Name: whole neonatal cochlear explants as an in vitro model
Uploaded: 2023-07-28T12:00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer ao Animal Facility do Departamento de Biomedicina da Universidade de Basileia por seu apoio no cuidado animal, às Microscopy Core Facilities, bem como ao Serviço de Tecnologia da Informação do Departamento de Biomedicina por sua assistência técnica, e à Swiss National Science Foundation (SNSF) pelo apoio financeiro (bolsa MD-PhD para M.C., Processo nº 323530_191222).

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos do Comitê de Bem-Estar Animal do Cantão Basel City, Suíça. Camundongos C57BL/6JR pós-natais, ratos Wistar e camundongos deficientes em STAT1 (mistos C57BL/6-129/SvEv)7 com idade entre 3-5 dias e de ambos os sexos foram usados para os experimentos.
1. Revestimento das câmaras multipoços
<ol><li>Preparar meio de cultura completo.<ol><li>Para órgão de explantes de Corti, preparar meio contendo meio de Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS), 25 mM de HEPES e 30 U/mL de penicilina.</li>
		<li>Para órgão de explantes de Corti e explantes cocleares, preparar um meio contendo DMEM/F12, 1x suplemento N2, 1x B27 menos antioxidantes e 30 U/mL de penicilina.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar uma solução-mãe de poli-D-lisina adicionando 10 mL de água de cultura celular a 5 mg de poli-D-lisina em um capuz laminar. A concentração final de poli-D-lisina é de 0,5 mg/mL. NOTA: Aliquot a solução de estoque restante e armazenar a -20 °C.<ol><li>Preparar soluções de trabalho de poli-D-lisina diluindo a solução-mãe 1:10 em água estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Revestir uma câmara de 8 poços com 150 μL/poço de solução de trabalho de poli-D-lisina e incubar por 30 min à temperatura ambiente. NOTA: Se for utilizada uma câmara de 4 poços, revestimento com 300 μL/poço de solução de trabalho de poli-D-lisina.</li>
	<li>Aspirar a solução por vácuo ou pipetagem.</li>
	<li>Lavar 2x com 200 μL de água estéril e uma vez com 200 μL de meio de cultura completo ou DMEM.</li>
	<li>Adicionar 150 μL de meio de cultura completo a cada poço. NOTA: Se for utilizada uma câmara de 4 poços, adicionar 250 μL/poço de meio de cultura completo.</li>
	<li>Colocar a câmara na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 durante, pelo menos, 30 minutos antes de colocar um explante.</li>
</ol>2. Dissecção do osso temporal
<ol><li>Desinfetar a mesa cirúrgica com etanol 70% e esterilizar todos os instrumentais em esterilizador de microesferas de vidro.</li>
	<li>Coloque uma placa de Petri estéril de 60 mm em um balde contendo gelo.</li>
	<li>Despeje alguns mililitros de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e mantenha-a no gelo. NOTA: Use penicilina 30 U/mL em 1x PBS para evitar contaminação bacteriana.</li>
	<li>Coloque uma almofada estéril em uma bandeja estéril e decapite rapidamente o filhote com uma tesoura de operação. Submergir a cabeça em etanol 70% por 5s, se a contaminação for um evento frequente. NOTA: Este protocolo foi testado para camundongos e ratos com idade P3-P5. Os tecidos cocleares são mais difíceis de dissecar de camundongos e ratos mais velhos, e a sobrevivência dos explantes em cultura é limitada.</li>
	<li>Coloque a cabeça do animal em uma almofada estéril. Retire a mandíbula. Levante a pele e retire-a do crânio.</li>
	<li>Segure o crânio colocando a pinça nas cavidades orbitárias.</li>
	<li>Corte cuidadosamente o crânio ao longo da sutura sagital e, em seguida, corte na área de sutura coronal com uma lâmina de bisturi afiada sem danificar a cóclea. OBS: Evite aplicar muita pressão, e evite movimentos para frente e para trás com o bisturi, pois isso pode danificar o osso coclear e, consequentemente, o ducto coclear.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o cérebro das duas metades do crânio.</li>
	<li>Transfira as metades do crânio para uma placa de Petri de 60 mm com o PBS gelado preparado na etapa 2.3.</li>
</ol>3. Isolamento da cóclea
<ol><li>Localizar a cóclea no osso temporal sob o microscópio. Coloque a pinça no canal semicircular superior.</li>
	<li>Solte o tecido circundante entre a cóclea e o osso temporal usando uma seringa de insulina (camundongos) ou pinça (ratos).</li>
	<li>Afastar cuidadosamente o osso temporal da cóclea, mantendo a cóclea aderida ao vestíbulo com o osso temporal. Certifique-se de que a cóclea está livre do tecido circundante antes de empurrar o osso temporal para o lado. NOTA: Aplicar muita força danificará o ducto coclear.</li>
	<li>Segure a cóclea em posição fixa e use a outra mão para remover cuidadosamente a cápsula cartilaginosa da cóclea. Insira cuidadosamente as pontas da pinça na região do ápice ou entre as espiras (visível como uma linha branca) e remova a cápsula peça por peça. Expor o ducto coclear.</li>
	<li>Coloque cuidadosamente a pinça sob a cóclea e a desconecte do órgão vestibular e do osso temporal.</li>
	<li>Transfira a cóclea para uma nova placa de 60 mm contendo PBS gelado.</li>
	<li>Ajustar a ampliação do microscópio para melhor visualização dos explantes.</li>
	<li>Siga os próximos passos para órgão de explantes de Corti:<ol><li>Segure o órgão na base com pinças. Remova suavemente o ducto coclear agarrando-o com pinça na região do gancho basal.</li>
