Name: the serial anesthesia array for the high-throughput investigation of volatile agents using drosophila melanogaster
Uploaded: 2023-02-24T13:10:00
Duration: 6 min 27 s
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Agradecemos a Mark G. Perkins, Laboratorio Pearce, Departamento de Anestesiología, Universidad de Wisconsin-Madison, por la construcción del prototipo SAA. El trabajo es apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) con R01GM134107 y por el fondo de investigación y desarrollo del Departamento de Anestesiología de la Universidad de Wisconsin-Madison.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales utilizados en el protocolo.
1. Construcción del AEA
<ol><li>Haga el marco cortando madera y ensamblando el marco utilizando las dimensiones de la Figura 1A.</li>
	<li>Modifique las tapas de los tubos cónicos de 50 ml.<ol><li>Perfore dos agujeros en cada tapa con una broca de 9/32. Lija los agujeros para limpiar el plástico irregular. Lije la parte superior de la tapa para endurecer la superficie (esto ayuda con la adhesión del pegamento).</li>
		<li>Corte 5 ml de pipetas serológicas a medida (3 pulgadas para el flujo de entrada y 1,5 pulgadas para el flujo de salida) marcando el plástico y luego rompiéndolo limpio en la línea marcada. Lijar los extremos de las pipetas cortadas/rotas.</li>
		<li>Pegue la red a los tubos (permita un tiempo de secado adecuado para el adhesivo). Corte la red al tamaño del tubo después de que el adhesivo se seque.</li>
		<li>Inserte los tubos en los orificios de las tapas cónicas con ambos tubos que se extienden (3/4 in) por encima de la tapa; asegúrese de que el tubo de entrada se extienda más tiempo en el tubo que el flujo de salida (Figura 1B).</li>
		<li>Aplique pegamento en la parte superior de las tapas alrededor de los tubos para asegurar las piezas juntas (permita un tiempo de secado adecuado para el adhesivo antes de continuar).</li>
	</ol></li>
	<li>Fije las tapas al marco y dirija el tubo (Figura 1C).<ol><li>Fije los amarres de cables adhesivos al marco (3,25 pulgadas de distancia, de centro a centro).</li>
		<li>Fije las tapas al marco con bridas; Corta los extremos de la etiqueta de corbata de cremallera.</li>
		<li>Corte y conecte longitudes (9 pulgadas) del tubo Tygon a los tubos de entrada/salida de cada tapa modificada (Figura 1D). Comenzando en el extremo aguas arriba, conéctelo primero a la entrada y luego conecte la tubería desde la salida a la entrada de la siguiente posición.</li>
		<li>Agregue un indicador de flujo a la "entrada" más descendente (posición 10, Figura 1E).</li>
		<li>Coloque un tubo cónico de 50 ml en la primera posición y llénelo con agua justo debajo del tubo de entrada (Figura 1F).</li>
	</ol></li>
	<li>Prepara la interfaz para el vaporizador. Retire los émbolos, corte las muescas de dos jeringas dispensadoras de 10 ml (1/2 pulgada de profundidad x 1/4 de ancho, Figura 1G) e insértelas en la entrada y salida del vaporizador con las muescas orientadas directamente hacia la parte frontal del vaporizador para alinearlas con los orificios (Figura 1H). Opcional: Pegue las jeringas modificadas en su lugar. Si es asequible, use un colector comercial (consulte la Tabla de materiales para una opción).</li>
	<li>Conecte todo el sistema. Utilice el tubo Tygon para unir los componentes en el siguiente orden: tanque de gas portador con regulador > medidor de flujo específico de gas > vaporizador > SAA (Figura 1C).</li>
	<li>Llene las posiciones vacías en la matriz con tubos cónicos vacíos de 50 ml. Encienda el tanque de gasolina, abra el medidor de flujo a ~ 2 L / min y encienda el vaporizador al 0%. Confirme el flujo de gas a través del sistema comprobando el caudalímetro aguas arriba del vaporizador y el indicador de flujo aguas abajo de la última cámara de la SAA para el flujo. Alternativamente, inserte el extremo del tubo aguas abajo en el agua y busque burbujas. NOTA: Como el sistema no está presurizado, una columna de agua superior a un par de centímetros detendrá el flujo. Si no hay flujo en el extremo aguas abajo de la matriz, verifique lo siguiente: el vaporizador debe estar encendido para permitir el flujo; verifique que el regulador del tanque y los medidores de flujo permitan el flujo; compruebe las posiciones de la matriz para asegurarse de que los tubos estén bien atornillados; y compruebe si hay fugas alrededor del adhesivo en las tapas modificadas.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65144/65144fig01.jpg"> Figura 1: Construcción de la SAA. (A) Esquema, con medidas, del marco de madera que soporta la SAA. (B) Sección transversal esquematizada, con medidas, de una tapa modificada con tubos de entrada y salida hechos de pipetas serológicas de 5 ml. (C) SAA ensamblada (reproducida de Olufs et al.5) (D) Detalles de una tapa cónica modificada de 50 ml que muestra tubos de entrada y salida. (E) Flujo descendente (posición 10) con el indicador de flujo. (F) Tubo de llenado de agua aguas arriba (posición 1) para humidificar el gas portador. La flecha roja indica el nivel del agua. (G) Jeringa dispensadora modificada de 10 ml para el colector improvisado. El círculo rojo resalta la muesca recortada ubicada entre las marcas de 8 ml y 10 ml (o 1/2 pulgada x 1/4 pulgada). (H) Vista trasera del vaporizador Tec7 que muestra la inserción y orientación de las jeringas modificadas. Solo hay una jeringa en su lugar en esta vista para mostrar, a la izquierda, el orificio (flecha roja) que debe alinearse con la muesca de la jeringa modificada. Nota: La desalineación de esta muesca de corte y la abertura de salida interrumpirá la administración de anestesia. Esta parte es un punto débil potencial en este sistema hecho a medida. Si hay fondos disponibles, se debe utilizar un colector comercial. Abreviatura: SAA = matriz de anestesia en serie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65144/65144fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Antes de la exposición anestésica
