Name: live imaging of arabidopsis pollen tube reception and double fertilization using the semi-in vitro cum septum method
Uploaded: 2023-02-24T12:30:00
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我们感谢Sara Simonini和Stefano Bencivenga捐赠 pFG：roGFP2-ORP1-NLS 构建体，感谢Christof Eichenberger，Johann Almendinger，Vincent Sutter和Celia Baroux对显微镜的建议。我们衷心感谢拉维·帕拉尼维卢、菲利普·丹宁格、莎朗·凯斯勒、马克·约翰逊、川岛智和以及 2022 年有性植物繁殖国际会议上对 SIV 暨隔 膜协议表现出兴趣的其他人的建议。这项工作得到了苏黎世大学的支持和瑞士国家科学基金会对U.G的资助。

注意：有关此协议中使用的材料和设备的列表，请参阅 材料表 。
1. 设计成像实验的注意事项
<ol><li>预先确定捕获要观察的所需现象所需的成像持续时间和采样频率。例如，根据奈奎斯特采样定理，采样频率必须大于输入样本最高频率的两倍。因此，为了准确捕获协同[Ca 2+]cyt 振荡，大约每10秒进行一次成像，但要测量花粉管排出时?...

<ol>
	<li>Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+mutant+feronia+disrupts+the+female+gametophytic+control+of+pollen+tube+reception.">The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception.</a> Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).</li><li>Rotman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+control+of+male+gamete+delivery+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana.">Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).</li><li>Palanivelu, R., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+short-range+ovule+signals+attract+or+repel+Arabidopsis+thaliana+pollen+tubes+in+vitro.">Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro.</a> BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).</li><li>Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+F-actin+dynamics+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana.">Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).</li><li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Ca2++changes+dynamically+during+the+interaction+of+the+pollen+tube+with+synergid+cells.">Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells.</a> Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).</li><li>Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium+dialog+mediated+by+the+FERONIA+signal+transduction+pathway+controls+plant+sperm+delivery.">A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery.</a> Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).</li><li>Denninger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-female+communication+triggers+calcium+signatures+during+fertilization+in+Arabidopsis.">Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis.</a> Nature Communications. 5, 4645 (2014).</li><li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+calcium+spikes+during+double+fertilization+in+Arabidopsis.">Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis.</a> Nature Communications. 5, 4722 (2014).</li><li>Ponvert, N., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergid+calcium+ion+oscillations+define+a+new+feature+of+pollen+tube+reception+critical+for+blocking+interspecific+hybridization.">Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana.">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).</li></ol>

这份手稿介绍了拟 南芥花粉管接收和双重受精成像的有效方案。改进的方法SIV 暨隔膜大大提高了每个成像会话可观察到的成功花粉管接收事件的百分比和总数。此处显示的代表性结果展示了一个成像会话，其中有41个成功的花粉管接收事件和10个显示接收缺陷的胚珠（~80%效率）。这是使用原始 SIV 切除胚珠方法在总共 8 次成像会话中捕获的成功花粉管接收事件数量的两倍多（?...