		<li>Desenrole o ducto coclear do modíolo sem rasgá-lo.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o ligamento espiral com a estria vascular, segurando o órgão na base e puxando-os para longe. NOTA: A separação do tecido também pode ser obtida segurando a região do ápice em vez da região da base. Isso pode ser útil ao dissecar órgãos de ratos ou filhotes de camundongos mais velhos (>P5).</li>
		<li>Remova cuidadosamente a membrana de Reissner, segurando o órgão na base e retirando-o peça por peça. NOTA: Esta é uma etapa opcional, pois a membrana de Reissner não interfere na aquisição da imagem.</li>
	</ol></li>
	<li>Siga os próximos passos para os explantes cocleares:<ol><li>Separar o gânglio espiral da lâmina espiral óssea usando uma seringa de insulina (camundongos) ou pinça (ratos).</li>
		<li>Relaxe suavemente o modíolo durante o descolamento. OBS: Os explantes podem ser divididos em duas partes para melhor manuseio.</li>
		<li>Segure a região do gancho com pinças.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o ligamento espiral com a estria vascular, puxando-o.</li>
		<li>Remova cuidadosamente a membrana de Reissner, segurando o órgão na base e retirando-o peça por peça. NOTA: Esta etapa é recomendada, pois a membrana de Reissner geralmente dobra e cobre os filamentos dos neurônios e, portanto, pode afetar os experimentos.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Cultura de explantes cocleares
<ol><li>Transfira os explantes da placa de Petri para as câmaras de poços múltiplos. Levante os explantes com as células ciliadas viradas para cima usando uma espátula de laboratório. Inclua alguns microlitros de 1x PBS para evitar que as amostras grudem na espátula. NOTA: Explantes severamente danificados irão aderir à espátula.</li>
	<li>Deixe os explantes deslizarem da espátula para a câmara, agitando suavemente a espátula no meio. Coloque um explante por poço de uma lâmina de câmara de 8 poços. OBS: Se o explante grudar na espátula, segure a espátula no meio e use a pinça para desprender os explantes. Coloque sempre a pinça na borda interna do explante (longe das células ciliadas).</li>
	<li>Verifique ao microscópio se os explantes foram transferidos na orientação correta e colocados no centro dos poços. NOTA: Explantes mal orientados com células ciliadas voltadas para baixo tendem a mostrar uma forma de U para cima ao longo de sua largura. Corrija sua orientação movendo os explantes para os cantos das câmaras (mais meio disponível) e direcione-os para girar.</li>
	<li>Retire 80 μL do meio usando uma pipeta de 100 μL e elimine-o.</li>
	<li>Verifique ao microscópio se as células ciliadas e as células do gânglio espiral estão visíveis. Se necessário, use pinças para afastar suavemente algum tecido sobreposto.</li>
	<li>Retire o restante do meio e aguarde ~10 s.</li>
	<li>Pipetar o meio para trás. Adicione uma ou duas gotas do meio junto ao explante e o resto do meio a alguma distância do explante para evitar que o explante se desprenda. NOTA: Mesmo que os explantes estejam aderidos às câmaras, o meio deve ser sempre adicionado primeiro, pipetando-se uma a duas gotas junto aos explantes. Desta forma, os explantes não serão levantados quando a mídia completa restante for adicionada.</li>
	<li>Retorne a câmara para a incubadora e incube por 2 h para permitir que os órgãos se fixem firmemente ao fundo da câmara.</li>
	<li>Retire o meio e adicione cuidadosamente 300 μL de meio completo pré-aquecido fresco usando uma pipeta de 100 μL ou 200 μL. Não utilize uma pipeta de 1 ml. NOTA: Se um pré-tratamento for desejado, após 2 h de fixação, adicionar 300 μL de meio completo contendo a substância de interesse. Se for usada uma câmara de 4 poços, use até 500 μL/poço.</li>
	<li>Devolva as câmaras à incubadora.</li>
</ol>5. Teste de agentes ototóxicos
<ol><li>Deixe os explantes durante a noite para se adaptar às condições de cultivo e se recuperar.</li>
	<li>Preparar diferentes concentrações de agentes ototóxicos para encontrar a concentração adequada para estabelecer um modelo ototóxico com aproximadamente 50% de perda de células ciliadas. Utilizar entre 50 μM e 250 μM para gentamicina e entre 40 μM e 320 μM para cisplatina. Prepare as soluções de cisplatina frescas e proteja-as da luz.</li>
	<li>Retire o meio e adicione cuidadosamente 300 μL do meio contendo a droga ototóxica desejada.</li>
	<li>Incubar os explantes com gentamicina e cisplatina a 37 °C por 24 h a 48 h para determinar a sobrevivência das células ciliadas. NOTA: As concentrações do medicamento e o tempo de exposição são escolhidos dependendo do objetivo do estudo. A preservação dos explantes foi aqui testada até 72 h. Não use soro se estiver planejando realizar uma cultura de longo prazo.</li>
	<li>Siga a próxima seção para manchar as células cocleares.</li>
</ol>6. Fixação e imunofluorescência
<ol><li>Eliminar o meio ao final do experimento e lavar imediatamente os explantes com 200 μL de PBS 1x pré-aquecido.</li>
	<li>Fixar os explantes com 200 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% durante 15 minutos sob um exaustor químico. CUIDADO: PFA é um produto químico perigoso; leia a ficha de dados de segurança do material (MSDS) antes de trabalhar com a PFA pela primeira vez.</li>
	<li>Lavar os explantes duas vezes com 200 μL de 1x PBS. Conservar os explantes em 1x PBS a 4 °C caso os procedimentos de coloração precisem ser adiados.</li>
