このプロトコルは、培養ステップを合理化し、高品質の外植片を得るための簡単なアプローチを組み込んでおり、蝸牛細胞の分子メカニズムの探索と解明に貢献します。この技術の主な利点は、解剖ステップ、適切なポリマー表面コーティング、最適化された培地容量、および外植片の付着時間を調整することにより、臓器の直接的な取り扱いが最小限に抑えられることです。この手法は、感音難聴を研究するための一般的なin vitroアプローチを表しています。
これは、耳毒性モデルの確立、構造解析の実行、シグナル伝達経路の評価、および薬物スクリーニング研究の実施に使用できます。原理的には、この方法は異なる組織外植片に適用できます。また、胚発生段階に関する洞察を得るために、内耳の研究にも使用できます。
まず、斬首したネズミの頭を滅菌パッドの上に置きます。はさみと鉗子を使用して下顎骨を取り除き、皮膚を持ち上げて頭蓋骨から剥がします。鉗子を眼窩腔に置き、頭蓋骨を保持します。
鋭利なメスの刃を使用して、蝸牛を傷つけることなく、矢状縫合糸に沿って頭蓋骨を慎重に切断し、次に冠状縫合領域を切断します。次に、2つの頭蓋骨の半分から脳を取り除きます。顕微鏡下で、蝸牛を側頭骨に局在させ、蝸牛と側頭骨の間の周囲の組織を緩めます。
次に、鉗子を上半規管に配置します。側頭骨を蝸牛からそっと引き離し、前庭に取り付けられた蝸牛を側頭骨で保持します。白い線で見える頂点領域に鉗子の先端を挿入し、軟骨性蝸牛嚢を少しずつ取り外して蝸牛管を露出させます。
鉗子を蝸牛の下に置き、前庭器官と側頭骨から切り離します。蝸牛を氷冷PBSを含む新しい60mmディッシュに移します。皮質外植器官を分離するには、器官を基部に、蝸牛管を基底鉤部に保持し、蝸牛管を引き裂かずにモディオルスからそっと巻き戻します。
次に、蝸牛管の基部を保持し、らせん靭帯と線条血管を引き離します。蝸牛外植片を分離するには、鉗子を使用して骨のらせん状椎弓層かららせん神経節を剥離し、剥離中にモディオルスをほどきます。鉗子でフック領域をつかみ、線条血管でらせん靭帯を取り除きます。
さらに、ライスナーの膜を少しずつ引き剥がします。蝸牛外植片を移植するには、外植片の入った皿に実験用スパチュラを浸します。ヘラを振って、有毛細胞を上に向け、数マイクロリットルのPBSと一緒に外植片を持ち上げます。
培地でスパチュラを静かに振って、外植片を8ウェルチャンバースライドに入れます。外植片をチャンバーにスライドさせます。100マイクロリットルのピペットを使用して、80マイクロリットルの培地を取り出し、廃棄します。
有毛細胞とらせん神経節ニューロン細胞の視認性を顕微鏡で確認します。必要に応じて、鉗子を使用して重なり合う組織を押し離します。残りの培地をウェルから取り出します。
これで、外植片がチャンバーの表面に平らになります。10秒後、外植片のすぐ隣に培地を1〜2滴戻し、残りの培地は少し離れたところにピペットで戻して、外植片の剥離を防ぎます。培地を添加している間、外植片が動かないようにしてください。
チャンバーを2時間インキュベートして、臓器をチャンバーの底にしっかりと取り付けます。インキュベーション後、培地を吸引します。また、100マイクロリットルまたは200マイクロリットルのピペットを使用して、300マイクロリットルの新鮮な予熱した完全な培地を慎重に加えます。
回転する円盤の共焦点顕微鏡画像は、ラットのコルチ外植片器官が、通常の条件下とストレス条件の両方において、その構造と全長を維持していることを示しました。さらに、走査型共焦点顕微鏡では、マウスの臓器から出た外植片の有毛細胞と、アポトーシスを起こした有毛細胞が生き残っていることが示されました。このプロトコルにより、適切な細胞透過性プローブと回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して、生きた蝸牛細胞の生物学的プロセッサのモニタリングが可能になりました。
これらの蝸牛外植片の培養は、有毛細胞とらせん神経節細胞の間の相互作用の解析を強化します。人工内耳の有毛細胞は、有毛細胞マーカーMYO7Aで検出されました。同様に、健康な螺旋神経節細胞体と損傷した螺旋神経節細胞体および神経突起を、ニューロンマーカーTuj 1を用いて同定した。
拡大した概要では、MYO7A抗体で標識された有毛細胞の細胞体が見えました。外側の有毛細胞の立体繊毛、およびファロイジンで標識された個々の内側の有毛細胞の立体繊毛のデコンボリューション画像が同定されました。顕微鏡下での処置中、特に骨のらせん状螺旋状椎弓から螺旋神経節を分離する場合は注意が必要です。
無傷の外植片は、慎重に移し、位置合わせする必要があります。このプロトコルは内耳のexplantsの生体外調査を最大限に活用した。シグナル伝達経路や薬物毒性などのこれらの研究の結果は、より詳細な生体内研究の設計を導くことができます。