<ol><li>Veinticuatro horas o más antes de la exposición al anestésico, clasifique las cohortes de moscas según sea necesario para el experimento utilizando el método preferido (por ejemplo, CO2 o éter).</li>
</ol>3. Funcionamiento del AEA
<ol><li>Transfiera las moscas de los viales de alimentos a tubos cónicos vacíos de 50 ml (sinCO2).<ol><li>Cuente y registre cualquier mosca muerta antes de la exposición.</li>
	</ol></li>
	<li>Destapar y atornillar 50 ml de tubos cónicos con moscas en la SAA.</li>
	<li>Encienda el gas portador y configúrelo en el caudal deseado. NOTA: Normalmente usamos 1-2 L/min.</li>
	<li>Ajuste el vaporizador anestésico a la concentración deseada. NOTA: Normalmente usamos 2% para isoflurano y 3.5% para sevoflurano, que son dosis equipotentes en mamíferos10.</li>
	<li>Exponer las moscas durante el tiempo deseado (min: 15 min). NOTA: Se recomienda un tiempo de exposición mínimo de 15 min para evitar la posible variabilidad en el equilibrio entre las posiciones de la AEA. En este sistema, los anestésicos tardan 2-3 minutos en equilibrarse en todas las posiciones.</li>
	<li>Al final de la exposición, enjuague el sistema con flujo de gas fresco (vaporizador ajustado al 0%) a 1,5 L/min durante 5 minutos, lo que corresponde a aproximadamente 10 veces los volúmenes del volumen total de SAA.</li>
</ol>4. Lista de verificación antes de comenzar un experimento
<ol><li>Abra completamente el regulador de alta presión (en la parte superior del tanque de aire) y luego ciérrelo media vuelta para garantizar el flujo de gas portador.</li>
	<li>Siga los tubos de cada línea hasta i) caudalímetros y ii) vaporizador (asegúrese de que el flujo de entrada / salida esté conectado correctamente), y iii) verifique el nivel de anestesia en los vaporizadores.</li>
	<li>Después de cargar las cámaras con sujetos, compruebe que el aire/gas fluye con la prueba de burbujas o el indicador de flujo. NOTA: Algunos vaporizadores no permiten el flujo de aire cuando el dial está en la posición de apagado.</li>
	<li>Cuando el gas fluya, confirme que tanto el caudalímetro como el indicador de caudal aguas abajo indican caudal.</li>
	<li>Al final del experimento, permita 4-5 minutos de flujo de aire para lavar el anestésico.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jevtovic-Todorovic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+common+anesthetic+agents+causes+widespread+neurodegeneration+in+the+developing+rat+brain+and+persistent+learning+deficits.">Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (3), 876-882 (2003).</li><li>Vutskits, L., Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lasting+impact+of+general+anaesthesia+on+the+brain:+Mechanisms+and+relevance.">Lasting impact of general anaesthesia on the brain: Mechanisms and relevance.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (11), 705-717 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophotoxicology:+The+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology.">Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).</li><li>Olufs, Z. P. G., Loewen, C. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variability+affects+absolute+and+relative+potencies+and+kinetics+of+the+anesthetics+isoflurane+and+sevoflurane+in+Drosophila+melanogaster.">Genetic variability affects absolute and relative potencies and kinetics of the anesthetics isoflurane and sevoflurane in Drosophila melanogaster.</a> Scientific Reports. 8, 2348 (2018).</li><li>Stollings, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+modulation+by+volatile+anesthetics.">Immune modulation by volatile anesthetics.</a> Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).</li><li>Yamaguchi, M., Yoshida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila as a model organism. In Drosophila Models for Human Diseases., edited by. , 1-10 (2018).</li><li>Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+of+Drosophila.">The immune response of Drosophila.</a> Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).</li><li>Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+in+Drosophila+melanogaster-From+microbial+recognition+to+whole-organism+physiology.">Immunity in Drosophila melanogaster-From microbial recognition to whole-organism physiology.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (12), 796-810 (2014).</li><li>Shaughnessy, M. R., Hofmeister, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+sevoflurane+and+isoflurane+minimum+alveolar+concentration+in+domestic+cats.">A systematic review of sevoflurane and isoflurane minimum alveolar concentration in domestic cats.</a> Veterinary Anaesthesia and Analgesia. 41 (1), 1-13 (2014).</li><li>Olufs, Z. P. G., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+complex+I+mutations+predispose+Drosophila+to+isoflurane+neurotoxicity.">Mitochondrial complex I mutations predispose Drosophila to isoflurane neurotoxicity.