Name: Author Spotlight: A Battery of Highly Reproducible Behavioral Tests to Validate an Angelman Syndrome Murine Model
Uploaded: 2023-10-20T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Battery of Highly Reproducible Behavioral Tests to Validate an Angelman Syndrome Murine Model at JoVE.com

Denna forskning stöddes av den tjeckiska vetenskapsakademin RVO 68378050, LM2018126 tjeckiska centret för fenogenomik som tillhandahålls av MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (uppgradering av det tjeckiska centrumet för fenogenomik: utveckling mot översättningsforskning av MEYS och ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (uppgradering av CCP-infrastruktur II av MEYS och ESI-fonderna) och OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (högre kvalitet och kapacitet för transgena modeller av MEYS och ERUF). Dessutom fick denna studie finansiering från den icke-statliga organisationen "Association of Gene Therapy (ASGENT)", Tjeckien (https://asgent.org/) och LM2023036 tjeckiska centret för fenogenomik som tillhandahålls av Tjeckiens ministerium för utbildning, ungdom och idrott.

Alla djur och försök som användes i denna studie genomgick etisk granskning och utfördes i enlighet med det europeiska direktivet 2010/63/EU. Studien har godkänts av den tjeckiska centralkommissionen för djurskydd. Mössen hölls i individuellt ventilerade burar och hölls vid en konstant temperatur på 22 ± 2 °C med en 12 timmars ljus/mörker-cykel. Mössen försågs med musmat och fritt vatten. Mössen hölls i grupper om tre till sex djur per bur. Ingen annan hantering än vägning utfördes före pro...

Validating a Murine Model of Angelman Syndrome Using Behavioral Tests

AS-modeller som skapats i olika murina stammar valideras vanligtvis med tester av djurs känslomässiga tillstånd, motoriska funktioner och kognitiva förmågor för att underlätta jämförelse med mänskliga symtom31,32. Ett motoriskt underskott i AS-modeller är det mest konsekventa fyndet i laboratorier, följt av ett oförändrat emotionalitetstillstånd hos mutanter och svårigheter att bygga bon31,32,33...