有性繁殖生物中遗传上独特的后代的产生取决于雄性和雌性配子的成功融合。在开花植物中，两个雄配子（精子细胞）与两个雌配子（卵细胞和中央细胞）在双重受精过程中的相互作用取决于花粉管（雄配子体）释放的精子。这个过程称为花粉管接收，主要由驻留在胚胎囊（雌配子体）内的协同细胞控制1，2。由于花粉管接收发生在花的深处，因此已经建立了一种允许对该过程进行活细胞成像的方法，称为半体外（SIV）花粉管接收3。使用这种方法，将切除的拟南芥胚珠放置在半液体花粉萌发培养基上，并通过花粉管靶向，花粉管通过样式传递道连接处切断的雌蕊的柱头和样式生长3，4。自从这项技术发展以来，详细的观察导致了围绕花粉管引导、接收和受精的几个发现。其中，这些发现包括通过柱头生长获得花粉管靶向能力3，花粉管到达时协同细胞内钙振荡的开始5，6，7，8，9，以及花粉管破裂时精子细胞释放和受精的动力学10.然而，由于这种技术依赖于胚珠的切除，受精的观察数量有限，花粉管接收往往异常，导致花粉管破裂失败（视频1和补充文件1）。因此，需要一种更有效的方法，以便对花粉管接收和受精进行高通量分析。
在制定该协议时，测试了几种分析花粉管接收的新方法，从最“体外”到最“体内”的方法，并确定了基于整个隔膜切除的有效技术，该技术允许每天多达40次受精观察。在这里，概述了该技术的细微差别和关键点，包括花分期、解剖、培养基制备和成像设置。通过遵循该协议，应促进以花粉管引导，花粉管接收和双重受精为重点的研究。该方法允许的样本量越大，预计将增强从实时成像实验中得出的结论的科学合理性。该技术的潜在应用包括但不限于通过使用遗传编码的生物传感器观察配子体相互作用期间胞质钙浓度（[Ca2+]cyt），pH或H 2 O2的分子和生理变化。此外，使用这种改进的方法可以更容易地观察到细胞学变化，例如感受协同作用的退化，精子细胞迁移或核瑜伽。最后，可以在宽场显微镜下监测不同施肥阶段的时间，然后可以使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或双光子激发显微镜（2PEM）进行更详细的分析，以获得更高的分辨率和3D重建。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm glass slide&#160;</td>
			<td>Epredia&#160;</td>
			<td>16211551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dish (14 mm well)</td>
			<td>Mattek&#160;</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride&#160;</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>CN93.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbia (Col-0)&#160;</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td>stigma donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>SZX2-ILLT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin needle (0.3 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Landsberg erecta (Ler-0)&#160;</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td>septum donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Beldura</td>
			<td>7026797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch double sided tape&#160;</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>768720</td>
			<td>Less thick and good for stigma dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ITW reagents</td>
			<td>A2211,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tesa double sided tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>05681-00018</td>
			<td>Very sticky and good for septum dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low gelling temperature agarose</td>
			<td>FMC SeaPrep</td>
			<td>50302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of arabidopsis pollen tube reception and double fertilization using the semi-in vitro cum septum method

在开花植物中，雌蕊内花粉管（雄配子体）的生长和引导以及雌配子体对花粉管的接收对于双重受精和随后的种子发育至关重要。在花粉管接收过程中，雄性和雌配子体之间的相互作用最终导致花粉管破裂和两个精子细胞的释放以实现双重受精。由于花粉管生长和双重受精深深地隐藏在花的组织中，这个过程在 体内很难观察到。
在几项研究中，已经开发并实施了用于模式植物拟南芥受精活细胞成像的半体外（SIV）方法。这些研究有助于阐明开花植物受精过程的基本特征，以及在雄性和雌配子体相互作用期间发生哪些细胞和分子变化。然而，由于这些活细胞成像实验涉及单个胚珠的切除，因此每次成像会话的观察次数很少，这使得这种方法既乏味又非常耗时。除其他技术困难外，经常报告花粉管未能在体外使胚珠受精，这严重混淆了这种分析。
在这里，提供了一个详细的视频协议，用于以自动化和高通量的方式对花粉管接收和受精进行成像，允许每次成像会话最多观察40次花粉管接收和破裂。结合使用基因编码的生物传感器和标记线，该方法能够以更少的时间投资生成大样本量。该技术的细微差别和关键点，包括花分期、解剖、培养基制备和成像，都以视频格式清晰详细，以促进未来对花粉管引导、接收和双重受精动力学的研究。

为了评估拟 南芥 中受性协同细胞核变性相对于花粉管破裂的时间，以及观察左协同作用或右协同作用是否注定要成为受体协同增效物，采用此处描述的SIV 暨隔膜 方法，使用雌配子体核标志物与协同胞质标志物（pFG：roGFP2-ORP1-NLS，pMYB98：roGFP2-ORP1）作为隔膜供体，雄配子体标记（pLAT52：R-GECO）作为花粉供体。根据协议的第4-5节，在阉割后24小时解剖隔膜和授粉柱头，并?...

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Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

在这里，我们描述了用于观察拟南芥花粉管引导和接收的半体外（SIV）方法的改进，该方法增加了胚珠的接受性。高通量SIV暨隔膜法可以与配子体标记系和遗传编码生物传感器相结合，以监测受精的动态过程。

拟 南芥 花粉管接收和半体外隔膜法 双受精的实时成像

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...