	<li>Preparar a solução de permeabilização composta por 1x PBS e 1%-5% Triton-X100.</li>
	<li>Descarte o PBS 1x, adicione 200 μL de solução de permeabilização e incube os explantes por 15 min.</li>
	<li>Prepare a solução de bloqueio.<ol><li>Para órgão de explantes de Corti, preparar solução de bloqueio consistindo de 1x PBS, 10% de soro de cabra normal (NGS, para anticorpos secundários de cabra, ou outro soro da mesma espécie que os anticorpos secundários). Alternativamente, use 1%-5% de albumina de soro bovino (BSA) se as células forem coradas apenas com faloidina.</li>
		<li>Para explantes cocleares, prepare uma solução de bloqueio composta por 1x PBS, 10% NGS e fragmento Fab (Fab fragment cabra-anti camundongo IgG H+L, diluição 1:200) se usar anticorpos primários de camundongo (por exemplo, anti-TuJ1 de camundongo) para corar as células do gânglio espiral.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicionar 200 μL de solução de bloqueio e incubar os explantes por 1 h.</li>
	<li>Descarte a solução de bloqueio. Aos explantes incubados com fragmento de Fab, adicionar 200 μL de PFA a 4% e incubar por 5 min.</li>
	<li>Lave os explantes com 1x PBS por 5 min.</li>
	<li>Preparar uma solução de anticorpos composta por 1x PBS, 5% NGS e 0,1%-0,25% Triton-X100.</li>
	<li>Diluir o anticorpo primário em solução de anticorpos - MYO7A (ab3481 na diluição de 1:500 ou MYO7A 138-1 em 1:100) - para marcar as células ciliadas e TuJ1 (1:400) para marcar os neurônios do gânglio espiral. NOTA: Se as células ciliadas forem marcadas apenas com faloidina, diluir a faloidina a 1:150 em 1x PBS, incubar por 40 min a 1 h à temperatura ambiente e prosseguir para o passo 6.22.</li>
	<li>Incluir um controle para a ligação inespecífica do anticorpo secundário omitindo o anticorpo primário.</li>
	<li>Adicionar 170 μL da solução de anticorpos com o anticorpo primário ao poço correspondente e incubar durante a noite a 4 °C com agitação suave (40-60 rpm).</li>
	<li>Lave os explantes 4x por 5 min cada com 1x PBS.</li>
	<li>Diluir o anticorpo secundário em solução de anticorpos (por exemplo, Alexa Fluor 488 anticoelho de cabra ou Alexa Fluor 568 IgG anti-rato de cabra numa diluição de 1:500).</li>
	<li>Adicionar 170 μL da solução de anticorpos com o anticorpo secundário e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. NOTA: A partir desta etapa, proteja os explantes da exposição prolongada à luz.</li>
	<li>Lave os explantes 2x por 5 min cada com 1x PBS.</li>
	<li>Prossiga para a próxima etapa para a dupla marcação sequencial dos explantes. Incubar com um segundo anticorpo primário de interesse (por exemplo, MYO7A para células ciliadas) durante a noite a 4 °C com agitação suave (40-60 rpm). Alternativamente, incubar com faloidina (1:150) durante 40 min a 1 h à temperatura ambiente e prosseguir para o passo 6.22. NOTA: Execute a marcação sequencial se os anticorpos primários forem da mesma espécie hospedeira. Realizar marcação de faloidina no final para imunofluorescência multiplex.</li>
	<li>Lave os explantes 4x por 5 min cada com 1x PBS.</li>
	<li>Diluir o anticorpo secundário em solução de anticorpos (por exemplo, Alexa Fluor 488 anticoelho de cabra ou Alexa Fluor 568 IgG anti-rato de cabra numa diluição de 1:500).</li>
	<li>Adicionar 170 μL do anticorpo secundário e incubar durante 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os explantes 2x por 5 min cada com 1x PBS.</li>
	<li>Preparar uma solução-mãe DAPI de 1 mg/ml e conservar a -20 °C. Diluir a solução-mãe DAPI 1:10 para preparar soluções de trabalho de 0,1 mg/ml e conservar a 4 °C. Observação : ignore a etapa 23 e vá para a etapa 26 se a mídia de montagem que contém DAPI é usada.</li>
	<li>Diluir a solução de trabalho DAPI 1:100 em 1x PBS e incubar os explantes com 200 μL de solução DAPI por 5 min.</li>
	<li>Lave os explantes 2x por 5 min cada com 1x PBS.</li>
	<li>Remova o PBS 1x tanto quanto possível para permitir que o fundo da câmara seque. Não deixe o explante secar.</li>
	<li>Aguarde 2-5 s e adicione uma gota de meio de montagem diretamente no explante. NOTA: O meio de montagem no explante permanecerá no local devido à tensão superficial. O meio de montagem de endurecimento pode ser usado.</li>
	<li>Conservar as câmaras a 4°C até à obtenção de imagens.</li>
</ol>7. Imunofluorescência de células vivas de explantes
<ol><li>Utilizar os explantes isolados após incubação noturna.</li>
	<li>Retire o meio e adicione cuidadosamente 300 μL de meio contendo 125 μM de cisplatina.</li>
	<li>Incubar os explantes por 18 h para medir o superóxido mitocondrial nos explantes vivos.</li>
	<li>Descarte o meio no final da exposição à droga.</li>
	<li>Adicionar 300 μL de uma sonda permeável para detectar as ROS celulares (por exemplo, 250 nM de mito-hidroetidina) e/ou Caspase-3 (por exemplo, peptídeo DEVD de 2 μM conjugado a um corante ligante de ácido nucleico).</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante 30 min.</li>
	<li>Lavar os explantes duas vezes suavemente com 200 μL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) quente ou um tampão apropriado.</li>
	<li>Imagem das células dentro de 2 h com excitação por fluorescência a 400 nm e detecção de emissão a 590 nm.</li>
	<li>Eliminar o meio ao final do experimento e lavar imediatamente os explantes com 200 μL de PBS 1x pré-aquecido.</li>