Angelmans syndrom (AS) är en sällsynt utvecklingsneurologisk funktionsnedsättning. Det vanligaste genetiska ursprunget till AS är en stor deletion av 15q11-q13-regionen i den maternella kromosomen, som finns hos nästan 74 % av patienterna1. Deletion av denna region orsakar förlust av UBE3A, den huvudsakliga orsakande genen för AS som kodar för ett E3 ubiquitinligas. Den faderliga allelen av UBE3A-genen i nervceller tystas i en process som kallas prägling. Som en följd av detta tillåter faderns prägling av genen endast moderns uttryck i det centrala nervsystemet (CNS)2. Därför leder UBE3A-gendeletion från den maternella kromosomen till utveckling av AS-symtom. Hos människa manifesterar sig AS vid cirka 6 månaders ålder, med utvecklingshämning som kvarstår under alla utvecklingsstadier och resulterar i allvarliga försvagande symtom hos drabbade individer 3,4. De viktigaste symtomen på sjukdomen är nedsatt fin- och grovmotorik, inklusive ryckig ataktisk gång, allvarlig talstörning och intellektuell funktionsnedsättning. Cirka 80 % av AS-patienterna lider också av sömnstörningar och epilepsi. Hittills är den enda tillgängliga behandlingen symtomatiska läkemedel, som minskar epileptiska anfall och förbättrar sömnkvaliteten1. Därför kommer utvecklingen av robusta djurmodeller med reproducerbara beteendefenotyper tillsammans med förfinad fenotypningsanalys att vara avgörande för att belysa de patofysiologiska mekanismerna för sjukdomen och upptäcka effektiva mediciner och behandlingar.
Komplexiteten i den mänskliga störning som påverkar CNS kräver att modellorganismer har ett jämförbart genom, fysiologi och beteende. Möss är populära som modellorganismer på grund av deras korta reproduktionscykel, lilla storlek och relativt enkla DNA-modifiering. År 1984 föreslog Paul Willner tre grundläggande kriterier för validering av sjukdomsmodeller: konstruktionen, ansiktet och den prediktiva validiteten, som används för att bestämma modellens värde5. Enkelt uttryckt återspeglar begreppsvaliditet de biologiska mekanismer som är ansvariga för sjukdomsutvecklingen, ansiktsvaliditet rekapitulerar dess symtom och prediktiv validitet beskriver modellsvaret på terapeutiska läkemedel.
För att följa ovanstående principer har vi valt den vanligaste genetiska etiologin, en stor deletion av maternella 15q11.2-13q-lokus inklusive UBE3A-genen, för att skapa AS-modellmöss. Vi använde CRISPR/Cas9-tekniken för att ta bort ett 76 225 bp långt område som spänner över hela UBE3A-genen, som omfattar både de kodande och icke-kodande elementen i genen, i möss från en C57BL/6N-bakgrund6. Vi avlade sedan djuren för att få UBE3A+/− heterozygota möss. För ansiktsvalidering av modellen använde vi djur från korsningar av UBE3A+/− honor och vildtypshanar för att få UBE3A+/- avkomma (stam med namnet C57BL/6NCrl-UBE3A<em1(IMPC)Ccpcz>/Ph och senare tilldelad UBE3A mGenedel/+) och kontrollera kullsyskon. Vi testade deras fin- och grovmotorik, känslosamhet och affekt för att rekapitulera AS-symtomen. I en tidigare artikel utvärderade vi även djurens kognitiva funktioner, då AS-patienter också lider av intellektuell funktionsnedsättning6. Vi fann dock inga kognitiva försämringar hos UBE3AmGenedel/+-möss, kanske på grund av djurens unga ålder vid tidpunkten för test7. Senare undersökning av de äldre djuren, cirka 18 veckor gamla, avslöjade ett underskott i beteendemässig flexibilitet under reverseringsinlärning i platspreferensparadigmet. Komplexiteten hos den utrustning som används för denna analys kräver dock en separat metodologisk modul och den ingår inte här.
De beteendetester som presenteras här tillhör de vanligaste fenotypningsverktygen inom genetisk forskning, tack vare deras höga prediktiva värde och tillräckliga konstruktvaliditet 8,9,10. Vi använde dessa tester för att validera en musmodell av AS genom att rekapitulera kärnsymtom på den mänskliga sjukdomen på ett reproducerbart, åldersoberoende sätt. Djurets emotionalitet utvärderades i den förhöjda plus labyrinten och de öppna fälttesterna. Båda dessa tester är baserade på konflikten mellan närmande och undvikande, där djur utforskar en ny miljö på jakt efter mat, skydd eller parningsmöjligheter samtidigt som de undviker ångestfyllda fack11. Dessutom används det öppna fälttestet för att testa en mus motoriska aktivitet8. Svansupphängningstestet används ofta inom depressionsforskning för att screena för nya antidepressiva läkemedel eller depressiva fenotyper i musknockoutmodeller12. Detta test utvärderar den förtvivlan som djur utvecklar över tid i en oundviklig situation. Motorisk inlärning och detaljerade gångegenskaper bestämdes på rotarod respektive i DigiGait. Djurens uthållighet på den accelererande staven kännetecknar dess balans- och rörelsekoordinationsförmåga, medan detaljerad analys av en mus stegmönster är en känslig utvärdering av neuromuskulära funktionsnedsättningar kopplade till många neurogenerativa rörelsestörningar13,14,15. Fragmenteringstestet är en del av standardmetoden för att upptäcka impulsivt beteende hos gnagare, och eftersom det använder naturligt gnagarbyggande beteende indikerar det djurets välbefinnande16,17.
Storleken på försöksgrupperna var ett resultat av en kompromiss för att uppfylla kraven på 3R-regeln och effektiv användning av bisamhällenas avelsprestanda. För att få statistisk styrka hade grupperna dock inte mindre än 10 individer, på grund av att det fanns tillräckligt många häckande par. Dessvärre resulterade avelsresultaten inte alltid i ett tillräckligt antal djur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cages, individually ventilated</td>
			<td>Techniplast</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiGait</td>
			<td>Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level 
			Unit 110 
			Framingham, MA 01701, USA</td>
			<td>Equipment was tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA Nestlet squares</td>
			<td>Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK</td>
			<td>Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.</td>
			<td>Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse chow</td>
			<td>Altramion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotarod</td>
			<td>TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 
			12489 Berlin, Germany</td>
			<td>Equipment was tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail Suspension Test</td>
			<td>Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles 
			FRANCE</td>
			<td>Reference: BIO-TST5</td>
			<td>Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore medical tape</td>
			<td>Medical M, Ltd.</td>
			<td>P-AIRO1291</td>
			<td>The tape used to attach an animal to the hook by its tail.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewer - Video Tracking System</td>
			<td>Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 
			53111 Bonn, Germany</td>
			<td>Equipment with software were tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,&#160; 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral characterization of an angelman syndrome mouse model