</a> Anesthesiology. 133 (4), 839-851 (2020).</li><li>Johnson-Schlitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetic+preconditioning+of+traumatic+brain+injury+is+ineffective+in+a+Drosophila+model+of+obesity.">Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).</li><li>Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Lasarev, M. R., Wassarman, D. A., Perouansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+and+genetic+background+influence+anaesthetic+effects+in+a+D.+melanogaster+model+of+blunt+trauma+with+brain+injury.">Ageing and genetic background influence anaesthetic effects in a D. melanogaster model of blunt trauma with brain injury.</a> British Journal of Anaesthesia. 125 (1), 77-86 (2020).</li><li>Scharenbrock, A. R., Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Wassarman, D. A., Perouansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+genetic+background,+anesthetic+agent,+and+oxygen+concentration+shape+blunt+traumatic+brain+injury+outcomes+in+Drosophila+melanogaster.">Interactions among genetic background, anesthetic agent, and oxygen concentration shape blunt traumatic brain injury outcomes in Drosophila melanogaster.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6926 (2020).</li><li>Fischer, J. A., Olufs, Z. P. G., Katzenberger, R. J., Wassarman, D. A., Perouansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+influence+mortality+in+a+Drosophila+model+of+blunt+trauma+with+traumatic+brain+injury.">Anesthetics influence mortality in a Drosophila model of blunt trauma with traumatic brain injury.</a> Anesthesia &amp; Analgesia. 126 (6), 1979-1986 (2018).</li><li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+closed+head+traumatic+brain+injury.">A Drosophila model of closed head traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4152-E4159 (2013).</li><li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+inflict+closed+head+traumatic+brain+injury+in+Drosophila.">A method to inflict closed head traumatic brain injury in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52905 (2015).</li><li>Loewen, C. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mito-nuclear+interactions+affecting+lifespan+and+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Leigh+syndrome.">Mito-nuclear interactions affecting lifespan and neurodegeneration in a Drosophila model of Leigh syndrome.</a> Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).</li><li>Johnson-Schlitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetic+preconditioning+of+traumatic+brain+injury+is+ineffective+in+a+Drosophila+model+of+obesity.">Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+postconditioning+reduces+ischemia-induced+nuclear+factor-kappaB+activation+and+interleukin+1beta+production+to+provide+neuroprotection+in+rats+and+mice.">Isoflurane postconditioning reduces ischemia-induced nuclear factor-kappaB activation and interleukin 1beta production to provide neuroprotection in rats and mice.</a> Neurobiology of Disease. 54, 216-224 (2013).</li><li>Leibovitch, B. A., Campbell, D. B., Krishnan, K. S., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+affect+ion+channels+change+the+sensitivity+of+Drosophila+melanogaster+to+volatile+anesthetics.">Mutations that affect ion channels change the sensitivity of Drosophila melanogaster to volatile anesthetics.</a> Journal of Neurogenetics. 10 (1), 1-13 (1995).</li><li>Tinklenberg, J. A., Segal, I. S., Guo, T. Z., Maze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+anesthetic+action+on+the+potassium+channels+of+the+Shaker+mutant+of+Drosophila.">Analysis of anesthetic action on the potassium channels of the Shaker mutant of Drosophila.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 625, 532-539 (1991).</li><li>Gamo, S., Ogaki, M., Nakashima-Tanaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+in+minimum+anesthetic+concentrations+in+Drosophila+melanogaster.">Strain differences in minimum anesthetic concentrations in Drosophila melanogaster.</a> Anesthesiology. 54 (4), 289-293 (1981).</li><li>Campbell, J. L., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visually-induced+jump+response+of+Drosophila+melanogaster+is+sensitive+to+volatile+anesthetics.">The visually-induced jump response of Drosophila melanogaster is sensitive to volatile anesthetics.</a> Journal of Neurogenetics. 12 (4), 241-251 (1998).</li><li>Perouansky, M., Hentschke, H., Perkins, M., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnesic+concentrations+of+the+nonimmobilizer+1,2-dichlorohexafluorocyclobutane+(F6,+2N)+and+isoflurane+alter+hippocampal+theta+oscillations+in+vivo.">Amnesic concentrations of the nonimmobilizer 1,2-dichlorohexafluorocyclobutane (F6, 2N) and isoflurane alter hippocampal theta oscillations in vivo.</a> Anesthesiology. 106 (6), 1168-1176 (2007).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Los pasos críticos en la construcción de la SAA incluyen garantizar accesorios ajustados para evitar fugas de la mezcla anestésica de gases. El SAA debe estar alojado en una campana extractora para evitar la contaminación del espacio del laboratorio. Todos los elementos, desde los cilindros de gas portador hasta el indicador de flujo aguas abajo de la SAA, deben verificarse como se describe en la lista de verificación.