	<li>Corrigir os explantes e manchar as células cocleares como descrito acima.</li>
</ol>8. Visualização por imagem confocal
<ol><li>Obtenha imagens dos explantes usando um microscópio equipado com uma unidade confocal de disco giratório ou um microscópio confocal equipado com uma unidade confocal de varredura de pontos.</li>
	<li>Adquira as imagens usando um disco giratório com uma objetiva de ar de 20x (abertura numérica: 0,75) para contagem de células. Alternativamente, adquira as imagens usando um microscópio confocal de varredura pontual com objetiva de ar de 40x (abertura numérica: 0,95) ou uma objetiva de óleo de 100x (abertura numérica: 1,45) para visualizar e contar as sinapses ou imagear os estereocílios. NOTA: Ajuste a intensidade do laser e o tempo de exposição para cada canal para evitar a saturação excessiva e insuficiente das imagens. Aplicar as mesmas configurações a todos os explantes do mesmo experimento.</li>
	<li>Configure o microscópio para capturar uma imagem 3D de todo o explante coclear usando uma objetiva de ar de 20x, z-stack e ferramentas de costura automáticas. Use 3 x 3 campos adjacentes com 15% de sobreposição para explantes de camundongos e 4 x 4 campos adjacentes para explantes de ratos a serem costurados.</li>
	<li>Ajuste as imagens usando o software do microscópio ou o software livre de código aberto FIJI8. NOTA: A deconvolução, uma técnica de processamento de imagens, pode ser aplicada a imagens confocais para melhorar seu contraste e resolução 9-11.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mukherjea, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+screening+of+drugs+to+prevent+acquired+sensorineural+hearing+loss.">The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).</li><li>Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+cell-based+therapies+for+the+treatment+of+hearing+loss.">Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss.</a> Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).</li><li>Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. 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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O objetivo da atualização deste protocolo foi agilizar as etapas desde o isolamento dos explantes até a obtenção de imagens das células cocleares vivas e fixas. Aprimoramos algumas etapas durante o isolamento e introduzimos algumas ferramentas inovadoras com o objetivo de estabelecer um protocolo eficiente e de bom funcionamento para a obtenção de explantes de alta qualidade. O método descrito é um protocolo otimizado a partir de relatos anteriores 4,5. Além disso, alguns estudos atuais carecem de um protocolo atualizado passo a passo. Com etapas simplificadas de cultivo de explantes, este protocolo proporciona o fácil manuseio de explantes bem preservados, o que é essencial para dados reprodutíveis. A introdução de câmaras multipoços com lamínula polimérica para explantes da orelha interna melhora a fixação do órgão e a preservação dos explantes intactos. Aqui, apresentamos vários exemplos de experimentos sob condições de estresse para demonstrar que os órgãos em cultura mantêm sua organização celular apesar da perda de células ciliadas e danos aos neuritos.
Um dos desafios na cultura dos órgãos da orelha interna é evitar o descolamento e a flutuação dos órgãos, pois isso afeta a integridade dos explantes, a resposta ao tratamento e os exames subsequentes. Previamente, os explantes foram cultivados em lamínulas de vidro 4,5. Embora a cultura em superfícies de vidro pareça ser uma boa alternativa, o revestimento do vidro é demorado, e as próprias lamínulas são frágeis e delicadas. Um protocolo alternativo usando cultura de células milicelulares insere tentativas de resolver esse problema6. No entanto, cortar e transferir a membrana com os explantes parece ser uma etapa delicada nesse protocolo. Além disso, os explantes podem ser danificados durante a montagem e vedação da lamínula. Em nossa abordagem proposta, uma vez que os explantes são transferidos para as câmaras revestidas de poli-D-lisina e colocados na posição correta, nenhuma transferência adicional ou cobertura com lamínulas é necessária. Outra vantagem deste protocolo é o uso de câmaras com uma fina lamínula polimérica permeável a gás que proporciona condições ideais de cultura para os explantes do órgão. Este polímero tem uma qualidade óptica semelhante ao vidro, tornando-o adequado para imagens celulares em microscopia de alta resolução.
A adição de soro ao meio é utilizada na maioria dos protocolos de cultura de células e tecidos, incluindo o cultivo de explantes da orelha interna com SFB a 1%-10%4,5,6,16. A presença de soro afeta as condições de cultura dos experimentos; Assim, em determinadas situações, a cultura sem soro é preferida. A ausência de soro na cultura dos explantes cocleares foi substituída pela adição de N2 ao DMEM ou pela adição de N2 ao meio Neurobasal-A 5,6. Nesse sentido, foram testadas as condições de cultivo dos explantes com e sem soro. Em ambas as condições, as células da orelha interna foram vitais e responderam às condições ototóxicas. Testamos essas condições por 72 h, mas os explantes podem ser mantidos em cultura por ainda mais tempo, principalmente quando incubados com meio livre de soro juntamente com N2, B27 e fatores de crescimento, como sugerido em outros estudos 5,16.
