalità indotta da VGA tra moscerini ND2360114 coltivati separatamente è un esempio dell'utilità di confronti affidabili della farmacodinamica anestetica tra gruppi sperimentali che utilizzano la SAA. ND23 è un gene che codifica per una subunità nel nucleo del Complesso I del mETC (analogo a Ndufs8 nei mammiferi)18. Le mutazioni in questa subunità sono una causa della sindrome di Leigh, una malattia mitocondriale letale. Abbiamo osservato un graduale indebolimento del fenotipo di mortalità indotto da isoflurano nel tempo in vari stock omozigoti ND2360114 coltivati simultaneamente in condizioni di laboratorio standard (cioè senza esposizione a VGA). Questo adattamento evolutivo alla tossicità dell'isoflurano si è verificato in assenza di qualsiasi esposizione ai VGA ed è probabilmente un effetto collaterale della "sopravvivenza del più adatto" all'interno degli stock mutanti. Questo graduale cambiamento nella sensibilità all'isoflurano sarebbe rimasto non riconosciuto senza la nostra fiducia che le condizioni sperimentali fossero identiche nei saggi e nel tempo. Concludiamo che la selezione favorisce i modificatori degli effetti di ND2360114, con una maggiore resilienza alla tossicità dell'isoflurano. Poiché l'infiammazione nel sistema nervoso centrale svolge un ruolo importante nella patogenesi della sindrome di Leigh, l'evoluzione osservata della resistenza può essere dovuta a cambiamenti adattativi nella risposta immuno-infiammatoria innata, con la resistenza alla tossicità dell'isoflurano che è un sottoprodotto accidentale.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65144/65144fig02.jpg"> Figura 2: Variazione della mortalità indotta dalla tossicità dell'isoflurano come risultato della pressione evolutiva nei moscerini ND2360114. Sette linee (A-G) isolate da una singola popolazione attraverso accoppiamenti a coppia singola, espanse e testate per la mortalità di 24 ore (PM24) dopo un'esposizione di 2 ore all'isoflurano al 2% (a 10-13 giorni di età) mostrano variabilità nel fenotipo derivante da una singola popolazione. Dati mostrati come grafici a scatola e baffi. Le caselle rappresentano il secondo e il terzo quartile dei dati, con i baffi che si estendono fino ai punti dati minimo e massimo. La media e la mediana sono indicate rispettivamente da "+" e linee orizzontali. Le percentuali di mortalità delle singole repliche (N) sono mostrate come cerchi. N = 3-4 flaconcini da 20-50 mosche/flaconcino. Valore P per un ANOVA ordinario a senso unico; p = 0,012 indica una differenza significativa tra le medie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65144/65144fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Esempio rappresentativo 2 (Figura 3): Illustrazione di un'applicazione ad alto rendimento della SAA per rivelare gli effetti genetici di fondo sulla farmacodinamica dell'isoflurano Come esempio dell'elevata produttività del sistema, la Figura 3 illustra gli effetti di esposizioni identiche all'isoflurano (15 min di isoflurano al 2%) prima della lesione cerebrale traumatica (TBI)16, un protocollo che testa il precondizionamento anestetico (AP) in questo modello di mosca13,15,19. La lettura è la mortalità 24 ore dopo TBI corretto per attrito naturale (MI24). In questo modello, tutte le mosche hanno riacquistato la mobilità (cioè erano vive) entro 30 minuti dopo il trauma cranico e la mortalità registrata nell'MI24 è stata il risultato di una lesione cerebrale secondaria (sBI). Nelle quattro linee di volo, AP con isoflurano ha ridotto il MI24 a vari gradi, indicando che la reattività all'AP è un tratto quantitativo. Poiché la risposta infiammatoria è un fattore importante nella morbilità da sBI, l'AP può comportare la modulazione del sistema immunitario20.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65144/65144fig03.jpg"> Figura 3: Influenza del background genetico sulla soppressione della mortalità (MI24) mediante precondizionamento con isoflurano. I moscerini di precondizionamento con 15 minuti di isoflurano al 2% (viola) hanno ridotto l'indice di mortalità a 24 h (MI24) nei ceppi w 1118 e y1w1118 (p < 0,0001 e p = 0,036, rispettivamente). Il MI 24 non era significativamente inferiore nelle linee precondizionate Oregon R (OR) e Canton S (CS) (p = 0,16 e p =0,27, rispettivamente). Dati mostrati come grafici a scatola e baffi. Le caselle rappresentano il secondo e il terzo quartile dei dati, con i baffi che si estendono fino ai punti dati minimo e massimo. La media e la mediana sono indicate rispettivamente da "+" e linee orizzontali. I valori MI24 delle singole repliche (N) sono mostrati come cerchi. N = 15-33 flaconcini da 30-40 moscerini/flaconcino per moscerini trattati con TBI. N = 2-15 flaconcini da 30-40 moscerini/flaconcino per controlli non trattati. Valori P da un test t di Student non accoppiato e a due code. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65144/65144fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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The Serial Anesthesia Array for the High-Throughput Investigation of Volatile Agents Using Drosophila melanogaster

Il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) è ampiamente utilizzato per la ricerca biologica e tossicologica. Per espandere l'utilità delle mosche, abbiamo sviluppato uno strumento, l'array di anestesia seriale, che espone simultaneamente più campioni di mosca agli anestetici generali volatili (VGA), rendendo possibile studiare gli effetti collaterali (tossici e protettivi) dei VGA.

The Serial Anesthesia Array for the High-Throughput Investigation of Volatile Agents Using Drosophila melanogaster

Volatile general anesthetics (VGAs) are used worldwide on millions of people of all ages and medical conditions. High concentrations of VGAs (hundreds of ...

