यह प्रोटोकॉल संस्कृति चरणों को सुव्यवस्थित करने, उच्च गुणवत्ता वाले खोजों को प्राप्त करने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण शामिल करता है और कॉक्लियर कोशिकाओं के आणविक तंत्र की खोज और अनावरण में योगदान देगा। इस तकनीक का मुख्य लाभ विच्छेदन चरणों, उचित बहुलक सतह कोटिंग, अनुकूलित मध्यम मात्रा और खोजों के अनुलग्नक समय के समन्वय से न्यूनतम प्रत्यक्ष अंग हैंडलिंग है। यह तकनीक सेंसरिन्यूरल हियरिंग लॉस का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय इन-विट्रो दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है।
इसका उपयोग ओटोटॉक्सिक मॉडल स्थापित करने, संरचनात्मक विश्लेषण करने, सिग्नलिंग मार्गों का मूल्यांकन करने और दवा स्क्रीनिंग अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। सिद्धांत रूप में, यह विधि विभिन्न ऊतकों की खोजों पर लागू हो सकती है। भ्रूण के विकास के चरणों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इसे आंतरिक कान अनुसंधान में भी नियोजित किया जा सकता है।
शुरू करने के लिए, कटे हुए चूहे के सिर को बाँझ पैड पर रखें। जबड़ा हटाने के लिए कैंची और बल का उपयोग करें, फिर त्वचा को उठाएं और इसे खोपड़ी से वापस छील लें। खोपड़ी को पकड़ने के लिए कक्षीय गुहाओं में बल रखें।
एक तेज स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके, कोक्लेया को नुकसान पहुंचाए बिना खोपड़ी को सावधानीपूर्वक काट लें। अब, दो खोपड़ी के हिस्सों से मस्तिष्क को हटा दें। माइक्रोस्कोप के तहत, लौकिक हड्डी में कोक्लेया का स्थानीयकरण करें, और कोक्लेया और अस्थायी हड्डी के बीच आसपास के ऊतक को ढीला करें।
फिर बल को बेहतर अर्धवृत्ताकार नहर में रखें। धीरे से अस्थायी हड्डी को कोक्लेया से दूर खींचें और अस्थायी हड्डी के साथ वेस्टिब्यूल से जुड़े कोक्लेया को पकड़ें। शीर्ष क्षेत्र में बल युक्तियां डालें जो एक सफेद रेखा के रूप में दिखाई देती है, और कॉक्लियर डक्ट को उजागर करने के लिए कार्टिलाजिनस कॉक्लियर कैप्सूल के टुकड़े को टुकड़े-टुकड़े से हटा दें।
कोक्लेया के नीचे बल रखें, और उन्हें वेस्टिबुलर अंग और अस्थायी हड्डी से अलग करें। कोक्लेया को बर्फ-ठंडे पीबीएस युक्त एक नए 60-मिलीमीटर डिश में स्थानांतरित करें। कोर्टी खोज अंगों को अलग करने के लिए, आधार पर अंग और बेसल हुक क्षेत्र में कॉक्लियर डक्ट को पकड़ें, और धीरे से कोक्लियर डक्ट को फाड़े बिना मोडियोलस से आराम करें।
फिर आधार पर कॉक्लियर डक्ट को पकड़ें और सर्पिल लिगामेंट और स्ट्रिया संवहनी को दूर खींचें। कॉक्लियर एक्सप्लेंट को अलग करने के लिए, सर्पिल नाड़ीग्रन्थि को ओसेस सर्पिल लैमिना से अलग करने के लिए बल का उपयोग करें, और टुकड़ी के दौरान मोडियोलस को आराम दें। बल के साथ, हुक क्षेत्र को पकड़ें और स्ट्रिया संवहनी के साथ सर्पिल स्नायुबंधन को हटा दें।
इसके अलावा, रीसनर के झिल्ली के टुकड़े को टुकड़े-टुकड़े से खींचें। कॉक्लियर एक्सप्लेंट को स्थानांतरित करने के लिए, एक प्रयोगशाला स्पैटुला को खोज वाले पकवान में डुबोएं। स्पैटुला लहराकर पीबीएस के कुछ माइक्रोलीटर के साथ बालों की कोशिकाओं के साथ खोज को ऊपर उठाएं।