Além das etapas críticas gerais no isolamento dos explantes da orelha interna, como a duração do isolamento do órgão e o antibiótico utilizado, existem também algumas etapas críticas nesse protocolo, que são, no entanto, manejáveis. Uma das etapas críticas desse método está relacionada ao volume de meio que permanece na câmara após a inserção do órgão. Isso foi otimizado para manter os explantes vivos e presos à superfície inferior. Outra etapa crítica está relacionada ao tempo de incubação necessário para permitir que os explantes se fixem ao fundo da câmara. Tempos de incubação superiores a 2 h com alguns microlitros de meio podem afetar a saúde dos explantes. Tempos de incubação mais curtos, como 1 h, também podem ser utilizados, desde que se tome cuidado para não desprender os explantes. Outro aspecto importante são os resíduos de poli-D-lisina. As etapas de lavagem da poli-D-lisina devem ser rigorosamente seguidas, porque os resíduos do sal de brometo de poli-D-lisina podem ser tóxicos para as células. Após as etapas de lavagem terem sido seguidas com precisão, o revestimento com poli-D-lisina facilita a adesão suave dos explantes às câmaras para que a posição possa ser corrigida antes que eles fiquem firmemente presos ao fundo da câmara.
Uma das limitações deste método é a obtenção de imagens de células usando microscopia vertical. Esta poderia ser uma questão importante para os laboratórios com microscópios invertidos. Lâminas de vidro com câmaras de silicone removíveis podem ser usadas para microscopia vertical e invertida; no entanto, nossas condições de revestimento com poli-D-lisina precisam ser testadas primeiro. Outra limitação é o armazenamento das câmaras, pois as pastilhas não são removíveis, e a altura total de uma câmara com a tampa é de quase 11 mm em comparação com a altura de 1 mm de uma lâmina de microscópio padrão. No entanto, a câmara de 8 poços usa menos espaço do que as placas de 4 poços sugeridas antes de16.
Apresentamos aqui imagens adquiridas com dois microscópios. Enquanto o microscópio confocal de varredura pontual fornece imagens de alta resolução dos tecidos devido à sua fina seção óptica, o microscópio confocal de disco giratório fornece um tempo de imagem mais rápido com boa resolução. Os estereocílios das células ciliadas internas (CCI) e das células ciliadas externas (CCEs) são visualizados por microscopia confocal. Como os estereocílios das CCH são maiores que os das CCEs, elas foram repetidamente e bem visualizadas neste trabalho. Para os estereocílios de CCE, outros microscópios alternativos podem melhorar a visualização, como a microscopia de super-resolução (SRM). As imagens de explante adquiridas com o microscópio de disco giratório são suficientes para a fácil integração da contagem automatizada de células ciliadas usando uma abordagem de aprendizado profundo12. Além disso, o curto tempo de aquisição é importante para experimentos com células e tecidos vivos. Além disso, este protocolo não se limita aos explantes cocleares neonatais. Com algumas otimizações, outros explantes, como órgãos vestibulares ou tecidos embrionários, também podem ser cultivados.
A quantificação in vitro de células cocleares, como células ciliadas e neurônios, é importante para avaliar a viabilidade celular e, consequentemente, o percentual de células danificadas ou perdidas. Investigações de vias de sinalização e funções celulares ajudam a revelar os mecanismos de morte e sobrevivência. Exames de tecidos cocleares embrionários e neonatais são úteis para investigar os estágios de desenvolvimento da cóclea. Portanto, este protocolo ajudará a otimizar estudos in vitro de explantes da orelha interna, por exemplo, para estabelecer modelos ototóxicos, investigar estágios de desenvolvimento, avaliar vias de sinalização e realizar estudos de triagem de drogas.

A maioria dos casos de perda auditiva neurossensorial é decorrente da degeneração das células ciliadas sensoriais, das células do nervo auditivo e/ou das sinapsesauditivas1. Este processo degenerativo nas células sensoriais é progressivo e geralmente irreversível, resultando em perdaauditiva2. Portanto, informações sobre a viabilidade das células sensoriais e alterações nas vias de sinalização sob condições de estresse são fundamentais para proteger as células de danos e, consequentemente, perdas. A pesquisa de explantes cocleares em cultura permite a recapitulação do complexo tecidual e a manutenção de uma rede célula-célula normal, o que possibilita uma melhor descrição dos processos de sinalização. Para estabelecer modelos experimentais de ototoxicidade, o antibiótico gentamicina e o quimioterápico cisplatina têm sido frequentemente utilizados, pois são conhecidos por apresentarem efeitos colateraisototóxicos3.
Sistemas de cultivo in vitro de explantes cocleares têm sido desenvolvidos e modificados ao longo do tempo; No entanto, uma descrição do protocolo stepwise para a cultura de explantes cocleares inteiros é frequentemente ausente em várias publicações. Um dos primeiros protocolos de vídeo para cultura primária do órgão murino de Corti foi publicado por Parker et al., no qual os autores descreveram os passos para o isolamento do epitélio sensorial, cultivo em lamínulas de vidro e eletroporação de explantes para experimentos de transfecção4. Outro protocolo utilizando lamínulas de vidro também foi publicado anteriormente, no qual foi considerada a organização da estrutura celular na orelhainterna5. Um protocolo alternativo utilizando membrana de Millicell para cultura de explantes murinos do órgão de Corti e órgão vestibular tem sidorelatado6. Essas reportagens em vídeo contribuíram para o aprimoramento do método, mas ainda há desafios que precisam ser resolvidos. Para resolver uma série de questões decorrentes do uso de lamínulas e insertos de vidro, o presente protocolo visa agilizar as etapas de cultura de órgãos e cultura de órgãos de alta qualidade para obter dados confiáveis. Isso é conseguido minimizando o manuseio direto do órgão durante os procedimentos experimentais e evitando a transferência de órgãos antes de obter imagens de alta resolução das células vivas e fixas.
