Name: whole neonatal cochlear explants as an in vitro model
Uploaded: 2023-07-28T12:00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model at JoVE.com

Мы хотели бы выразить признательность Ветеринарному центру Департамента биомедицины Базельского университета за поддержку в уходе за животными, Центру микроскопии, а также Службе информационных технологий Департамента биомедицины за техническую помощь, а также Швейцарскому национальному научному фонду (SNSF) за финансовую поддержку (стипендия MD-PhD для магистра, Номер гранта 323530_191222).

<ol>
	<li>Mukherjea, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+screening+of+drugs+to+prevent+acquired+sensorineural+hearing+loss.">The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).</li><li>Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+cell-based+therapies+for+the+treatment+of+hearing+loss.">Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss.</a> Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).</li><li>Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+and+aminoglycoside+antibiotics:+Hearing+loss+and+its+prevention.">Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+mouse+Stat1+gene+results+in+compromised+innate+immunity+to+viral+disease.">Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease.</a> Cell. 84 (3), 443-450 (1996).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Etournay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cells+undergo+an+apical+circumference+remodeling+constrained+by+the+hair+bundle+shape.">Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape.</a> Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).</li><li>MacDonald, G. H., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+intact+mouse+cochlea+by+fluorescent+laser+scanning+confocal+microscopy.">Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy.</a> Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).</li><li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+microscopy.">Deconvolution microscopy.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).</li><li>Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+learning+approach+to+quantify+auditory+hair+cells.">A deep learning approach to quantify auditory hair cells.</a> Hearing Research. 409, 108317 (2021).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Ershov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate+7:+Integrating+state-of-the-art+segmentation+algorithms+into+tracking+pipelines.">TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines.</a> Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).</li><li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellpose:+A+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation.">Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li><li>Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+mammalian+inner+ear+hair+cells.">In vitro culture of mammalian inner ear hair cells.</a> Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Цель обновления этого протокола состояла в том, чтобы упростить этапы от изоляции эксплантов до визуализации живых и фиксированных кохлеарных клеток. Мы усовершенствовали некоторые этапы изоляции и внедрили некоторые инновационные инструменты с целью создания эффективного и бесперебойного протокола для получения высококачественных эксплантов. Описанный метод является оптимизированным протоколом из предыдущих отчетов 4,5. Кроме того, в некоторых современных исследованиях отсутствует поэтапно обновляемый протокол. Благодаря упрощенным этапам культивирования эксплантов этот протокол обеспечивает легкую работу с хорошо сохранившимися эксплантами, что важно для воспроизводимых данных. Внедрение многолуночных камер с полимерным покровным стеклом для эксплантов внутреннего уха улучшает прикрепление органа и сохранение интактных эксплантов. Здесь мы приводим несколько примеров экспериментов в условиях стресса, чтобы продемонстрировать, что органы в культуре сохраняют свою клеточную организацию, несмотря на потерю волосковых клеток и повреждение нейритов.
Одной из сложностей при культивировании органов внутреннего уха является предотвращение отслоения и всплытия органов, так как это влияет на целостность эксплантатов, реакцию на лечение и последующие обследования. Ранее экспланты культивировали на стеклянных покровных стеклах 4,5. Несмотря на то, что культура на стеклянных поверхностях кажется хорошей альтернативой, нанесение покрытия на стекло занимает много времени, а сами покровные стекла хрупкие и нежные. Альтернативный протокол с использованием клеточных культур Millicell пытается решить эту проблему6. Тем не менее, разрезание и перенос мембраны с эксплантатами, по-видимому, является деликатным шагом в этом протоколе. Кроме того, экспланты могут быть повреждены во время монтажа и герметизации покровного стекла. В предлагаемом нами подходе, после того, как экспланты перемещены в камеры с поли-D-лизиновым покрытием и помещены в правильное положение, дальнейшее перемещение или покрытие покровными стеклами не требуется. Еще одним преимуществом этого протокола является использование камер с тонким газопроницаемым полимерным покровным стеклом, которое обеспечивает оптимальные условия культивирования для эксплантатов органов. Этот полимер обладает оптическими свойствами, аналогичными стеклу, что делает его пригодным для визуализации клеток в микроскопии высокого разрешения.