Otros métodos de administración de VGAs a moscas son complicados de operar (el inebriómetro)21, tienen bajo rendimiento 22, no permiten la exposición simultánea de múltiples poblaciones 23, no permiten un control preciso de la concentración anestésica 21, o tienen una lectura difícil de traducir en términos clínicamente aceptados 24.
La versión actual de la SAA se basa en un vaporizador comercial y, por lo tanto, los estudios toxicológicos se limitan a los anestésicos volátiles. Si se usa con otras sustancias volátiles, se podría usar un vaporizador "fuera de etiqueta" después de calibrar la salida. Alternativamente, se podría aplicar un método diferente de vaporización de las sustancias volátiles, lo que requeriría mediciones dedicadas para valorar las concentraciones del fármaco, como se describió anteriormente25.
Aparte de los indicadores de flujo, no hay alarmas (es decir, si los tanques se vacían, el flujo a través del SAA se interrumpirá). Dependiendo de la intensidad del uso, la SAA puede necesitar limpieza, apriete y posiblemente el reemplazo del tubo Tygon. Hemos realizado "mantenimiento" en nuestro SAA original dos veces en 7 años de uso.
Este método para anestesiar moscas de la fruta permite el uso de la caja de herramientas genéticas disponible para los investigadores de Drosophila en un sistema de alto rendimiento. Múltiples cohortes de moscas de diferentes poblaciones (por ejemplo, genotipo, edad, sexo) pueden exponerse simultáneamente a concentraciones anestésicas idénticas y a la combinación deseada de gas portador (aire,O2, N2O, gases nobles) adecuada a la pregunta de investigación en cuestión.
Mostramos aquí que la SAA ha sido útil para revelar cambios inesperados en la resistencia a la toxicidad del isoflurano en la línea de mosca ND2360114 y que las líneas de mosca de laboratorio estándar difieren en su capacidad de respuesta a AP. La identificación de estos hallazgos fue posible debido al estricto control de las condiciones experimentales y el alto rendimiento de la SAA.
La SAA se puede adaptar para estudiar los efectos de otros compuestos orgánicos volátiles (COV) en insectos (por ejemplo, abejas). Para COV con presiones de vapor cercanas a las de los anestésicos volátiles (isoflurano: 240 mmHg a 20 °C), se podrían usar vaporizadores convencionales, pero la salida tendría que ser calibrada. El vaporizador comercial para desflurano se calienta, lo que puede ofrecer flexibilidad adicional.

La existencia de efectos anestésicos colaterales (es decir, efectos que no son inmediatamente observables pero que pueden tener consecuencias conductuales retardadas) es generalmente aceptada, pero la comprensión de sus mecanismos y factores de riesgo sigue siendo rudimentaria 1,2. Su manifestación tardía y sutileza limitan el número de variables potencialmente importantes que pueden investigarse en modelos de mamíferos dentro de plazos razonables y a un costo aceptable. La mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) ofrece ventajas únicas en el contexto de la enfermedad neurodegenerativa3 y para el cribado toxicológico4 que, hasta la fecha, no se han aplicado al estudio de los efectos colaterales anestésicos.
Desarrollamos el serial anesthesia array (SAA) para facilitar el uso de moscas de la fruta en el estudio de la farmacodinámica anestésica y la farmacogenética. Una ventaja clave del SAA es la exposición simultánea a condiciones experimentales idénticas de múltiples cohortes. Cuando se combina con la flexibilidad experimental de las moscas de la fruta, el alto rendimiento de la SAA permite la exploración de variables biológicas y ambientales en una escala imposible en modelos de mamíferos. 