Detta manuskript beskriver ett batteri av beteendetester som finns tillgängliga för att karakterisera Angelmans syndrom (AS)-liknande fenotyper i en etablerad musmodell av AS. Vi använder rotarodinlärningsparadigmet, detaljerad gånganalys och bobyggnadstest för att upptäcka och karakterisera motoriska nedsättningar hos djur. Vi testar djurens emotionalitet i det öppna fältet och förhöjda plus labyrinttester, samt effekten i svansupphängningstestet. När AS-möss testas i det öppna fälttestet bör resultaten tolkas med försiktighet, eftersom motoriska dysfunktioner påverkar musens beteende i labyrinten och förändrar aktivitetspoängen.
Reproducerbarheten och effektiviteten hos de presenterade beteendetesterna har redan validerats i flera oberoende Uba3a-muslinjer med olika knockout-varianter, vilket gör denna uppsättning tester till ett utmärkt valideringsverktyg inom AS-forskning. Modeller med relevant konstrukt- och ansiktsvaliditet kommer att motivera ytterligare undersökningar för att belysa sjukdomens patofysiologi och möjliggöra utveckling av kausala behandlingar.

Angelman syndrome (AS) is a rare neurodevelopmental disease. The most common genetic origin of AS is a large deletion of the 15q11-q13 region of the maternally-derived chromosome, which is found in nearly 74% of patients1. Deletion of this region causes the loss of UBE3A, the main causative gene of AS that encodes an E3 ubiquitin ligase. The paternal allele of the UBE3A gene in neurons is silenced in a process known as imprinting. As a consequence, paternal imprinting of the gene allows only maternal expression in the central nervous system (CNS)2. Therefore, UBE3A gene deletion from the maternally-derived chromosome leads to the development of AS symptoms. In humans, AS manifests at around 6 months of age, with developmental retardation that persists throughout all developmental stages and results in severe debilitating symptoms in affected individuals3,4. The core symptoms of the disorder include the deficit of fine and gross motor skills, including jerky ataxic gait, serious speech impairment, and intellectual disability. Approximately 80% of AS patients also suffer from sleep disturbances and epilepsy. To date, the only available treatment are symptomatic drugs, which reduce epileptic seizures and improve sleep quality1. Therefore, the development of robust animal models with reproducible behavioral phenotypes alongside refined phenotyping analysis will be essential to elucidate the pathophysiological mechanisms of the disorder and discover effective medications and treatments.
The complexity of the human disorder affecting the CNS demands model organisms to possess a comparable genome, physiology, and behavior. Mice are popular as a model organism due to their short reproductive cycle, small size, and relative ease of DNA modification. In 1984, Paul Willner proposed three basic disease model validation criteria: the construct, face, and predictive validity, which are used to determine the model&#39;s value5. Simply, construct validity reflects the biological mechanisms responsible for the disorder development, face validity recapitulates its symptoms, and predictive validity describes the model response to therapeutic drugs.
To adhere to the above principles, we have chosen the most common genetic etiology, a large deletion of the maternal 15q11.2-13q locus including the UBE3A gene, to create AS model mice. We used the CRISPR/Cas9 technique to delete a 76,225 bp long region spanning the entire UBE3A gene, encompassing both the coding and non-coding elements of the gene, in mice from a C57BL/6N background6. We then bred the animals to obtain UBE3A+/&#8722; heterozygous mice. For face validation of the model, we used animals from crosses of UBE3A+/&#8722; females and wild-type males to gain UBE3A+/- progeny (strain named C57BL/6NCrl-UBE3A&#60;em1(IMPC)Ccpcz&#62;/Ph and later assigned as UBE3AmGenedel/+) and control littermates. We tested their fine and gross motor skills, emotionality, and affect to recapitulate core AS symptoms. In a previous article, we also evaluated the animals&#39; cognitive functions, as AS patients also suffer from intellectual disability6. However, we found no cognitive impairments in UBE3AmGenedel/+ mice, perhaps due to the young age of the animals at the time of testing7. Later examination of the older animals, around 18 weeks old, revealed a deficit in behavioral flexibility during reversal learning in the place preference paradigm. However, the complexity of the employed equipment for this analysis requires a separate methodological module and it is not included here.
The behavioral tests presented here belong to the common phenotyping tools in genetic research, thanks to their high predictive value and sufficient construct validity8,9,10. We used these tests to validate a mouse model of AS by recapitulating core symptoms of the human disease in a reproducible, age-independent manner. The emotionality of the animal was evaluated in the elevated plus maze and open field tests. Both of these tests are based on the approach-avoidance conflict, where animals explore a new environment in search of food, shelter, or mating opportunities while simultaneously avoiding anxiogenic compartments11. Additionally, the open field test is used to test a mouse&#39;s locomotor activity8. The tail suspension test is widely used in depression research to screen for new antidepressant drugs or depressive-like phenotypes in mouse knockout models12. This test evaluates the despair that animals develop over time in an inescapable situation. Motor learning and detailed gait characteristics were determined on the rotarod and in DigiGait, respectively. Animal endurance on the accelerating rod characterizes its balance and movement coordination skills, while detailed analysis of a mouse&#39;s step patterns is a sensitive evaluation of neuromuscular impairments connected to many neurogenerative movement disorders13,14,15. The nestlet shredding test is part of the standard methodology for detecting impulsive behavior in rodents, and since it utilizes natural rodent building behavior, it indicates the animal&#39;s well-being16,17.
The size of the experimental groups was a result of a compromise to meet the 3R rule demands and efficient usage of colony breeding performance. However, to obtain statistical power, the groups had no fewer than 10 individuals, due to the establishment of a sufficient amount of breeding pairs. Unfortunately, breeding performance did not always result in a sufficient number of animals.