Добавление сыворотки в среду используется в большинстве протоколов культивирования клеток и тканей, включая культивирование эксплантов внутреннего уха с 1%-10% FBS 4,5,6,16. Наличие сыворотки влияет на культуральные условия проведения экспериментов; Таким образом, в определенных ситуациях предпочтение отдается посеву без сыворотки. Отсутствие сыворотки в культуре кохлеарных эксплантов замещали либо добавлением N2 к DMEM, либо добавлением N2 к среде Neurobasal-A 5,6. В связи с этим мы протестировали условия культивирования эксплантов с сывороткой и без нее. В обоих случаях клетки внутреннего уха были жизненно важными и реагировали на ототоксические условия. Мы протестировали эти условия в течение 72 ч, но экспланты могут сохраняться в культуре еще дольше, особенно при инкубации с безсывороточной средой вместе с N2, B27 и факторами роста, как было предложено в других исследованиях 5,16.
В дополнение к общим критическим этапам изоляции эксплантов внутреннего уха, таким как продолжительность изоляции органа и используемый антибиотик, в этом протоколе также есть некоторые критические шаги, которые, тем не менее, являются управляемыми. Один из важнейших этапов в этом методе связан с объемом среды, которая остается в камере после введения органа. Это было оптимизировано для сохранения эксплантатов живыми и прикрепленными к нижней поверхности. Еще один важный этап связан с инкубационным временем, необходимым для того, чтобы экспланты могли прикрепиться ко дну камеры. Инкубационное время более 2 ч с несколькими микролитрами среды может повлиять на здоровье эксплантатов. Также можно использовать более короткое время инкубации, например, 1 ч, при условии, что экспланты не отделяются. Еще одним важным аспектом являются остатки поли-D-лизина. Следует строго соблюдать этапы промывки поли-D-лизина, поскольку остатки бромистой соли поли-D-лизина могут быть токсичными для клеток. После точного выполнения этапов промывки покрытие поли-D-лизином способствует плавному приклеиванию эксплантов к камерам, что позволяет исправить положение до того, как они прочно прикрепятся к дну камеры.
Одним из ограничений этого метода является визуализация клеток с помощью вертикальной микроскопии. Это может быть важной проблемой для лабораторий с инвертированными микроскопами. Стеклянные предметные стекла со съемными силиконовыми камерами могут использоваться для вертикальной и инвертированной микроскопии; тем не менее, наши условия покрытия поли-D-лизином должны быть сначала протестированы. Еще одним ограничением является хранение камер, поскольку вкладыши не снимаются, а общая высота одной камеры с крышкой составляет почти 11 мм по сравнению с высотой 1 мм стандартного предметного стекла микроскопа. Тем не менее, 8-луночная камера занимает меньше места, чем 4-луночные планшеты, предложенные до16.
Мы представляем здесь изображения, полученные с помощью двух микроскопов. В то время как конфокальный микроскоп с точечным сканированием обеспечивает изображения тканей с высоким разрешением благодаря тонкому оптическому сечению, конфокальный микроскоп с вращающимся диском обеспечивает более быстрое время визуализации с хорошим разрешением. Стереоцилии внутренних волосковых клеток (ВПХ) и наружных волосковых клеток (ВГК) визуализируются с помощью конфокальной микроскопии. Поскольку стереоцилии ИГХ больше, чем у ВГК, они неоднократно и хорошо визуализировались в данной работе. Для стереоцилии OHC другие альтернативные микроскопы могут улучшить визуализацию, такие как микроскопия сверхвысокого разрешения (SRM). Изображений эксплантов, полученных с помощью микроскопа с вращающимся диском, достаточно для простой интеграции автоматизированного подсчета волосковых клеток с использованием подхода глубокого обучения12. Кроме того, короткое время сбора данных важно для экспериментов с живыми клетками и тканями. Кроме того, этот протокол не ограничивается неонатальными кохлеарными эксплантами. При некоторой оптимизации можно культивировать и другие экспланты, такие как вестибулярные органы или эмбриональные ткани.
Количественная оценка кохлеарных клеток, таких как волосковые клетки и нейроны, in vitro важна для оценки жизнеспособности клеток и, следовательно, процента поврежденных или потерянных клеток. Исследования сигнальных путей и функций клеток помогают выявить механизмы гибели и выживания. Исследования эмбриональных и неонатальных кохлеарных тканей полезны для изучения стадий развития улитки. Таким образом, этот протокол поможет оптимизировать исследования in vitro эксплантов внутреннего уха, например, для создания ототоксических моделей, изучения стадий развития, оценки сигнальных путей и проведения скрининговых исследований лекарственных препаратов.