En principio, el SAA es simplemente una serie de ubicaciones de anestesia conectadas (cámaras hechas de viales de 50 ml) a través de las cuales un gas portador suministra agentes volátiles. La primera cámara del sistema contiene agua destilada a través de la cual se humidifica el gas portador (las moscas son sensibles a la deshidratación), y termina con un indicador de flujo simple que indica el flujo de gas a través del sistema. Las redes finas colocadas en las aberturas del tubo de conexión separan las cámaras para evitar la migración de moscas entre las cámaras. El número de ubicaciones "en serie" está limitado por la resistencia al flujo de gas no presurizado (tubería, redes). 
Caracterizamos la cinética de este prototipo de SAA en una publicación anterior5. Aunque las propiedades farmacocinéticas exactas variarán entre las SAA, los fundamentos relevantes que se han probado experimentalmente son los siguientes: (i) un flujo inicial de 1.5-2 L / min equilibra todas las cámaras (volumen total de ±550 ml) con la concentración deseada de anestésico dentro de 2 min; ii) la concentración de vapor anestésico suministrado a las cámaras no cambia apreciablemente entre la primera y la última ubicación porque la cantidad de anestésico contenida en el volumen de gas en una cámara individual (50 ml) supera con creces la cantidad absorbida por cualquier número de moscas; y (iii) una vez que las cámaras se han equilibrado, el flujo de gas portador puede reducirse (50-100 ml / min o menos) para evitar el desperdicio y la contaminación del medio ambiente (los anestésicos volátiles tienen propiedades de gases de efecto invernadero). El flujo mínimo necesario para mantener una concentración de vapor en estado estable depende principalmente de la fuga de la SAA, ya que la absorción de vapor por las moscas es insignificante. Bajo estas condiciones estándar (2% de isoflurano y 1,5 L/min de flujo de gas portador), las moscas son anestesiadas (es decir, inmóviles) en todas las posiciones de la matriz dentro de 3-4 min, con diferencias imperceptibles entre posiciones. Los VGA se pueden administrar durante minutos u horas, y nuestros paradigmas de exposición típicos están en el rango de 15 min a 2 h. Para enjuagar el sistema, el vaporizador se apaga y el flujo se mantiene para intercambiar aproximadamente 10 veces los volúmenes de la matriz (1,5 L/min durante 5 min). La velocidad de eliminación del anestésico variará con la velocidad de flujo establecida.
Los agentes anestésicos volátiles interactúan con numerosos objetivos aún no identificados, incluido el sistema inmunoinflamatorio6. La contribución de los objetivos moleculares individuales a los resultados primarios versus colaterales (el "estado anestésico" frente a los "efectos secundarios" a largo y corto plazo) es poco conocida. Por lo tanto, un sistema de moscas sensible y de alto rendimiento es valioso para informar experimentos en animales superiores, a pesar de las diferencias obvias entre moscas y mamíferos7. Algunas diferencias pueden, de hecho, ser ventajosas; Por ejemplo, el sistema inmunológico de la mosca difiere del de los animales superiores en que carece del brazo adaptativo de la respuesta8. Si bien esto puede parecer una limitación para comprender la enfermedad en humanos, ofrece una oportunidad única para estudiar la interacción de VGA con la respuesta inmune-inflamatoria innata aislada de la respuesta adaptativa9. Esto permite estudiar los efectos farmacológicos de VGA sobre la inflamación y su modulación por los variados antecedentes genéticos presentes en una población.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Serial Anesthesia Array:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10C</td>
			<td>Polystyrene, 5mL serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td>Polypropylene, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable Tie Mounting Pad</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>6EEE6</td>
			<td>1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Syringe</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVE0</td>
			<td>10 mL with Luer-Lock Connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabric Mesh Netting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mm mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Indicator</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>8RH52</td>
			<td>5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood Frame</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 feet of 2 inch x 3/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip Tie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#62;5inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Syringe</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVE0</td>
			<td>10 mL with Luer-Lock Connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Manifold and Vaporizers:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4 inch Equal Barbed Y Connector</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>BF-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic)</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>BF-9004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>FP-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmeter auxiliary mounting bracket</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>NonInvPart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>GF-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6&#39; color coded tubing X2. (Vaporizer not Included)</td>
			<td>Somni Scientific</td>
			<td>TT-17000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tec 7 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>GE Datex-Ohmeda</td>
			<td>1175-9101-000</td>
			<td>Agent-specific vaporizer (Isoflurane)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tec 7 Sevoflurane Vaporizer</td>
			<td>GE Datex-Ohmeda</td>
			<td>1175-9301-000</td>
			<td>Agent-specific vaporizer (Sevoflurane)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the serial anesthesia array for the high-throughput investigation of volatile agents using drosophila melanogaster

Los anestésicos generales volátiles (VGA) se utilizan en todo el mundo en millones de personas de todas las edades y afecciones médicas. Altas concentraciones de VGAs (cientos de micromolares a milimolares bajos) son necesarias para lograr una supresión profunda y no fisiológica de la función cerebral presentándose como "anestesia" para el observador. No se conoce el espectro completo de los efectos colaterales desencadenados por concentraciones tan altas de agentes lipofílicos, pero se han observado interacciones con el sistema inmunoinflamatorio, aunque no se comprende su importancia biológica.