Author Spotlight: A Battery of Highly Reproducible Behavioral Tests to Validate an Angelman Syndrome Murine Model 

Beteendekarakterisering av en musmodell med Angelmans syndrom

Förhöjd plus labyrint och öppna fälttester EPM- och OF-testerna använder gnagares naturliga tendens att utforska nya miljöer18,19. Utforskandet styrs av en närmande-undvikande konflikt, där gnagare väljer mellan att utforska en ny miljö och att undvika eventuell fara. Djur utforskar okända platser i jakt på skydd, social kontakt eller födosök. Nya platser kan dock innebära riskfaktorer som rovdjur eller konkurrenter. Både OF-te...

Watch this Scientific Journal Video about A Battery of Highly Reproducible Behavioral Tests to Validate an Angelman Syndrome Murine Model at JoVE.com

Detta manuskript presenterar en uppsättning mycket reproducerbara beteendetester för att validera en musmodell med Angelmans syndrom.

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...

Vårt mål är att belysa genernas fysiologiska roller med hjälp av möss som experimentell modell. Vi fokuserar också på att utveckla musmodeller av specifika sjukdomar som forskare kan använda för att undersöka sjukdomsorsaker och utveckla effektiva behandlingar. Ett exempel på sådan aktivitet är musmodellen av Angelmans syndrom.Den mest lovande nya tekniken med potential är utan tvekan att integrera artificiell intelligens baserad på djupinlärningstekniker i djurförsök. Detta tillvägagångssätt kan användas för att övervaka djurens beteende i hemburen direkt utan att försöksledaren behöver störa djuren. Den största utmaningen inom beteendestudier just nu är reproducerbarheten.Därför introducerar vi ett batteri av tester som validerar modellens Angelman-syndrom på ett sätt som inte är beroende av modellens ålder eller art. Vi använder etablerade beteendetester för att validera vår AS-modell. Men med det nya tillvägagångssättet för modellutvecklingen som liknar det mänskliga tillståndet med en stor deletion.Med hjälp av CRISPR-teknik raderade vi hela UBE3A-genen från musgenomet. Till skillnad från andra modeller där borttagningen är begränsad till 3 kB. Vi arbetar med att utveckla en genetisk terapi som kan återställa ett symptom i en musmodell.