Большинство случаев нейросенсорной тугоухости обусловлены дегенерацией сенсорных волосковых клеток, слуховых нервных клеток и/или слуховых синапсов1. Этот дегенеративный процесс в сенсорных клетках является прогрессирующим и, как правило, необратимым, что приводитк потере слуха2. Таким образом, информация о жизнеспособности сенсорных клеток и изменениях в сигнальных путях в условиях стресса имеет решающее значение для защиты клеток от повреждения и, следовательно, потери. Исследование кохлеарных эксплантов в культуре позволяет рекапитулировать тканевый комплекс и поддерживать нормальную межклеточную сеть, что позволяет лучше описывать сигнальные процессы. Для создания экспериментальных моделей ототоксичности часто использовали антибиотик гентамицин и химиотерапевтическое средство цисплатин, поскольку известно, что они обладают ототоксическимипобочными эффектами.
Системы культивирования in vitro кохлеарных эксплантов разрабатывались и модифицировались с течением времени; Тем не менее, описание поэтапного протокола культивирования целых кохлеарных эксплантов часто отсутствует в нескольких публикациях. Один из первых видеопротоколов первичной культуры мышиного органа Corti был опубликован Parker et al., в котором авторы описали этапы выделения сенсорного эпителия, культивирования на стеклянных покровных стеклах и электропорации эксплантов для экспериментов по трансфекции4. Также ранее был опубликован другой протокол с использованием стеклянных покровных стекол, в котором рассматривалась организация клеточной структуры во внутреннем ухе5. Сообщается об альтернативном протоколе с использованием мембраны Millicell для культивирования мышиных эксплантов кортиевого органа и вестибулярного органа6. Эти видеорепортажи внесли свой вклад в совершенствование метода, но все еще есть проблемы, которые необходимо решить. Для решения ряда вопросов, возникающих в связи с использованием стеклянных покровных стеблей и вкладышей, настоящий протокол направлен на оптимизацию этапов культивирования органов и культивирование высококачественных органов для получения достоверных данных. Это достигается за счет минимизации непосредственного воздействия на орган во время экспериментальных процедур и избегания пересадки органов до получения изображений живых и фиксированных клеток с высоким разрешением.
Настоящий протокол обновляет ранее опубликованные системы культивирования in vitro и вносит ряд оптимизаций в изоляцию кортиевского органа и перенос в культуральные камеры, а также интеграцию новой слайдовой камеры для улучшения условий культивирования и дальнейшего анализа. Этот оптимизированный протокол снижает риск повреждения органа, который может возникнуть при использовании стеклянных покровных стекол во время смены среды или во время переноса органа из покровных стекол или мембран для дальнейшего анализа 4,5,6. Стеклянные покровные стекла имеют лучший отражающий показатель, чем пластиковые; Однако они хрупкие и могут легко сломаться. Многолуночные камеры, используемые здесь, прикреплены к предметному стеклу микроскопа, который хорошо подходит для культивирования органов и визуализации с высоким разрешением. Перенос изолированных органов выполняется с помощью шпателя, который позволяет привести орган в правильную ориентацию и скользить в камеру, а не прикладывать усилие пипеткой, как ранее рекомендовалось 4,5,6.
Многолуночные камеры с поли-D-лизиновым покрытием, которые должны содержать достаточное количество среды, облегчают перенос органов и правильное позиционирование эксплантатов без применения адгезивного давления и при этом избегают перекрытия органов, как упоминалось ранее6. Кроме того, случайное перекрытие органов и неровные структуры разрешаются с помощью конфокального Z-стека. Этот протокол был оптимизирован для различных применений, таких как экспланты мышей и крыс, экспланты кортиевого и улиткового органов, культивирование в сывороточной и безсывороточной среде, ототоксические оценки и эксперименты по общему лекарственному ответу. Кохлеарные экспланты монтируются и инкубируются в камерах с покровным дном, что облегчает адгезию кохлеарных эксплантов к камерам для оптимального обращения во время экспериментов in vitro , постобработки эксплантов и визуализации живых и фиксированных кохлеарных эксплантов. Визуализация всей длины кортиевского органа и количественное определение волосковых клеток упорядочены. Кроме того, оценки поддерживающих клеток, спиральных ганглиозных нейронных клеток и нейритов являются точными. Таким образом, данный протокол может быть использован для комплексного анализа кохлеарных клеток млекопитающих.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45&#176; Angled Forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
			<td>VECTASHIELD</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 phalloidin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>2151755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium With DAPI</td>
			<td>VECTASHIELD</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-myosin VII rabbit polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x), minus antioxidants</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10889038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARBON STEEL surgical blades 23</td>
			<td>Swann Moiton</td>
			<td>210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellEvent&#8482; Caspase-3/7 Green Detection Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C10723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double spatulas, one curved end</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA038.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL</td>
			<td>bichsel</td>
			<td>160 0 106 00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201255309/201255305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Intensity Cold Halogen Light Source&#160;</td>
			<td>Intralux&#174;&#160;</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional version 21.10</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#181;-Slide 8 well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSOX&#8482; Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>M36008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera.</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14005-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.2 (1x), 500mL</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steri 250 Second sterilizer</td>
			<td>Simon Keller AG</td>
			<td>&#160;031100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, desiccant pellets</td>
			<td>Simon Keller AG</td>
			<td>31120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 60 x 15 mm</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 60 x 15 mm</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trito&#160;X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconventional myosin-VIIa</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>138-1s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A12873-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole neonatal cochlear explants as an in vitro model