Para investigar los efectos biológicos de las VGA en animales, desarrollamos un sistema denominado matriz de anestesia en serie (SAA) para explotar las ventajas experimentales que ofrece la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). El SAA consta de ocho cámaras dispuestas en serie y conectadas a una entrada común. Algunas piezas están disponibles en el laboratorio, y otras se pueden fabricar o comprar fácilmente. Un vaporizador, que es necesario para la administración calibrada de VGAs, es el único componente fabricado comercialmente. Los VGA constituyen sólo un pequeño porcentaje de la atmósfera que fluye a través de la SAA durante la operación, ya que la mayor parte (típicamente más del 95%) es gas portador; El transportista predeterminado es el aéreo. Sin embargo, el oxígeno y cualquier otro gas pueden ser investigados. 
La principal ventaja de la SAA sobre los sistemas anteriores es que permite la exposición simultánea de múltiples cohortes de moscas a dosis exactamente titulables de VGA. Se alcanzan concentraciones idénticas de VGA en cuestión de minutos en todas las cámaras, proporcionando así condiciones experimentales indistinguibles. Cada cámara puede contener desde una sola mosca hasta cientos de moscas. Por ejemplo, el SAA puede examinar simultáneamente ocho genotipos diferentes o cuatro genotipos con diferentes variables biológicas (por ejemplo, macho vs. hembra, viejo vs. joven). Hemos utilizado el SAA para investigar la farmacodinámica de las VGA y sus interacciones farmacogenéticas en dos modelos experimentales de moscas asociadas con mutantes mitocondriales de neuroinflamación y lesión cerebral traumática (LCT).

Un enlace de video de SAA se proporciona aquí: Perouansky Research Methods - Department of Anesthesiology - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Nuestro laboratorio ha utilizado el SAA para (i) estudiar el efecto del genotipo en la sensibilidad conductual a los anestésicos5; (ii) detectar mutantes mitocondriales para detectar los efectos colaterales de los anestésicos11; y (iii) investigar la farmacodinámica del isoflurano y el sevoflurano sobre los resultados en la lesión cerebral traumática (LCT)12,13,14,15,16,17. Los resultados publicados demuestran claramente que los antecedentes genéticos influyen en la farmacodinámica de las VGA utilizadas clínicamente tanto con respecto al fenotipo convencional de la anestesia como a los efectos colaterales de la toxicidad anestésica, así como a la protección tisular 5,11,13,14,15.
Ejemplo representativo 1 (Figura 2):Deriva genética en la resiliencia a la toxicidad del isoflurano detectada por condiciones experimentales fiablemente reproducibles El descubrimiento de un cambio cuantitativo gradual en la mortalidad inducida por VGA entre moscas ND2360114 cultivadas por separado es un ejemplo de la utilidad de comparaciones confiables de la farmacodinámica anestésica entre grupos experimentales que utilizan la SAA. ND23 es un gen que codifica una subunidad en el núcleo del Complejo I del mETC (análogo a Ndufs8 en mamíferos )18. Las mutaciones en esta subunidad son una causa del síndrome de Leigh, una enfermedad mitocondrial letal. Observamos un debilitamiento gradual del fenotipo de mortalidad inducida por isoflurano a lo largo del tiempo en varias cepas homocigotas ND2360114 cultivadas simultáneamente en condiciones estándar de laboratorio (es decir, sin exposición a VGA). Esta adaptación evolutiva a la toxicidad del isoflurano se produjo en ausencia de cualquier exposición a VGAs y es probablemente un efecto colateral de la "supervivencia del más apto" dentro de las poblaciones mutantes. Este cambio gradual en la sensibilidad al isoflurano habría permanecido sin nuestra confianza en que las condiciones experimentales eran idénticas en todos los ensayos y a lo largo del tiempo. Concluimos que la selección favorece los modificadores de los efectos de ND2360114, con una coincidencia de una mayor resistencia a la toxicidad del isoflurano. Como la inflamación en el sistema nervioso central juega un papel importante en la patogénesis del síndrome de Leigh, la evolución observada de la resistencia puede deberse a cambios adaptativos en la respuesta inmunoinflamatoria innata, siendo la resistencia a la toxicidad del isoflurano un subproducto accidental.