Denne protokollen inkorporerer en enkel tilnærming for å strømlinjeforme kulturtrinn, oppnå eksplanter av høy kvalitet og vil bidra til å utforske og avdekke molekylære mekanismer i cochleaceller. Den største fordelen med denne teknikken er minimal direkte organhåndtering ved å koordinere disseksjonstrinnene, passende polymeroverflatebelegg, optimalisert mediumvolum og festetid for eksplantene. Denne teknikken representerer en populær in vitro-tilnærming for å studere sensorinevralt hørselstap.
Dette kan brukes til å etablere ototoksiske modeller, utføre strukturell analyse, evaluere signalveier og gjennomføre narkotikascreeningsstudier. I prinsippet kan denne metoden gjelde for forskjellige vev eksplanter. Det kan også brukes i indre øreforskning for å få innsikt i embryonale utviklingsstadier.
For å begynne, plasser den halshuggede rottehodet på den sterile puten. Bruk saks og tang for å fjerne mandibelen, løft deretter huden og skrell den tilbake fra skallen. Plasser tangen i banehulene for å holde skallen.
Bruk et skarpt skalpellblad, kutt forsiktig skallen langs sagittal suturen og deretter koronal suturområdet uten å skade cochlea. Fjern nå hjernen fra de to hodeskallehalvdelene. Under mikroskopet, lokaliser cochlea i temporal bein, og løsne det omkringliggende vevet mellom cochlea og temporal bein.
Legg deretter tangen i den overlegne halvcirkelformede kanalen. Trekk forsiktig tinningbenet bort fra sneglehuset og hold sneglehuset festet til vestibylen med tinningbenet. Sett tangspissene inn i apex-området som er synlig som en hvit linje, og fjern den bruskaktige cochleakapselen bit for bit for å eksponere cochleakanalen.
Plasser tangen under cochlea, og løsne dem fra vestibulært organ og temporal bein. Overfør sneglehuset til en ny 60 millimeter tallerken som inneholder iskald PBS. For å isolere Corti explant-organer, hold orgelet ved basen og cochleakanalen i basalkrokområdet, og slapp forsiktig av cochleakanalen fra modiolusen uten å rive den.
Hold deretter cochleakanalen i bunnen og trekk bort spiralligamentet og stria vascularis. For å isolere cochlear explants, bruk tang for å løsne spiralganglion fra den osseous spiral lamina, og slapp av modiolus under løsningen. Med tang, ta tak i krokregionen og fjern spiralligamentet med stria vascularis.
Videre trekker du av Reissners membran bit for bit. For å overføre cochlear explants, dypp en laboratoriespatel i parabolen som inneholder eksplanten. Løft eksplanten med hårcellene vendt opp sammen med noen mikroliter PBS ved å vifte med en slikkepott.
Plasser eksplanten i et åtte-brønns kammerlysbilde ved å vifte forsiktig med spatelen i mediet. La eksplanten gli inn i kammeret. Bruk en 100 mikroliter pipette, fjern 80 mikroliter medium og kast den.
Sjekk synligheten av hårceller og spiral ganglion neuron celler under mikroskopet. Bruk om nødvendig tang for å skyve fra hverandre overlappende vev. Fjern det gjenværende mediet fra brønnen.
Eksplanten vil nå ligge flatere på overflaten av kammeret. Etter 10 sekunder pipetterer du tilbake en eller to dråper av mediet like ved siden av eksplanten, og det gjenværende mediet et stykke unna for å unngå eksplantasjonsløsning. Forsikre deg om at eksplantene ikke beveger seg mens du legger til mediet.
Inkuber kammeret i to timer for å feste organene fast til kammerets bunn. Etter inkubasjon, aspirer mediet. Og bruk en 100 eller 200 mikroliter pipette, tilsett forsiktig 300 mikroliter friskt, forvarmet komplett medium.
Den spinnende skiven konfokale mikroskopiske bilder viste at rotteorganet til Corti-eksplanter opprettholdt sin struktur og totale lengde under både normale og stressede forhold. I tillegg viste et skanning konfokalmikroskop overlevende hårceller av eksplanter fra musorganene sammen med hårceller som gjennomgår apoptose. Protokollen muliggjorde overvåking av biologiske prosessorer i levende cochleaceller ved bruk av passende cellepermeable prober og et konfokalmikroskop med spinnskive.
Kulturen til disse cochlea-eksplantene forbedrer analysen av samspillet mellom hårceller og spiralganglionceller. Hårcellene i cochleaimplantater ble påvist med hårcellemarkøren, MYO7A. På samme måte ble sunne og skadede spiralganglioncellelegemer og nevritter identifisert ved hjelp av nevronmarkøren, Tuj 1.
I den forstørrede oversikten var cellelegemene i hårcellene merket med MYO7A-antistoff synlige. Ytre hårcellestereocilier og deconvoluted bilder av individuelle indre hårcellestereocilia merket med falloidin ble identifisert. Det må utvises forsiktighet under prosedyrene under mikroskopet, spesielt når du separerer spiralganglion fra boney spiral lamina.
De intakte eksplantene skal overføres og justeres med forsiktighet. Denne protokollen optimaliserte in vitro-studier på eksplanter i det indre øret. Resultatene av disse studiene, som signalveier og legemiddeltoksisitet, kan lede utformingen av lengre in vivo-studier.
