Virusinfektionen sind hochdynamisch, und herkömmliche Endpunkt-Assays in der Virologie haben die Einschränkung, dass ein gewählter Endpunkt zu verpassten Informationen führen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es mit zellbasierter elektrischer Impedanz möglich ist, eine Virusinfektion und die Aktivität antiviraler Verbindungen in Echtzeit zu verfolgen. Dieses Verfahren wird von Eef Meyen, einem Laboranten aus unserem Labor, demonstriert.
Bereiten Sie zunächst die CEI-Platte vor, indem Sie eine auf interdigitalisierten Elektroden basierende 96-Well-Platte nehmen. Geben Sie 100 Mikroliter Nährmedium in jede Vertiefung und füllen Sie die Zwischenräume zwischen den Vertiefungen mit DPBS. Dann inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Um die A549-Zellen zu besiedeln, lösen Sie sie wie im Manuskript beschrieben aus dem Kulturkolben und resuspendieren Sie sie in frischem Nährmedium. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen und verdünnen Sie sie in frischem Nährmedium, um die gewünschte Zelldichte zu erhalten.
Nach der Inkubation wird das Nährmedium mit einer Mehrkanalpipette von der 96-Well-Platte entfernt. Dosieren Sie 100 Mikroliter Zellsuspension pro Well. Sobald die Zellen ausgeglichen sind, legen Sie die Platte in das CEI-Gerät, um den CEI-Assay einzurichten und durchzuführen.
Öffnen Sie die Software des Geräts, und klicken Sie im Bereich Daten sammeln auf Setup, um ein neues Experiment festzulegen. Schließen Sie einen Laptop an das ECIS-Gerät an. Konfigurieren Sie die Platte, indem Sie die Impedanzen der Vertiefungen überprüfen, die durch eine grüne Farbe angezeigt werden.
Wählen Sie im Bereich Well-Konfiguration den Array-Typ entsprechend der verwendeten Cultureware aus und klicken Sie auf den Zeitmodus Multiple Frequency. Starten Sie dann die Messung, indem Sie auf Start drücken. Halte die Mischung auf Eis.
Nehmen Sie die 10-fach konzentrierte Verdünnung mit einem äquilibrierten Assaymedium in einem Fünf-Milliliter-Polypropylenröhrchen vor und fügen Sie dann die Verbindung hinzu. Klicken Sie im Bereich Datenerfassungseinrichtung auf Anhalten, und nehmen Sie nach Abschluss des aktuellen Zeitpunkts die 96-Well-Platte heraus. Beobachten Sie die Adhärenz und Monolagenbildung der Zellen unter dem Lichtmikroskop.
Als nächstes saugen Sie mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung ab und geben Sie 20 Mikroliter Verbindungslösung oder Vehikel in die gewünschten Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 15 Minuten. Um die Virenlösung zuzubereiten, tauen Sie eine Durchstechflasche mit Virenbrühe auf.
Nach der Verdünnung mit dem gewünschten Trägheitsmoment in einem 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen wird Virusbestand hinzugefügt. Sobald die Virusverdünnung in den zugewiesenen Vertiefungen hinzugefügt wurde, werden 100 Mikroliter Assaymedium in die Zellkontrollvertiefungen gegeben. Dekontaminieren Sie dann die eingesetzten Virenbehälter.
Legen Sie die Platte wieder in das CEI-Gerät und klicken Sie auf Fortsetzen, um die Messungen an sechs aufeinanderfolgenden Tagen fortzusetzen. Um die Daten zu analysieren, klicken Sie auf Fertig stellen, um das Experiment zu beenden, und fügen Sie Enter Experiment Summary hinzu. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, wählen Sie OK aus. Wählen Sie die gewünschte Frequenz im Diagrammbereich aus.
Stellen Sie sicher, dass alle Wells im Bereich Well-Konfiguration ausgewählt sind, und klicken Sie auf Datei, dann auf Daten exportieren und dann auf Diagrammdaten, um die Daten in ein Tabellenkalkulationsformat zu exportieren. Der CEI-Assay zeigte, dass die Kinetik der Infektion stark vom Zelltyp abhängt und U87-Zellen nur bei hohen MOIs für eine Infektion mit dem Zika-Virus empfänglich sind. Die CEI-Assays zeigten auch eine ausgewachsene Zellmonoschicht bei hoher Zellaussaat und können sich nicht weiter über die CEI-Elektroden ausbreiten, was zu einem leichten Unterschied zwischen der Zellkontrolle und der Viruskontrolle führt.
Bei U87, einem größeren Zelltyp, könnte eine zu dichte Aussaat der Zellen zur vollständigen Ablösung der Zellmonoschicht geführt haben. Ein repräsentativer Zika-Virusstamm des afrikanischen MR766 in der asiatischen Linie PRVABC59 zeigte ähnliche CEI-Muster. PRVABC59 hat jedoch etwas langsamere zytopathische Wirkungsinduzierungen, was sich auch in den CIT50-Werten widerspiegelt.
Die Impedanzprofile von drei verschiedenen MOIs beider Zika-Virusstämme zeigten, dass die jeweilige Substanzkonzentration den durch eine Zika-Virusinfektion verursachten Impedanzabfall verzögerte. Der CEI-Test zeigte, dass die antivirale Aktivität von den MOI- und AUCN-Berechnungen abhängig war, die die IC50-Werte bestimmten. Die ausgewerteten CIT50-Werte zeigten Substanzpotenzen in der Kinetik des Zellwachstums und der Infektion.
CEI ist eine leistungsfähige Technologie zur Bewertung und Charakterisierung von Wirkstoffen gegen die Replikation des Zika-Virus in Echtzeit, markierungsfrei und nicht-invasiv.