O presente protocolo atualiza os sistemas de cultivo in vitro publicados anteriormente e introduz diversas otimizações no isolamento do órgão de Corti e transferência para as câmaras de cultura, bem como a integração de uma nova câmara de lâminas para melhorar as condições de cultura e posterior análise. Esse protocolo otimizado reduz o risco de lesão do órgão, o que pode ocorrer com o uso de lamínulas de vidro durante a troca do meio ou durante a transferência do órgão de lamínulas ou membranas para análiseposterior4,5,6. As tampas de vidro têm um índice reflexivo melhor do que as de plástico; eles são, no entanto, frágeis e podem quebrar mais facilmente. As câmaras de poços múltiplos usadas aqui são anexadas a uma lâmina de microscópio, que são adequadas para cultura de órgãos e para imagens de alta resolução. A transferência dos órgãos isolados é realizada com uma espátula, que permite que o órgão seja trazido na orientação correta e deslizado para dentro da câmara, em vez de aplicar força com uma pipeta, como previamente recomendado 4,5,6.
As câmaras multipoços revestidas com poli-D-lisina, que devem conter meio suficiente, facilitam a transferência de órgãos e o posicionamento adequado dos explantes, sem aplicar pressão adesiva e evitando a sobreposição de órgãos, como mencionado anteriormente6. Além disso, sobreposições acidentais de órgãos e estruturas irregulares são resolvidas usando uma pilha Z confocal. Este protocolo tem sido otimizado para diversas aplicações, tais como explantes de camundongos e ratos, explantes do órgão de Corti e cóclea, cultivo em meio contendo e sem soro, avaliações ototóxicas e experimentos gerais de resposta a drogas. Os explantes cocleares são montados e incubados em câmaras com fundo de lamínula, o que facilita a adesão dos explantes cocleares às câmaras para o manuseio ideal durante os experimentos in vitro , o pós-processamento dos explantes e a obtenção de imagens de explantes cocleares vivos e fixos. A visualização de toda a extensão do órgão de Corti e a quantificação das células ciliadas são simplificadas. Além disso, as avaliações das células de suporte, células neurais do gânglio espiral e neuritos são precisas. Portanto, este protocolo pode ser utilizado para uma análise abrangente das células cocleares de mamíferos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45&#176; Angled Forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
			<td>VECTASHIELD</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 phalloidin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2151755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium With DAPI</td>
			<td>VECTASHIELD</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-myosin VII rabbit polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x), minus antioxidants</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10889038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBON STEEL surgical blades 23</td>
			<td>Swann Moiton</td>
			<td>210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellEvent&#8482; Caspase-3/7 Green Detection Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C10723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double spatulas, one curved end</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA038.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL</td>
			<td>bichsel</td>
			<td>160 0 106 00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201255309/201255305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Intensity Cold Halogen Light Source&#160;</td>
			<td>Intralux&#174;&#160;</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional version 21.10</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#181;-Slide 8 well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX&#8482; Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera.</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14005-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.2 (1x), 500mL</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steri 250 Second sterilizer</td>
			<td>Simon Keller AG</td>
			<td>&#160;031100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, desiccant pellets</td>
			<td>Simon Keller AG</td>
			<td>31120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 60 x 15 mm</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 60 x 15 mm</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trito&#160;X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconventional myosin-VIIa</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>138-1s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A12873-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole neonatal cochlear explants as an in vitro model

A perda auditiva não tratada impõe custos significativos ao sistema de saúde global e prejudica a qualidade de vida dos indivíduos. A perda auditiva neurossensorial é caracterizada pela perda cumulativa e irreversível das células ciliadas sensoriais e dos nervos auditivos na cóclea. Explantes cocleares inteiros e vitais são uma das ferramentas fundamentais na pesquisa auditiva para detectar a perda de células ciliadas e caracterizar os mecanismos moleculares das células da orelha interna. Há muitos anos, foi desenvolvido um protocolo de isolamento coclear neonatal que, embora tenha sido modificado ao longo do tempo, ainda apresenta potencial de melhoria. 
Este trabalho apresenta um protocolo otimizado para isolamento e cultura de explantes cocleares neonatais inteiros em câmaras de cultura multipoços que possibilita o estudo das células ciliadas e das células neurais do gânglio espiral ao longo de toda a extensão da cóclea. O protocolo foi testado utilizando explantes cocleares de camundongos e ratos. Explantes cocleares saudáveis foram obtidos para estudar a interação entre as células ciliadas, as células do gânglio espiral do neurônio e as células de suporte adjacentes. 
Uma das principais vantagens desse método é que ele simplifica as etapas de cultura de órgãos sem comprometer a qualidade dos explantes. Todas as três voltas do órgão de Corti estão presas ao fundo da câmara, o que facilita os experimentos in vitro e a análise abrangente dos explantes. Apresentamos alguns exemplos de imagens cocleares de diferentes experimentos com explantes vivos e fixos, demonstrando que os explantes mantêm sua estrutura apesar da exposição a drogas ototóxicas. Este protocolo otimizado pode ser amplamente utilizado para a análise integrativa da cóclea de mamíferos.