Нелеченая потеря слуха приводит к значительным издержкам для глобальной системы здравоохранения и ухудшает качество жизни людей. Нейросенсорная тугоухость характеризуется кумулятивной и необратимой потерей чувствительных волосковых клеток и слуховых нервов в улитке. Цельные и жизненно важные кохлеарные экспланты являются одним из основных инструментов в исследованиях слуха для обнаружения потери волосковых клеток и характеристики молекулярных механизмов клеток внутреннего уха. Много лет назад был разработан протокол кохлеарной изоляции новорожденных, и, хотя со временем он был изменен, он все еще имеет потенциал для улучшения. 
В данной работе представлен оптимизированный протокол выделения и культивирования целых неонатальных кохлеарных эксплантов в многолуночных культуральных камерах, который позволяет исследовать волосковые клетки и спиральные ганглиозные нейронные клетки по всей длине улитки. Протокол был протестирован с использованием кохлеарных эксплантов мышей и крыс. Были получены здоровые кохлеарные экспланты для изучения взаимодействия между волосковыми клетками, клетками нейронов спирального ганглия и окружающими поддерживающими клетками. 
Одним из основных преимуществ этого метода является то, что он упрощает этапы культивирования органов без ущерба для качества эксплантатов. Все три витка органа Корти прикреплены ко дну камеры, что облегчает эксперименты in vitro и всесторонний анализ эксплантов. Мы приводим несколько примеров кохлеарных изображений из различных экспериментов с живыми и фиксированными эксплантами, демонстрирующими, что экспланты сохраняют свою структуру, несмотря на воздействие ототоксических препаратов. Этот оптимизированный протокол может быть широко использован для интегративного анализа улитки млекопитающих.