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65144/65144fig02.jpg"> Figura 2: Variación en la mortalidad inducida por toxicidad por isoflurano como resultado de la presión evolutiva en moscas ND2360114. Siete líneas (A-G) aisladas de una sola población a través de apareamientos de un solo par, expandidas y probadas para la mortalidad de 24 h (PM24) después de una exposición de 2 h a isoflurano al 2% (a los 10-13 días de edad) muestran variabilidad en el fenotipo que surge de una sola población. Los datos se muestran como diagramas de caja y bigotes. Los cuadros representan el segundo y tercer cuartil de los datos, con los bigotes extendiéndose a los puntos de datos mínimos y máximos. La media y la mediana se indican con "+" y líneas horizontales, respectivamente. El porcentaje de mortalidad de las réplicas individuales (N) se muestra como círculos. N = 3-4 viales de 20-50 moscas/vial. Valor p para un ANOVA unidireccional ordinario; p = 0,012 indica una diferencia significativa entre las medias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65144/65144fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Ejemplo representativo 2 (Figura 3): Ilustración de una aplicación de alto rendimiento de la SAA para revelar los efectos genéticos de fondo en la farmacodinámica del isoflurano Como ejemplo del alto rendimiento del sistema, la Figura 3 ilustra los efectos de exposiciones idénticas al isoflurano (15 min de isoflurano al 2%) antes de la lesión cerebral traumática (LCT)16, un protocolo que prueba el preacondicionamiento anestésico (AP) en este modelo de mosca13,15,19. La lectura es mortalidad 24 h después de la LCT corregida por desgaste natural (MI24). En este modelo, todas las moscas recuperaron la movilidad (es decir, estaban vivas) dentro de los 30 minutos después de la LCT, y la mortalidad registrada en el MI24 fue el resultado de una lesión cerebral secundaria (sBI). En las cuatro líneas de mosca, AP con isoflurano redujo el MI24 en varios grados, lo que indica que la capacidad de respuesta a AP es un rasgo cuantitativo. Como la respuesta inflamatoria es un factor importante en la morbilidad por BIS, la PA puede implicar la modulación del sistema inmune20.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65144/65144fig03.jpg"> Figura 3: Influencia de los antecedentes genéticos en la supresión de la mortalidad (MI24) mediante preacondicionamiento con isoflurano. Las moscas de preacondicionamiento con 15 min de isoflurano al 2% (púrpura) redujeron el índice de mortalidad a las 24 h (MI24) en las cepas w 1118 y 1w1118 (p < 0,0001 y p = 0,036, respectivamente). El IM 24 no fue significativamente menor en las líneas R (OR) y Canton S (CS) precondicionadas de Oregón (p = 0,16 y p = 0,27, respectivamente). Los datos se muestran como diagramas de caja y bigotes. Los cuadros representan el segundo y tercer cuartil de los datos, con los bigotes extendiéndose a los puntos de datos mínimos y máximos. La media y la mediana se indican con "+" y líneas horizontales, respectivamente. Los valores MI24 de las réplicas individuales (N) se muestran como círculos. N = 15-33 viales de 30-40 moscas/vial para moscas tratadas con LCT. N = 2-15 viales de 30-40 moscas/vial para controles no tratados. Valores p de una prueba t de Student no pareada y de dos colas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65144/65144fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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The Serial Anesthesia Array for the High-Throughput Investigation of Volatile Agents Using Drosophila melanogaster

La mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) es ampliamente utilizada para la investigación biológica y toxicológica. Para ampliar la utilidad de las moscas, desarrollamos un instrumento, el serial anesthesia array, que expone simultáneamente múltiples muestras de moscas a anestésicos generales volátiles (VGA), lo que permite investigar los efectos colaterales (tóxicos y protectores) de los VGA.

La matriz de anestesia en serie para la investigación de alto rendimiento de agentes volátiles utilizando Drosophila melanogaster

Volatile general anesthetics (VGAs) are used worldwide on millions of people of all ages and medical conditions. High concentrations of VGAs (hundreds of ...