O presente protocolo foi testado na cóclea de camundongos e ratos neonatais. Este trabalho apresenta imagens de explantes de diferentes experimentos. Os explantes do órgão de Corti foram expostos à gentamicina ou cisplatina, e a perda de células ciliadas foi visível. Os explantes do órgão de Corti mantiveram sua estrutura e comprimento total em condições normais e de estresse (Figura 1 e Figura 2). As células ciliadas sobreviventes ao longo de toda a extensão dos explantes de ratos previamente expostos à cisplatina foram detectáveis individualmente (Figura 1). Além da detecção de células ciliadas sobreviventes, também foram detectadas células ciliadas em apoptose (Figura 2). Essa abordagem facilita a visualização e contagem das células sobreviventes, que pode ser realizada por meio de uma abordagem de aprendizado profundo, como descritoanteriormente12. Também foi possível detectar os processos biológicos em células cocleares vivas utilizando sondas apropriadas permeáveis a células (Figura 3).
No caso de explantes cocleares contendo neurônios do gânglio espiral, os explantes podem ser cortados em dois pedaços, ou a região do ápice pode ser cortada para proporcionar melhores condições de cultivo. Aqui optamos por separar a região do ápice, por ser menos afetada em condições de estresse. A Figura 4 mostra as regiões base e medial dos explantes cocleares. Células ciliadas marcadas com o marcador de células ciliadas MYO7A foram detectadas. Da mesma forma, corpos celulares ganglionares espirais saudáveis e danificados e neuritos marcados com o marcador neuronal TuJ1 foram identificados. A análise das regiões do gânglio espiral pode ser realizada manualmente ou utilizando softwares de código aberto como o FIJI com o plugin NeuronJ para traçado de neuritos13 ou extensões como TrackMate e Cellpose para segmentação morfológica14,15. O exame mais detalhado dos explantes de camundongos revelou alta resolução das células cocleares e dos estereocílios das células ciliadas (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig01.jpg"> Figura 1: Explantes do órgão de Corti de ratos expostos à gentamicina. Imagens representativas (projeção de intensidade máxima) de (A) explantes de controle e (B) expostos à gentamicina (200 μM por 24 h). As células ciliadas são marcadas com faloidina e podem ser visualizadas ao longo de todo o comprimento da cóclea. Para melhor ilustração, a imagem é em tons de cinza. As imagens foram adquiridas utilizando-se microscópio confocal de disco giratório com objetiva de 20x (abertura numérica: 0,75). Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig02.jpg"> Figura 2: Explantes do órgão de Corti de camundongos expostos à cisplatina. Imagens representativas (projeção de intensidade máxima) de (A) explantes de controle e (B) expostos à cisplatina (160 μM por 48 h). As células ciliadas são marcadas com faloidina (vermelha), e as células ciliadas apoptóticas são marcadas com fluorescina. As imagens foram adquiridas utilizando-se microscópio confocal de varredura pontual e objetiva de 20x (abertura numérica: 0,75). Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig03.jpg"> Figura 3: Explantes do órgão de Corti de experimentos de imagem ao vivo. Imagens representativas (projeção de intensidade máxima) de explantes de camundongos selvagens mostrando (A) explantes controle e (B) explantes com exposição a cisplatina 125 μM por 18 h. As células ciliadas são marcadas com mito-hidroetidina e caspase-3. As imagens foram adquiridas utilizando-se microscópio confocal de disco giratório e objetiva de 20x (abertura numérica: 0,75). Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig04.jpg"> Figura 4: Explantes cocleares de camundongos knockout STAT1 expostos à cisplatina. Imagens representativas (projeção de intensidade máxima) de (A) explantes controle e (D) explantes expostos a cisplatina 40 μM por 48 h. Os corpos das células ciliadas são marcados com o anticorpo MYO7A (verde), e as células do gânglio espiral com o anticorpo TuJ1 (vermelho) e a marcação nuclear DAPI (azul). As imagens foram adquiridas utilizando-se microscópio confocal de varredura pontual e objetiva de 20x (abertura numérica: 0,75) com zoom adicional de 2,15 (B,C,E,F). Barra de escala = (B,C,E,F) 50 μm e (A,D) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig05.jpg"> Figura 5: Órgão de camundongo de explantes de Corti. (A-D) Imagens representativas (projeção de intensidade máxima) de explantes de comprimento total de camundongos selvagens. (A,B) Os explantes foram marcados com o anticorpo MYO7A, faloidina e marcação nuclear DAPI. (B) Na visão ampliada, os corpos celulares das células ciliadas marcadas com o anticorpo MYO7A (verde) são claramente visíveis. (C,D) A faloidina marca os estereocílios e a placa cuticular das células ciliadas. Os explantes foram marcados com faloidina. (D) Na visão ampliada, imagens descomplicadas de estereocílios de células ciliadas internas individuais são bem identificadas (fileira inferior), enquanto estereocílios de células ciliadas externas individuais são mais difíceis de delinear (fileira superior). As imagens dos painéis A e C foram adquiridas com microscópio confocal de disco giratório com objetiva de 20x (abertura numérica: 0,75). A imagem no painel B foi adquirida com o mesmo microscópio, porém com objetiva de ar de 40x (abertura numérica: 0,95). A imagem no painel D foi adquirida com microscópio confocal de varredura por pontos e objetiva de óleo de 100x (abertura numérica: 1,45) com zoom adicional de 3,46. As varreduras foram calculadas em média quatro vezes por corte XY, e o tamanho do pixel foi de 0,02 μm. Barras de escala = (D) 3 μm, (B) 100 μm e (A,C) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

O protocolo atual atualiza protocolos anteriores e incorpora abordagens relativamente simples para a cultura de explantes cocleares de alta qualidade. Isso fornece aquisição de dados confiável e imagens de alta resolução em células vivas e fixas. Este protocolo apoia a tendência contínua de estudar as células da orelha interna.