Настоящий протокол был апробирован на улитке новорожденных мышей и крыс. В данной работе представлены изображения эксплантов из различных экспериментов. Экспланты кортианского органа подвергались воздействию гентамицина или цисплатина, и наблюдалась потеря волосяных клеток. Экспланты кортиевского органа сохраняли свою структуру и общую длину как в нормальных, так и в стрессовых условиях (рис. 1 и рис. 2). Уцелевшие волосковые клетки по всей длине эксплантов крыс, ранее подвергшихся воздействию цисплатина, были индивидуально обнаружены (рис. 1). Помимо обнаружения выживших волосковых клеток, были обнаружены также волосковые клетки, подвергающиеся апоптозу (рис. 2). Такой подход облегчает визуализацию и подсчет выживших клеток, что может быть выполнено с использованием подхода глубокого обучения, как описано ранее12. Также удалось обнаружить биологические процессы в живых клетках улитки с помощью соответствующих проницаемых для клеток зондов (рис. 3).
В случае кохлеарных эксплантов, содержащих нейроны спиральных ганглиозов, экспланты могут быть разрезаны на две части или область верхушки могут быть отрезаны для обеспечения лучших условий культивирования. Здесь мы решили выделить область апекса, потому что она меньше подвержена влиянию стрессовых условий. На рисунке 4 показаны основание и медиальная области кохлеарных эксплантов. Обнаружены волосковые клетки, помеченные маркером волосковых клеток MYO7A. Аналогичным образом были идентифицированы здоровые и поврежденные спиральные ганглиозные клеточные тела и нейриты, меченные нейрональным маркером TuJ1. Анализ спиральных ганглионарных областей может быть выполнен вручную или с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом, такого как FIJI с плагином NeuronJ для трассировки нейритов13 или расширений, таких как TrackMate и Cellpose для морфологической сегментации14,15. Более тщательное изучение эксплантов мышей выявило высокую разрешающую способность кохлеарных клеток и стереоцилии волосковых клеток (рис. 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig01.jpg"> Рисунок 1: Экспланты кортиевского органа у крыс, подвергшихся воздействию гентамицина. Репрезентативные изображения (проекция максимальной интенсивности) (А) контрольных и (Б) гентамицинов-экспонированных (200 мкМ в течение 24 ч) эксплантов. Волосковые клетки помечены фаллоидином и могут быть визуализированы по всей длине улитки. Для лучшей иллюстрации изображение выполнено в серых тонах. Изображения получены с помощью вращающегося дискового конфокального микроскопа с объективом 20x (числовая апертура: 0,75). Масштабная линейка = 500 мкм. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig01large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig02.jpg"> Рисунок 2: Экспланты кортиевского органа у мышей, подвергшихся воздействию цисплатина. Репрезентативные изображения (проекция максимальной интенсивности) (А) контрольных и (Б) цисплатинов, экспонированных (160 мкМ в течение 48 ч) эксплантов. Волосковые клетки помечены фаллоидином (красным), а апоптотические волосковые клетки помечены флуоресцином. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа с точечным сканированием и 20-кратным объективом (числовая апертура: 0,75). Масштабная линейка = 200 мкм. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig02large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig03.jpg"> Рисунок 3: Экспланты кортиевского органа из экспериментов по визуализации в реальном времени. Репрезентативные изображения (проекция максимальной интенсивности) эксплантов диких мышей, показывающие (А) контрольные экспланты и (Б) экспланты при воздействии цисплатина 125 мкМ в течение 18 ч. Волосковые клетки мечены митогидроэтидином и каспазой-3. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском и 20-кратного объектива (числовая апертура: 0,75). Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig03large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig04.jpg"> Рисунок 4: Кохлеарные эксплантаты мышей с нокаутом STAT1, подвергшихся воздействию цисплатина. Репрезентативные изображения (проекция максимальной интенсивности) (A) контрольных эксплантов и (D) эксплантов, подвергшихся воздействию 40 мкМ цисплатина в течение 48 ч. Тела волосковых клеток помечены антителом MYO7A (зеленый), а спиральные ганглиозные клетки — антителом TuJ1 (красный) и ядерной меткой DAPI (синий). Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа с точечным сканированием и 20-кратного объектива (числовая апертура: 0,75) с дополнительным зумом 2,15 (B, C, E, F). Масштабная линейка = (B,C,E,F) 50 мкм и (A,D) 200 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig05.jpg"> Рисунок 5: Мышиный орган кортиевских эксплантов. (А-Д) Репрезентативные изображения (проекция максимальной интенсивности) эксплантов дикого типа в полный рост. (А,Б) Экспланты были помечены антителами MYO7A, фаллоидином и ядерной меченицей DAPI. (B) В увеличенном обзоре хорошо видны тела волосковых клеток, помеченных антителами MYO7A (зеленого цвета). (С,Д) Фаллоидин помечает стереоцилии и кутикулярную пластинку волосковых клеток. Эксплантаты были помечены фаллоидином. (D) В увеличенном обзоре деконволютированные изображения отдельных внутренних стереоцилий волосковых клеток хорошо идентифицируются (нижний ряд), в то время как отдельные наружные стереоцилии волосковых клеток труднее очерчены (верхний ряд). Изображения на панелях А и С были получены с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском и объективом 20x (числовая апертура: 0,75). Изображение на панели B было получено с помощью того же микроскопа, но с 40-кратным воздушным объективом (числовая апертура: 0,95). Изображение на панели D было получено с помощью точечного сканирующего конфокального микроскопа и 100-кратного масляного объектива (числовая апертура: 1,45) с дополнительным зумом 3,46. Сканирование было усреднено четыре раза на участок XY, а размер пикселя составил 0,02 мкм. Масштабные линейки = (D) 3 мкм, (B) 100 мкм и (A,C) 200 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model at JoVE.com