माध्यम में स्पैटुला को धीरे से लहराकर खोज को आठ-वेल चैंबर स्लाइड में रखें। खोज को कक्ष में स्लाइड करने की अनुमति दें। 100-माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके, 80 माइक्रोलीटर मध्यम निकालें और इसे छोड़ दें।
माइक्रोस्कोप के तहत बाल कोशिकाओं और सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन कोशिकाओं की दृश्यता की जांच करें। यदि आवश्यक हो, तो अतिव्यापी ऊतक को अलग करने के लिए बल का उपयोग करें। शेष माध्यम को कुएं से निकाल दें।
खोज अब कक्ष की सतह पर चापलूसी होगी। 10 सेकंड के बाद, पिपेट को खोज के ठीक बगल में माध्यम की एक या दो बूंदें वापस करें, और शेष माध्यम को कुछ दूरी पर छोड़ दें ताकि खोज अलगाव से बचा जा सके। सुनिश्चित करें कि माध्यम जोड़ते समय खोज ें आगे न बढ़ें।
अंगों को कक्ष के तल से मजबूती से जोड़ने के लिए कक्ष को दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें। और 100 या 200-माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके, ध्यान से ताजा, पूर्व-गर्म पूर्ण माध्यम के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें।
स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक छवियों से पता चला है कि कॉर्टी एक्सप्लेंट के चूहे के अंग ने सामान्य और तनावग्रस्त दोनों स्थितियों में अपनी संरचना और कुल लंबाई बनाए रखी। इसके अलावा, एक स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप ने एपोप्टोसिस से गुजरने वाली बाल कोशिकाओं के साथ-साथ चूहों के अंगों से खोजों की जीवित बाल कोशिकाओं का प्रदर्शन किया। प्रोटोकॉल ने उचित सेल पारगम्य जांच और एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जीवित कॉक्लियर कोशिकाओं में जैविक प्रोसेसर की निगरानी को सक्षम किया।
इन कॉक्लियर एक्सप्लेंट की संस्कृति बाल कोशिकाओं और सर्पिल गैंग्लियन कोशिकाओं के बीच बातचीत के विश्लेषण को बढ़ाती है। कॉक्लियर इम्प्लांट के बालों की कोशिकाओं का पता हेयर सेल मार्कर, MYO7A के साथ लगाया गया था। इसी तरह, न्यूरोनल मार्कर, टयूज 1 का उपयोग करके स्वस्थ और क्षतिग्रस्त सर्पिल गैंग्लियन सेल बॉडी और न्यूरॉइट्स की पहचान की गई थी।
आवर्धित अवलोकन में, MYO7A एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए बाल कोशिकाओं के सेल शरीर दिखाई दे रहे थे। बाहरी बाल कोशिका स्टीरियोसिलिया, और फेलोइडिन के साथ लेबल किए गए व्यक्तिगत आंतरिक बाल कोशिका स्टीरियोसिलिया की विकृत छवियों की पहचान की गई थी। माइक्रोस्कोप के तहत प्रक्रियाओं के दौरान देखभाल की जानी चाहिए, खासकर जब सर्पिल नाड़ीग्रन्थि को बोनी सर्पिल लैमिना से अलग किया जाता है।
बरकरार खोजों को स्थानांतरित किया जाना चाहिए और देखभाल के साथ संरेखित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल ने आंतरिक-कान खोजों पर इन-विट्रो अध्ययनों को अनुकूलित किया। इन अध्ययनों के परिणाम, जैसे सिग्नलिंग मार्ग और दवा विषाक्तता आगे के इन-विवो अध्ययनों के डिजाइन का मार्गदर्शन कर सकते हैं।