Explantes Cocleares Neonatais Totais como Modelo In vitro

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Este protocolo incorpora uma abordagem simples para agilizar as etapas de cultivo, obtendo explantes de alta qualidade e contribuirá para explorar e desvendar mecanismos moleculares das células cocleares. A principal vantagem dessa técnica é o manuseio direto mínimo dos órgãos, coordenando as etapas de dissecção, o revestimento adequado da superfície do polímero, o volume médio otimizado e o tempo de fixação dos explantes. Esta técnica representa uma abordagem popular in vitro para o estudo da perda auditiva neurossensorial.Isso pode ser usado para estabelecer modelos ototóxicos, realizar análises estruturais, avaliar vias de sinalização e realizar estudos de triagem de drogas. Em princípio, este método pode aplicar-se a diferentes explantes de tecidos. Ele também pode ser empregado em pesquisas do ouvido interno para obter informações sobre os estágios de desenvolvimento embrionário.Para começar, coloque a cabeça do rato decapitado sobre a almofada estéril. Use tesoura e pinça para remover a mandíbula, depois levante a pele e descasque-a de volta do crânio. Coloque a pinça nas cavidades orbitárias para segurar o crânio.Com uma lâmina afiada de bisturi, corte cuidadosamente o crânio ao longo da sutura sagital e, em seguida, a área de sutura coronal sem danificar a cóclea. Agora, remova o cérebro das duas metades do crânio. Sob o microscópio, localize a cóclea no osso temporal e solte o tecido circundante entre a cóclea e o osso temporal.Em seguida, coloque a pinça no canal semicircular superior. Puxar suavemente o osso temporal para longe da cóclea e segurar a cóclea presa ao vestíbulo com o osso temporal. Insira as pontas da pinça na região do ápice, que é visível como uma linha branca, e remova a cápsula cartilaginosa da cóclea peça por peça para expor o ducto coclear.Coloque as pinças sob a cóclea e as desprenda do órgão vestibular e do osso temporal. Transfira a cóclea para um novo prato de 60 milímetros contendo PBS gelado. Para isolar os órgãos do explante de Corti, segure o órgão na base e o ducto coclear na região do gancho basal e desanuvie suavemente o ducto coclear do modíolo sem rasgá-lo.Em seguida, segure o ducto coclear na base e puxe o ligamento espiral e a estria vascular. Para o isolamento dos explantes cocleares, utilizar pinça para desprender o gânglio espiral da lâmina espiral óssea e desenrolar o modíolo durante o descolamento. Com pinças, segure a região do gancho e remova o ligamento espiral com a estria vascular.Além disso, retire a membrana de Reissner peça por peça. Para transferir os explantes cocleares, mergulhe uma espátula de laboratório na placa que contém o explante. Levante o explante com as células ciliadas viradas para cima junto com alguns microlitros de PBS agitando uma espátula.Coloque o explante em uma lâmina de câmara de oito poços, agitando suavemente a espátula no meio. Deixe o explante deslizar para dentro da câmara. Usando uma pipeta de 100 microlitros, retire 80 microlitros do meio e descarte-o.Verifique a visibilidade das células ciliadas e das células neurais do gânglio espiral ao microscópio. Se necessário, use fórceps para afastar o tecido sobreposto. Retire o meio restante do poço.O explante ficará agora mais plano na superfície da câmara. Após 10 segundos, pipetar de volta uma ou duas gotas do meio ao lado do explante, e o meio restante a alguma distância para evitar o desprendimento do explante. Certifique-se de que os explantes não se movam ao adicionar o meio.Incubar a câmara por duas horas para fixar os órgãos firmemente ao fundo da câmara. Após a incubação, aspirar o meio. E usando uma pipeta de 100 ou 200 microlitros, adicione cuidadosamente 300 microlitros de meio completo fresco e pré-aquecido.As imagens microscópicas confocais do disco giratório mostraram que os explantes do Órgão de Corti de ratos mantiveram sua estrutura e comprimento total em condições normais e estressadas. Além disso, um microscópio confocal de varredura demonstrou células ciliadas sobreviventes de explantes dos órgãos de camundongos, juntamente com células ciliadas em apoptose. O protocolo possibilitou o monitoramento de processadores biológicos em células cocleares vivas utilizando sondas permeáveis celulares apropriadas e microscópio confocal de disco giratório.A cultura desses explantes cocleares favorece a análise da interação entre as células ciliadas e as células do gânglio espiral. As células ciliadas dos implantes cocleares foram detectadas com o marcador de células ciliadas, MYO7A. Da mesma forma, corpos celulares ganglionares espirais saudáveis e danificados e neuritos foram identificados usando o marcador neuronal, Tuj 1.Na visão ampliada, os corpos celulares das células ciliadas marcadas com o anticorpo MYO7A eram visíveis. Estereocílios de células ciliadas externas e imagens descontorcidas de estereocílios de células ciliadas internas individuais marcados com faloidina foram identificados. Cuidados devem ser tomados durante os procedimentos sob o microscópio, especialmente ao separar o gânglio espiral da lâmina espiral óssea.Os explantes intactos devem ser transferidos e alinhados com cuidado. Este protocolo otimizou estudos in vitro de explantes da orelha interna. Os resultados desses estudos, como vias de sinalização e toxicidade de drogas, podem guiar o desenho de estudos in vivo mais distantes.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Neurociência

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

Neurocomportamentais avaliações em um modelo do rato de lesão cerebral hipóxica-isquêmica Neonatal

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Um modelo in vitro para estudar a agregação Tau usando transdução mediada por Lentivirus de neurônios humanos

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...