La SAA consente un'elaborazione ad alto rendimento per studiare la farmacologia degli agenti volatili in organismi modello invertebrati dotati di un cervello sofisticato e di un vasto repertorio di comportamenti. In combinazione con la cassetta degli attrezzi genetica disponibile in Drosophila melanogaster, questa tecnica consente di studiare la farmacogenetica degli agenti volatili in modo rapido ed economico. Molte persone sono esposte ad agenti volatili come inquinanti o agenti terapeutici.Oltre all'anestesia, gli anestetici volatili hanno numerosi effetti collaterali tossici e benefici. Il grado di effetto è in parte determinato dalla genetica, che è rimasta in gran parte inesplorata. Dopo aver realizzato il telaio in legno, modificare i tappi del tubo cronaca da 50 millilitri praticando due fori in ciascun cappuccio con una punta da 9/32 pollici.Carteggiare i fori per pulire la plastica lacera. Carteggiare anche la parte superiore del cappuccio per irruvidire la superficie. Quindi tagliare cinque pipette sierologiche da millilitri a misura incidendo la plastica e rompendola sulla linea segnata.Carteggiare le estremità delle pipette tagliate o rotte. Successivamente, incollare la rete ai tubi e tagliare la rete alle dimensioni del tubo una volta che l'adesivo si asciuga. Inserire i tubi nei fori dei cappucci conici con entrambi i tubi che si estendono sopra il cappuccio.Assicurarsi che il tubo di afflusso si estenda più a lungo nel tubo rispetto al deflusso. Applicare la colla sulla parte superiore dei tappi attorno ai tubi per fissare le parti insieme e lasciarle asciugare. Fissare le fascette dei cavi adesivi al telaio.Fissare i cappucci al telaio usando fascette e tagliare le estremità della cravatta con cerniera corte. Tagliare e collegare la lunghezza del tubo tygon ai tubi di afflusso e deflusso su ciascun tappo modificato. Partendo dall'estremità a monte, collegare il tubo prima all'afflusso, quindi dal deflusso all'afflusso della posizione successiva.Quindi, aggiungi un indicatore di flusso al maggior afflusso a valle. Metti un tubo conico da 50 millilitri nella prima posizione e segna il segno di riempimento dell'acqua. Rimuovere il tubo.Riempilo con acqua sotto il tubo di afflusso e rimettilo in posizione. Preparare l'interfacciamento per il vaporizzatore. Rimuovere gli stantuffi, tagliare le tacche da due siringhe erogatrici da 10 millilitri e inserirle nell'afflusso e nel deflusso del vaporizzatore con le tacche rivolte direttamente verso la parte anteriore del vaporizzatore per allinearsi con i fori.Collega l'intero sistema. Utilizzare tubi tygon per collegare il serbatoio del gas di trasporto con il regolatore, il misuratore di portata specifico del gas, il vaporizzatore e l'SAA. Riempi le posizioni vuote sull'array con tubi cronici vuoti da 50 millilitri.Ora accendi il serbatoio del gas. Aprire il flussometro a due litri al minuto e accendere il vaporizzatore allo 0%Confermare il flusso di gas attraverso il sistema controllando il flussometro a monte del vaporizzatore e l'indicatore di flusso a valle dell'ultima camera del SAA per il flusso. In alternativa, inserire l'estremità del tubo a valle nell'acqua e cercare le bolle.24 ore o più prima dell'esposizione anestetica ordinare le coorti di mosche secondo necessità per l'esperimento utilizzando il metodo preferito. Trasferire le mosche dalle fiale di cibo in tubi conici vuoti da 50 millilitri. Contare e registrare eventuali mosche morte prima dell'esposizione.Smontare e avvitare tubi conici da 50 millilitri con mosche sul SAA. Accendere il gas di trasporto e impostarlo sulla portata desiderata. Impostare il vaporizzatore anestetico alla concentrazione desiderata ed esporre le mosche per la durata desiderata.Al termine dell'esposizione lavare il sistema con il flusso di gas fresco a 1,5 litri al minuto per cinque minuti, corrispondente a circa 10 volumi del volume totale SAA. Aprire completamente il regolatore di alta pressione, quindi chiuderlo di mezzo giro per garantire il flusso di gas di trasporto. Seguire i tubi per ogni linea fino ai misuratori di portata e al vaporizzatore e controllare il livello di anestetico nei vaporizzatori.Verificare che quando il gas fluisce, indica il flusso sul flussometro e sull'indicatore di flusso a valle. Alla fine dell'esperimento, lasciare quattro o cinque minuti di flusso d'aria per lavare l'anestetico. Sette linee isolate da una singola popolazione attraverso incontri a coppia singola hanno mostrato variazioni nella mortalità indotta dalla tossicità del fluoro iso a causa della pressione evolutiva nei moscerini ND23 60114.I moscerini pre-condizionamento con 15 minuti di fluoro al 2% di iso prima della lesione cerebrale traumatica hanno ridotto l'indice di mortalità a 24 ore nei ceppi bianchi 1118 e gialli / bianchi. L'indice di mortalità a 24 ore non era significativamente più basso nelle linee R e Canton S precondizionate dell'Oregon. Durante il montaggio le tacche nelle siringhe modificate devono allinearsi con i fori delle porte del vaporizzatore.Durante l'esposizione, controllare periodicamente che vi sia flusso attraverso il sistema. Questa procedura può essere seguita per un'ampia varietà di studi comportamentali, di sopravvivenza e molecolari che potrebbero portare a approfondimenti sulla farmacologia degli agenti volatili.

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