Detta protokoll innehåller ett enkelt tillvägagångssätt för att effektivisera odlingsstegen, erhålla explantat av hög kvalitet och kommer att bidra till att utforska och avslöja molekylära mekanismer hos cochleaceller. Den största fördelen med denna teknik är minimal direkt organhantering genom att koordinera dissektionsstegen, lämplig polymerytbeläggning, optimerad medievolym och vidhäftningstid för explantaten. Denna teknik representerar en populär in vitro-metod för att studera sensorineural hörselnedsättning.
Detta kan användas för att upprätta ototoxiska modeller, utföra strukturell analys, utvärdera signalvägar och genomföra läkemedelsscreeningstudier. I princip kan denna metod tillämpas på olika vävnadsexplantat. Det kan också användas i forskning i innerörat för att få insikt i embryonala utvecklingsstadier.
Börja med att placera den halshuggna råttans huvud på den sterila dynan. Använd en sax och pincett för att ta bort underkäken, lyft sedan huden och dra tillbaka den från skallen. Placera pincetten i orbitalhåligheterna för att hålla skallen.
Använd ett vasst skalpellblad och skär försiktigt skallen längs sagittalsuturen och sedan det koronala suturområdet utan att skada cochlean. Ta nu bort hjärnan från de två skallhalvorna. Lokalisera snäckan i tinningbenet under mikroskopet och lossa den omgivande vävnaden mellan snäckan och tinningbenet.
Placera sedan pincetten i den överlägsna halvcirkelformade kanalen. Dra försiktigt bort tinningbenet från snäckan och håll kvar snäckan som är fäst vid vestibulen med tinningbenet. För in pincettspetsarna i apex-området, som är synligt som en vit linje, och ta bort brosksnäckan bit för bit för att exponera cochleakanalen.
Placera pincetten under snäckan och lossa den från det vestibulära organet och tinningbenet. Lägg över cochlean i en ny 60-millimetersskål med iskall PBS. För att isolera Corti-explantationsorgan, håll organet vid basen och cochleagången vid basalkroksområdet och linda försiktigt av cochleakanalen från modiolus utan att slita sönder den.
Håll sedan cochleakanalen vid basen och dra bort spiralligamentet och stria vascularis. För att isolera cochlea-explantat, använd en pincett för att lossa spiralgangliet från osseous spirallamina och linda upp modiolus under avlossningen. Ta tag i krokområdet med pincett och ta bort spiralligamentet med stria vascularis.
Dra sedan av Reissners membran bit för bit. För att överföra cochlea-explantaten doppar du en laboratoriespatel i skålen som innehåller explantatet. Lyft explanten med hårcellerna uppåt tillsammans med några mikroliter PBS genom att vifta med en spatel.
Placera explanten i en kammarbild med åtta brunnar genom att försiktigt vifta med spateln i mediet. Låt explanten glida in i kammaren. Använd en 100-liters pipett, ta bort 80 mikroliter medium och kassera det.
Kontrollera synligheten av hårceller och spiralganglieneuronceller under mikroskopet. Använd vid behov en pincett för att trycka isär överlappande vävnad. Ta bort det återstående mediet från brunnen.
Explanten kommer nu att ligga plattare på kammarens yta. Efter 10 sekunder pipetterar du tillbaka en eller två droppar av mediet precis bredvid explantatet och det återstående mediet en bit bort för att undvika att explanten lossnar. Se till att explanterna inte rör sig när mediet tillsätts.
Inkubera kammaren i två timmar för att fästa organen ordentligt i kammarens botten. Efter inkubationen aspirerar du mediet. Och använd en 100 eller 200 mikroliters pipett och tillsätt försiktigt 300 mikroliter färskt, förvärmt komplett medium.
De konfokalmikroskopiska bilderna från den snurrande skivan visade att råttans organ hos Corti-explantat bibehöll sin struktur och totala längd under både normala och stressade förhållanden. Dessutom visade ett svepande konfokalmikroskop överlevande hårceller från explantat från mössens organ tillsammans med hårceller som genomgick apoptos. Protokollet gjorde det möjligt att övervaka biologiska processorer i levande cochleaceller med hjälp av lämpliga cellpermeabla prober och ett konfokalmikroskop med snurrande skiva.
Odlingen av dessa cochlea-explantat förbättrar analysen av interaktionen mellan hårceller och spiralganglieceller. Hårcellerna i cochleaimplantat detekterades med hårcellsmarkören MYO7A. På liknande sätt identifierades friska och skadade spiralganglieceller och neuriter med hjälp av den neuronala markören Tuj 1.
I den förstorade översikten syntes cellkropparna hos de hårceller som var märkta med MYO7A-antikroppar. Stereocilier i de yttre hårcellerna och avvecklade bilder av enskilda stereocilier märkta med falloidin identifierades. Försiktighet måste iakttas under procedurerna under mikroskopet, särskilt när man separerar spiralgangliet från den beniga spirallaminan.
De intakta explantaten bör flyttas och riktas in med försiktighet. Detta protokoll optimerade in vitro-studier på explantat i innerörat. Resultaten av dessa studier, t.ex. signalvägar och läkemedelstoxicitet, kan vägleda utformningen av ytterligare in vivo-studier.