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Текущий протокол обновляет предыдущие протоколы и включает в себя относительно простые подходы к культивированию высококачественных кохлеарных эксплантов. Это обеспечивает надежный сбор данных и получение изображений с высоким разрешением в живых и неподвижных ячейках. Этот протокол поддерживает продолжающуюся тенденцию изучения клеток внутреннего уха.

Цельные неонатальные кохлеарные экспланты как модель in vitro

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Этот протокол включает в себя простой подход к оптимизации этапов культивирования, получению высококачественных эксплантов и будет способствовать изучению и раскрытию молекулярных механизмов кохлеарных клеток. Основным преимуществом этого метода является минимальное непосредственное воздействие на орган за счет координации этапов диссекции, соответствующего полимерного покрытия поверхности, оптимизированного объема среды и времени прикрепления эксплантатов. Этот метод представляет собой популярный in vitro подход к изучению нейросенсорной тугоухости.Это может быть использовано для создания ототоксических моделей, выполнения структурного анализа, оценки сигнальных путей и проведения скрининговых исследований лекарственных препаратов. В принципе, этот метод можно применять к разным тканям эксплантатов. Он также может быть использован в исследованиях внутреннего уха, чтобы получить представление о стадиях эмбрионального развития.Для начала положите обезглавленную голову крысы на стерильную подушечку. Используйте ножницы и щипцы, чтобы удалить нижнюю челюсть, затем поднимите кожу и снимите ее с черепа. Поместите щипцы в орбитальные полости, чтобы удерживать череп.Острым лезвием скальпеля аккуратно разрежьте череп по сагиттальному шву, а затем по области венечного шва, не повреждая улитку. Теперь извлеките мозг из двух половин черепа. Под микроскопом локализовать улитку в височной кости и ослабить окружающие ткани между улиткой и височной костью.Затем поместите щипцы в верхний полукружный канал. Осторожно оттяните височную кость от улитки и удерживайте улитку, прикрепленную к преддверию, височной костью. Вставьте кончики щипцов в область верхушки, которая видна в виде белой линии, и удалите хрящевую капсулу улитки по частям, чтобы обнажить кохлеарный проток.Поместите щипцы под улитку и отделите их от вестибулярного органа и височной кости. Переложите улитку в новую 60-миллиметровую чашку, содержащую ледяной PBS. Чтобы изолировать кортиевские экстраплантированные органы, удерживайте орган у основания и кохлеарный проток в области базального крючка и осторожно отмотайте улитковый проток от модиолюса, не разрывая его.Затем удерживайте улитковый проток у основания и оттягивайте спиральную связку и сосудистые полосы. Для изоляции кохлеарных эксплантов используйте щипцы, чтобы отделить спиральный ганглий от костной спиральной пластинки и размотать модиол во время отслоения. Щипцами возьмитесь за область крючка и удалите спиральную связку с васкулярной полосой.Далее, снимаем мембрану Рейсснера по частям. Для переноса кохлеарных эксплантов обмакните лабораторный шпатель в чашку, содержащую эксплант. Поднимите эксплантат волосковыми клетками вверх вместе с несколькими микролитрами PBS, взмахнув шпателем.Поместите эксплант в горку с восемью лунками, осторожно помахивая шпателем в среде. Дайте экспланту скользнуть в камеру. С помощью пипетки объемом 100 микролитров извлеките 80 микролитров среды и выбросьте ее.Проверьте видимость волосковых клеток и спиральных ганглиозных нейронов под микроскопом. При необходимости используйте щипцы, чтобы раздвинуть перекрывающиеся ткани. Удалите оставшуюся среду из лунки.