El SAA permite un procesamiento de alto rendimiento para investigar la farmacología de agentes volátiles en organismos modelo de invertebrados que están dotados de un cerebro sofisticado y un vasto repertorio de comportamientos. En combinación con la caja de herramientas genéticas disponible en Drosophila melanogaster, esta técnica permite estudiar la farmacogenética de los agentes volátiles de forma rápida y asequible. Muchas personas están expuestas a agentes volátiles como contaminantes o agentes terapéuticos.Además de la anestesia, los anestésicos volátiles tienen numerosos efectos colaterales tóxicos y beneficiosos. El grado de efecto está determinado en parte por la genética, que ha permanecido en gran parte inexplorada. Después de hacer el marco de madera, modifique las tapas del tubo de crónica de 50 mililitros perforando dos agujeros en cada tapa con una broca de 9/32 pulgadas.Lija los agujeros para limpiar el plástico irregular. También lija la parte superior de la tapa para rugosear la superficie. Luego corte cinco pipetas serológicas de mililitros a medida marcando el plástico y rompiéndolo limpio en la línea marcada.Lijar los extremos de las pipetas cortadas o rotas. Después, pegue la red a los tubos y corte la red al tamaño del tubo una vez que el adhesivo se seque. Inserte los tubos en los orificios de las tapas cónicas con ambos tubos extendiéndose por encima de la tapa.Asegúrese de que el tubo de entrada se extienda más tiempo en el tubo que el flujo de salida. Aplique pegamento en la parte superior de las tapas alrededor de los tubos para asegurar las partes juntas y dejar que se sequen. Fije los amarres de cables adhesivos al marco.Fije las tapas al marco con bridas y corte los extremos de la etiqueta de corbata de cremallera. Corte y conecte la longitud del tubo tygon a los tubos de entrada y salida en cada tapa modificada. Comenzando en el extremo aguas arriba, conecte el tubo primero a la entrada, luego desde la salida a la entrada de la posición posterior.A continuación, agregue un indicador de flujo a la mayor cantidad de flujo aguas abajo. Coloque un tubo cónico de 50 mililitros en la primera posición y marque la marca de llenado de agua. Retire el tubo.Llénelo con agua debajo del tubo de entrada y vuelva a colocarlo en su posición. Prepara la interfaz para el vaporizador. Retire los émbolos, corte las muescas de dos jeringas dispensadoras de 10 mililitros e insértelas en la entrada y salida del vaporizador con las muescas orientadas directamente hacia la parte delantera del vaporizador para alinearlas con los orificios.Conecte todo el sistema. Use tubos tygon para conectar el tanque de gas portador con el regulador, el medidor de flujo específico de gas, el vaporizador y la SAA. Llene las posiciones vacías en la matriz con tubos de crónica vacíos de 50 mililitros.Ahora encienda el tanque de gasolina. Abra el medidor de flujo a dos litros por minuto y encienda el vaporizador al 0%Confirme el flujo de gas a través del sistema verificando el medidor de flujo aguas arriba del vaporizador y el indicador de flujo aguas abajo de la última cámara de la SAA para el flujo. Alternativamente, inserte el extremo del tubo aguas abajo en el agua y busque burbujas.24 horas o más antes de la exposición anestésica clasifique las cohortes de moscas según sea necesario para el experimento utilizando el método preferido. Transfiera las moscas de los viales de alimentos a tubos cónicos vacíos de 50 mililitros. Cuente y registre cualquier mosca muerta antes de la exposición.Destapar y atornillar tubos cónicos de 50 mililitros con moscas en el SAA. Encienda el gas portador y configúrelo al caudal deseado. Ajuste el vaporizador anestésico a la concentración deseada y exponga las moscas durante el tiempo deseado.Al final de la exposición, enjuague el sistema con el flujo de gas fresco a 1,5 litros por minuto durante cinco minutos, lo que corresponde a aproximadamente 10 veces los volúmenes del volumen total de SAA. Abra completamente el regulador de alta presión y ciérrelo media vuelta para garantizar el flujo de gas portador. Siga los tubos de cada línea hasta los medidores de flujo y el vaporizador, y verifique el nivel de anestesia en los vaporizadores.Confirme que cuando el gas fluye, indica el flujo en el medidor de flujo y en el indicador de flujo aguas abajo. Al final del experimento, permita de cuatro a cinco minutos de flujo de aire para lavar el anestésico. Siete líneas aisladas de una sola población a través de reuniones de un solo par mostraron variación en la mortalidad inducida por la toxicidad del flúor iso debido a la presión evolutiva en moscas ND23 60114.Las moscas de preacondicionamiento con 15 minutos de flúor 2% iso antes de la lesión cerebral traumática redujeron el índice de mortalidad a las 24 horas en cepas blancas 1118 y amarillas / blancas. El índice de mortalidad a las 24 horas no fue significativamente menor en las líneas R y Canton S precondicionadas. Durante el montaje, las muescas de las jeringas modificadas deben alinearse con los orificios de los puertos del vaporizador.Durante la exposición, verifique periódicamente que haya flujo a través del sistema. Este procedimiento se puede seguir para una amplia variedad de estudios conductuales, de supervivencia y moleculares que podrían conducir a conocimientos sobre la farmacología de los agentes volátiles.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Serial Anesthesia Array for the High-Throughput Investigation of Volatile Agents Using Drosophila melanogaster

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

De alto rendimiento de aislamiento robótica asistida sensible a la temperatura del letal mutantes en<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

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Investigación

Genética

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