Denne protokol inkorporerer en ligetil tilgang til at strømline dyrkningstrin, opnå eksplanter af høj kvalitet og vil bidrage til at udforske og afsløre molekylære mekanismer i cochlearceller. Den største fordel ved denne teknik er minimal direkte organhåndtering ved at koordinere dissektionstrinnene, passende polymeroverfladebelægning, optimeret mediumvolumen og fastgørelsestid for eksplanterne. Denne teknik repræsenterer en populær in vitro-tilgang til undersøgelse af sensorineuralt høretab.
Dette kan bruges til at etablere ototoksiske modeller, udføre strukturel analyse, evaluere signalveje og gennemføre lægemiddelscreeningsundersøgelser. I princippet kan denne metode gælde for forskellige vævsplanter. Det kan også anvendes i det indre øre forskning for at få indsigt i embryonale udviklingsstadier.
Til at begynde med skal du placere det halshuggede rottehoved på den sterile pude. Brug saks og tang til at fjerne underkæben, løft derefter huden og skræl den tilbage fra kraniet. Placer tangen i orbitalhulrummene for at holde kraniet.
Brug et skarpt skalpelblad til forsigtigt at skære kraniet langs sagittalsuturen og derefter det koronale suturområde uden at beskadige cochlea. Fjern nu hjernen fra de to kraniehalvdele. Under mikroskopet lokaliseres cochlea i den tidlige knogle og løsner det omgivende væv mellem cochlea og den tidlige knogle.
Placer derefter tangen i den overlegne halvcirkelformede kanal. Træk forsigtigt tindingebenet væk fra cochlea og hold cochlea fastgjort til vestibulen med den temporale knogle. Indsæt pincetspidserne i det øverste område, der er synligt som en hvid linje, og fjern den bruskagtige cochleakapsel stykke for stykke for at eksponere cochlearkanalen.
Placer tangen under cochlea, og løsn dem fra det vestibulære organ og den tidlige knogle. Overfør cochlea til en ny 60 millimeter skål indeholdende iskold PBS. For at isolere Corti eksplantatorganer skal du holde organet i bunden og cochlearkanalen i basalkrogområdet og forsigtigt slappe af cochlear duct fra modiolus uden at rive det.
Hold derefter cochlearkanalen i bunden og træk spiralbåndet og stria vascularis. For at isolere cochlear explants skal du bruge tang til at løsne spiralganglionen fra den osseøse spirallamina og slappe af modiolus under løsrivelsen. Med tang skal du tage fat i krogområdet og fjerne spiralbåndet med stria vascularis.
Træk yderligere Reissners membran af stykke for stykke. For at overføre cochlear explants skal du dyppe en laboratoriespatel i skålen, der indeholder eksplantatet. Løft eksplantatet med hårcellerne opad sammen med et par mikroliter PBS ved at vifte med en spatel.
Placer eksplantatet i et kammerglas med otte brønde ved forsigtigt at vifte spatlen i mediet. Lad eksplantatet glide ind i kammeret. Brug en 100 mikroliter pipette til at fjerne 80 mikroliter medium og kassér det.
Kontroller synligheden af hårceller og spiralganglion neuron celler under mikroskopet. Brug om nødvendigt tang til at skubbe overlappende væv fra hinanden. Fjern det resterende medium fra brønden.
Explant vil nu ligge fladere på overfladen af kammeret. Efter 10 sekunder pipetteres en eller to dråber af mediet tilbage lige ved siden af eksplantatet, og det resterende medium et stykke væk for at undgå frigørelse af eksplantat. Sørg for, at eksplanterne ikke bevæger sig, mens du tilføjer mediet.
Inkuber kammeret i to timer for at fastgøre organerne fast til kammerets bund. Efter inkubation aspireres mediet. Og brug en pipette på 100 eller 200 mikroliter til forsigtigt at tilføje 300 mikroliter frisk, forvarmet komplet medium.
De roterende skivekonfokale mikroskopiske billeder viste, at rotteorganet hos Corti explants bevarede deres struktur og samlede længde under både normale og stressede forhold. Derudover viste et scanningskonfokalmikroskop overlevende hårceller fra eksplanter fra museorganerne sammen med hårceller, der gennemgår apoptose. Protokollen muliggjorde overvågning af biologiske processorer i levende cochlear celler ved hjælp af passende cellegennemtrængelige sonder og et spindeskivekonfokalmikroskop.
Kulturen af disse cochlear explants forbedrer analysen af interaktionen mellem hårceller og spiralganglionceller. Hårcellerne i cochlear implantater blev påvist med hårcellemarkøren, MYO7A. På samme måde blev sunde og beskadigede spiralganglioncellelegemer og neuritter identificeret ved hjælp af neuronmarkøren, Tuj 1.
I den forstørrede oversigt var cellelegemerne i hårcellerne mærket med MYO7A-antistof synlige. Ydre hårcellestereocilia og dekonvoluerede billeder af individuelle indre hårcellestereocilier mærket med phalloidin blev identificeret. Der skal udvises forsigtighed under procedurerne under mikroskopet, især når spiralganglionen adskilles fra boney spiral lamina.
De intakte eksplantater skal overføres og justeres med omhu. Denne protokol optimerede in vitro-undersøgelser af eksplantater i det indre øre. Resultaterne af disse undersøgelser, såsom signalveje og lægemiddeltoksicitet, kan vejlede designet af yderligere in vivo-undersøgelser.
