Questo protocollo incorpora un approccio diretto per semplificare le fasi di coltura, ottenere espianti di alta qualità e contribuirà a esplorare e svelare i meccanismi molecolari delle cellule cocleari. Il vantaggio principale di questa tecnica è la minima manipolazione diretta degli organi coordinando le fasi di dissezione, l'appropriato rivestimento superficiale del polimero, il volume del mezzo ottimizzato e il tempo di attacco degli espianti. Questa tecnica rappresenta un popolare approccio in vitro per studiare l'ipoacusia neurosensoriale.
Questo può essere utilizzato per stabilire modelli ototossici, eseguire analisi strutturali, valutare le vie di segnalazione e condurre studi di screening farmacologico. In linea di principio, questo metodo può essere applicato a diversi espianti di tessuti. Può anche essere impiegato nella ricerca sull'orecchio interno per ottenere informazioni sulle fasi dello sviluppo embrionale.
Per iniziare, posiziona la testa del ratto decapitato sul tappetino sterile. Usa forbici e pinze per rimuovere la mandibola, quindi solleva la pelle e staccala dal cranio. Posiziona le pinze nelle cavità orbitali per tenere il cranio.
Usando una lama affilata per bisturi, tagliare con cura il cranio lungo la sutura sagittale e poi l'area di sutura coronale senza danneggiare la coclea. Ora, rimuovi il cervello dalle due metà del cranio. Al microscopio, localizzare la coclea nell'osso temporale e allentare il tessuto circostante tra la coclea e l'osso temporale.
Quindi posizionare la pinza nel canale semicircolare superiore. Allontanare delicatamente l'osso temporale dalla coclea e tenere la coclea attaccata al vestibolo con l'osso temporale. Inserire le punte delle pinze nella regione apicale che è visibile come una linea bianca e rimuovere la capsula cocleare cartilaginei pezzo per pezzo per esporre il dotto cocleare.
Posiziona le pinze sotto la coclea e staccale dall'organo vestibolare e dall'osso temporale. Trasferisci la coclea in un nuovo piatto da 60 millimetri contenente PBS ghiacciato. Per isolare gli organi di espianto di Corti, tenere l'organo alla base e il dotto cocleare nella regione dell'uncino basale e srotolare delicatamente il dotto cocleare dal modiolo senza strapparlo.
Quindi tenere il dotto cocleare alla base ed estrarre il legamento a spirale e la stria vascolare. Per isolare gli espianti cocleari, utilizzare una pinza per staccare il ganglio spirale dalla lamina ossea a spirale e svolgere il moiolo durante il distacco. Con una pinza, afferrare la regione dell'uncino e rimuovere il legamento a spirale con la stria vascolare.
Inoltre, stacca la membrana di Reissner pezzo per pezzo. Per trasferire gli espianti cocleari, immergere una spatola da laboratorio nel piatto contenente l'espianto. Sollevare l'espianto con le cellule ciliate rivolte verso l'alto insieme a qualche microlitro di PBS agitando una spatola.
Posizionare l'espianto in un vetrino a otto pozzetti agitando delicatamente la spatola nel substrato. Lasciare che l'espianto scivoli nella camera. Utilizzando una pipetta da 100 microlitri, rimuovere 80 microlitri di terreno e gettarlo.
Controllare la visibilità delle cellule ciliate e delle cellule dei neuroni gangliari a spirale al microscopio. Se necessario, utilizzare una pinza per allontanare il tessuto sovrapposto. Rimuovere il terreno rimanente dal pozzetto.
L'espianto si troverà ora più piatto sulla superficie della camera. Dopo 10 secondi, pipettare una o due gocce del terreno appena accanto all'espianto e il terreno rimanente a una certa distanza per evitare il distacco dell'espianto. Assicurarsi che gli espianti non si muovano durante l'aggiunta del terreno.
Incubare la camera per due ore per fissare saldamente gli organi al fondo della camera. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno. E usando una pipetta da 100 o 200 microlitri, aggiungere con cautela 300 microlitri di terreno completo fresco e preriscaldato.
Le immagini microscopiche confocali del disco rotante hanno mostrato che gli espianti dell'organo di Corti del ratto hanno mantenuto la loro struttura e la loro lunghezza totale sia in condizioni normali che stressate. Inoltre, un microscopio confocale a scansione ha dimostrato la sopravvivenza di cellule ciliate di espianti dagli organi dei topi insieme a cellule ciliate sottoposte ad apoptosi. Il protocollo ha consentito il monitoraggio di processori biologici in cellule cocleari viventi utilizzando sonde permeabili cellulari appropriate e un microscopio confocale a disco rotante.
La coltura di questi espianti cocleari migliora l'analisi dell'interazione tra cellule ciliate e cellule gangliari spirali. Le cellule ciliate degli impianti cocleari sono state rilevate con il marcatore delle cellule ciliate, MYO7A. Allo stesso modo, i corpi cellulari e i neuriti del ganglio a spirale sani e danneggiati sono stati identificati utilizzando il marcatore neuronale, Tuj 1.
Nella panoramica ingrandita, erano visibili i corpi cellulari delle cellule ciliate marcate con l'anticorpo MYO7A. Sono state identificate stereociglia delle cellule ciliate esterne e immagini decontorte di singole stereociglia delle cellule ciliate interne marcate con falloidina. È necessario prestare attenzione durante le procedure al microscopio, soprattutto quando si separa il ganglio spirale dalla lamina a spirale ossea.
Gli espianti intatti devono essere trasferiti e allineati con cura. Questo protocollo ha ottimizzato gli studi in vitro sugli espianti dell'orecchio interno. I risultati di questi studi, come le vie di segnalazione e la tossicità dei farmaci, possono guidare la progettazione di ulteriori studi in vivo.