Теперь эксплант будет лежать более плоской на поверхности камеры. Через 10 секунд пипеткой отожмите одну или две капли среды рядом с эксплантом, а оставшуюся среду на некотором расстоянии, чтобы избежать отслоения эксплантата. Следите за тем, чтобы эксплантаты не двигались во время добавления среды.Инкубируйте камеру в течение двух часов, чтобы прочно прикрепить органы ко дну камеры. После инкубации среду следует аспирировать. И с помощью пипетки объемом 100 или 200 микролитров осторожно добавьте 300 микролитров свежей, предварительно подогретой полной среды.Конфокальные микроскопические изображения вращающегося диска показали, что кортинские эксплантаты органов крыс сохраняли свою структуру и общую длину как в нормальных, так и в стрессовых условиях. Кроме того, сканирующий конфокальный микроскоп продемонстрировал сохранившиеся волосковые клетки эксплантов из органов мышей вместе с волосковыми клетками, подвергающимися апоптозу. Протокол позволил осуществлять мониторинг биологических процессоров в живых кохлеарных клетках с использованием соответствующих проницаемых для клеток зондов и конфокального микроскопа с вращающимся диском.Культура этих кохлеарных эксплантов улучшает анализ взаимодействия между волосковыми клетками и спиральными ганглиозными клетками. Волосковые клетки кохлеарных имплантов были обнаружены с помощью маркера волосковых клеток MYO7A. Аналогичным образом, здоровые и поврежденные тела спиральных ганглиозных клеток и нейриты были идентифицированы с помощью нейронального маркера Tuj 1.В увеличенном обзоре были видны клеточные тела волосковых клеток, помеченных антителами MYO7A. Были идентифицированы наружные стереоцилии волосковых клеток и деконволютированные изображения отдельных внутренних стереоцилий волосковых клеток, меченных фаллоидином. Необходимо соблюдать осторожность во время процедур под микроскопом, особенно при отделении спирального ганглия от костной спиральной пластинки.Неповрежденные экспланты следует переносить и выравнивать с осторожностью. Этот протокол оптимизировал исследования in vitro на эксплантах внутреннего уха. Результаты этих исследований, такие как сигнальные пути и токсичность препарата, могут служить ориентиром для разработки дальнейших исследований in vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Генерация увековечен мышиного мозга микрососудистой эндотелиальной клеточной линии, как<em&gt; In Vitro</em&gt; Гематоэнцефалический барьер модели

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Экс внутриутробно электропорации и всего Экспланты полушарии: Простой экспериментальный метод исследования раннего развития коры

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Всего горе иммунофлуоресцентного окрашивания новорожденных Retina мыши по расследованию ангиогенеза<em&gt; В естественных условиях</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель для изучения клеточной патофизиологии в глобоидных Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Долгосрочный длительной Визуализация мыши Cochlear эксплантов

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Взаимодействие 3D конструктивных нейронов культур Микро-матриц электродов: Инновационный<em&gt; In Vitro</em&gt; Экспериментальная модель

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

Нейроповеденческих оценок в мышиной модели неонатальная гипоксически ишемического черепно-мозговой травмы

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Подготовка ритмично активные в Vitro неонатальной грызунов ствола мозга-спинного мозга и тонкий ломтик

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Модель in экстракорпоральное для изучения агрегация Тау с использованием ленто-вирусно-опосредованное производство нейронов человека

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Кохлеарная поверхность Подготовка в взрослой мыши

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...