该方法将通过允许以高效率和每次成像的高样本量数量观察配子体相互作用来促进拟南芥有性生殖的研究。该技术的主要优点是通过将胚珠保持在隔膜上，胚珠的数量和接受性比以前的方法大大增加。解剖技术最初可能很困难，需要稳定的手。因此，建议在开始实验之前在阉割的雌蕊上练习几次。首先按照文中的说明制备花粉萌发培养基。琼脂完全融化后，将130微升培养基移液到35毫米玻璃底培养皿的14毫米孔中。旋转培养皿，直到培养基覆盖孔。使用移液管从培养皿中心吸出 40 微升培养基，留下 90 微升培养基。为确保培养基均匀冷却，请将培养皿在湿度室的铝块上冷却，然后将板在 4 摄氏度下存放过夜。在成像前的早晨，选择健康的拟南芥植物，这些植物最近开始作为隔膜供体和柱头供体产生。在阉割三期 12B 隔膜供体花和 12 期 12B 柱头供体花之前，去除花序上的老花，去除它们的雄蕊、萼片和花瓣。24小时后的早晨，用容易脱落花粉的花粉供体花朵为柱头供体授粉。当柱头几乎完全被花粉覆盖时，授粉完成。授粉后 30 分钟，取出蒂处健康成熟的隔膜供体雌蕊，并将其放入安装在载玻片上的新鲜双面粘性胶带中，柱头刚好贴在胶带边缘。使用新的胰岛素注射器针头的背面轻轻按压椎弓根和沿卵巢，将雌蕊牢固地固定在胶带上。去除阉割时残留的萼片、花瓣和雄蕊碎片。在立体镜下，使用胰岛素注射器针头在样式-卵巢连接处和卵巢-蒂连接处对每个心皮进行两次切口。然后沿着每个心皮的隔膜进行浅切口，并将卵巢壁剥离到胶带上，露出胚珠。在两个隔膜之间轻轻滑动针头，沿雌蕊的整个长度切割梅花，而不会干扰胚珠。然后在样式附近切割顶部隔膜，使整个隔膜抬起。接下来，使用镊子从椎弓根上取下隔膜。将隔膜尽可能平放在培养基上，胚珠的微绒面朝上。然后轻轻按压隔膜，直到胚珠略微嵌入培养基中。将授粉的柱头供体雌蕊放在安装在载玻片上的新鲜双面粘性胶带上，使卵巢式连接脱离胶带边缘。使用剃须刀片将款式直接向下切割，然后用刀片上的柱头将其抬起。用胰岛素注射器针头从刀片上去除柱头，并将其平放在距离胚珠约250至300微米处。转移多达 12 个柱头，在每个隔膜的两侧放置两个柱头。在显微镜上的湿度室中孵育后，在21摄氏度下保持92%相对湿度，培养皿即可成像。在低光强度的明场下聚焦样品，然后切换到荧光灯。接下来，在要成像的载物台概览上标记样品的区域。完成后，使用多级采集方案开始成像，在每个概览区域的开头具有自动对焦功能。孵育后大约七到九小时，检查花粉管是否被胚珠吸引并被胚珠接收。成功的花粉管接收显示胚珠微堆中的花粉管爆炸性爆发。完成后，停止收购。对半体外切除胚珠法进行了8次技术重复，并对成功接受花粉管进行了评分。绿色方块表示接收成功，红色方块表示接收有缺陷。这些实验表明，大约28%的胚珠显示爆炸性花粉管破裂，导致效率从大约10%到50%使用半体外暨隔膜方法，能够对更多的啤酒胚珠进行评分，并且在一次成像会话中记录了多达40个成功接收花粉管的实例，如在带有绿色方块的胚珠中看到的那样。该方法的五个技术重复表明，大约79%的吸引花粉管的胚珠表现出爆炸性花粉管破裂，导致效率从大约70%到100%在花粉管破裂时，观察到感受协同的细胞核同时降解，分辨率为一分钟。核瑜伽术后，观察到卵细胞核向微堆的迁移。左协同和右协同都能够作为接受协同作用。这种方法成功的关键因素是分期、使用新鲜制备的培养基、将胚珠嵌入培养基中、保持高湿度并确保低光毒性。还可以将这种技术与双光子激发成像相结合，以更仔细地观察配子体相互作用期间发生的生理和细胞学变化。人们也可以通过固定胚珠将其与电子显微镜相结合。

Research

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