该协议采用了一种简单的方法来简化培养步骤，获得高质量的外植体，并将有助于探索和揭示耳蜗细胞的分子机制。该技术的主要优点是通过协调解剖步骤、适当的聚合物表面涂层、优化的培养基体积和外植体的附着时间，最大限度地减少直接器官处理。该技术代表了一种流行的体外研究感音神经性听力损失的方法。
这可用于建立耳毒性模型、进行结构分析、评估信号通路和进行药物筛选研究。原则上，这种方法可以适用于不同的组织外植体。它也可以用于内耳研究，以深入了解胚胎发育阶段。
首先，将被斩首的大鼠头放在无菌垫上。用剪刀和镊子取出下颌骨，然后提起皮肤并将其从颅骨上剥离。将镊子放在眼眶腔中以固定颅骨。
使用锋利的手术刀刀片，小心地沿着矢状缝合线切割颅骨，然后沿着冠状缝合区域切割，而不会损坏耳蜗。现在，从两个头骨半部分取出大脑。在显微镜下，将耳蜗定位在颞骨中，并松弛耳蜗和颞骨之间的周围组织。
然后将镊子放在上半规管中。轻轻地将颞骨从耳蜗上拉开，并用颞骨握住附着在前庭的耳蜗。将镊子尖端插入可见白线的顶点区域，然后逐块取出软骨耳蜗囊以露出耳蜗管。
将镊子放在耳蜗下，将它们从前庭器官和颞骨上分离下来。将耳蜗转移到含有冰冷PBS的新的60毫米培养皿中。要分离Corti外植体器官，请将器官保持在基部，将耳蜗导管保持在基钩区域，然后轻轻地将耳蜗导管从modiolus上解开，而不会撕裂它。
然后握住底部的耳蜗导管，拉开螺旋韧带和血管纹。为了分离耳蜗外植体，使用镊子将螺旋神经节从骨螺旋层中分离出来，并在分离过程中松开耳蜗。用镊子抓住钩状区域，用血管纹去除螺旋韧带。
此外，一块一块地撕下 Reissner 的膜。要转移耳蜗外植体，请将实验室刮刀浸入含有外植体的培养皿中。挥动刮刀，将外植体与几微升的PBS一起抬起毛细胞朝上。
通过在培养基中轻轻挥动刮刀，将外植体放入八孔室载玻片中。让外植体滑入腔室。使用 100 微升移液器，取出 80 微升培养基并将其丢弃。
在显微镜下检查毛细胞和螺旋神经节神经元细胞的可见性。如有必要，使用镊子推开重叠的组织。从孔中取出剩余的培养基。
外植体现在将更平坦地躺在腔室表面。10 秒后，将一滴或两滴培养基移回外植体旁边，将剩余培养基移回一定距离以避免外植体脱落。确保外植体在添加培养基时不会移动。
孵育腔室两个小时，将器官牢固地固定在腔室底部。孵育后，吸出培养基。并使用 100 或 200 微升移液器，小心地加入 300 微升新鲜的预热完全培养基。
转盘共聚焦显微图像显示，在正常和应激条件下，大鼠外植体器官保持其结构和总长度。此外，扫描共聚焦显微镜展示了小鼠器官外植体的存活毛细胞以及经历细胞凋亡的毛细胞。该协议能够使用适当的细胞渗透性探针和转盘共聚焦显微镜监测活耳蜗细胞中的生物处理器。
这些耳蜗外植体的培养增强了对毛细胞和螺旋神经节细胞之间相互作用的分析。用毛细胞标志物MYO7A检测人工耳蜗的毛细胞。同样，使用神经元标记物 Tuj 1 鉴定健康和受损的螺旋神经节细胞体和神经突。
在放大的概览中，可以看到用MYO7A抗体标记的毛细胞的细胞体。鉴定了外毛细胞立体纤毛，以及用鬼笔环肽标记的单个内毛细胞立体纤毛的去卷积图像。在显微镜下进行手术时必须小心，尤其是在将螺旋神经节与骨螺旋层分离时。
完整的外植体应小心转移和对齐。该协议优化了对内耳外植体的体外研究。这些研究的结果，如信号通路和药物毒性，可以指导更进一步的体内研究的设计。
