Name: Author Spotlight: Advancements in Molecular Biomarker Testing for Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer
Uploaded: 2023-09-08T14:20:00
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हम थर्मो फिशर साइंटिफिक को धन्यवाद देते हैं कि उन्होंने हमें अपने उपकरण और सामग्रियों का उपयोग करने की संभावना दी।

सभी प्रक्रियाओं को स्थानीय नैतिकता समिति (मानव अनुसंधान आचार समिति, सेंटर हॉस्पिटलियर यूनिवर्सिटेयर डी नाइस, ट्यूमरोथेक बीबी-0033-00025) द्वारा अनुमोदित किया गया है। नमूनों और उत्पन्न डेटा का उपयोग करने क?...

Assessing Genomic Alteration in Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer Patients

किसी भी चरण एनएस-एनएसएलसी के निदान पर आणविक परिवर्तन मूल्यांकन के लिए रिफ्लेक्स परीक्षण के रूप में अल्ट्रा-फास्ट एम्पलीकॉन-आधारित एनजीएस दृष्टिकोण का विकास एनएस-एनएससीएलसी 5,22,23...

पिछले दशक में, लक्षित और इम्यूनो-थेरेपी के विकास ने गैर-स्क्वैमस गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएस-एनएससीएलसी)1,2के समग्र अस्तित्व (ओएस) में काफी वृद्धि की है। इस संबंध में, एनएस-एनएससीएलसी का इलाज करते समय विश्लेषण करने के लिए अनिवार्य जीन और आणविक लक्ष्यों की संख्या पिछले कुछ वर्षों में 3,4 बढ़ गई है।
वर्तमान अंतरराष्ट्रीय दिशानिर्देश उन्नत एनएस-एनएससीएलसी5 के निदान पर ईजीएफआर, एएलके, आरओएस 1, बीआरएएफ, एनटीआरके, आरईटी और एमईटी के परीक्षण की सलाह देते हैं। इसके अलावा, जैसा कि नई दवाओं ने हाल ही में नैदानिक परीक्षणों में बहुत ही आशाजनक परिणाम दिए हैं, अतिरिक्त जीनोमिक परिवर्तनों को जल्द ही कई अतिरिक्त जीन, विशेष रूप से KRAS और HER2, BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1, और NUT 6,7,8,9 के साथ जांचा जाएगा। इसके अलावा, एसटीके 11, केईएपी 1, और टीपी 53 जैसे विभिन्न संबद्ध जीनों की स्थिति कुछ लक्षित उपचारों और / या प्रतिरक्षा चेकपॉइंट इनहिबिटर (आईसीआई) 10,11,12के लिए प्रतिक्रिया या प्रतिरोध की बेहतर भविष्यवाणी के लिए मजबूत रुचि हो सकती है।
महत्वपूर्ण रूप से, सावधानीपूर्वक नैदानिक निर्णय लेने को सुनिश्चित करने के लिए आणविक परिवर्तनों को महत्वपूर्ण देरी के बिना सूचित किया जाना चाहिए। एक ट्यूमर के आणविक लक्षण वर्णन की अनुपस्थिति इस तरह के साथ / इम्यूनोथेरेपी के बिना कीमोथेरेपी के रूप में गैर लक्षित चिकित्सा की दीक्षा के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, एक उप-इष्टतम उपचार रणनीति के लिए अग्रणी, के रूप में कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया कार्रवाई योग्य परिवर्तन के साथ रोगियों में सीमित है, जैसे ईजीएफआर उत्परिवर्तन या जीन संलयन13.
इसके अलावा, नियोएडजुवेंट और/या सहायक सेटिंग्स में लक्षित उपचार/इम्यूनोथेरेपी के वर्तमान विकास से प्रारंभिक चरण एनएस-एनएससीएलसी में कम से कम, ईजीएफआर और एएलके परिवर्तनों की व्यवस्थित रूप से तलाश हो सकती है क्योंकि आईसीआई को केवल ट्यूमर में प्रशासित किया जाना चाहिए जो ईजीएफआर और एएलके14 के लिए जंगली-प्रकार हैं। प्रारंभिक चरण एनएस-एनएससीएलसी में ईजीएफआर उत्परिवर्तन की उपस्थिति के लिए परीक्षण करना अब भी अनिवार्य है, क्योंकि ओसिमर्टिनिब (तीसरी पीढ़ी के ईजीएफआर टाइरोसिन किनसे अवरोधक) का उपयोग ईजीएफआर-उत्परिवर्ती एनएस-एनएससीएलसी15 में सहायक चिकित्सा के रूप में किया जा सकता है।
एनएस-एनएससीएलसी रोगियों में विभिन्न लक्षित उपचारों और/या इम्यूनोथेरेपी की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने में विभिन्न बायोमार्करों के आकलन की रणनीति तेजी से आगे बढ़ रही है, जिससे इन बायोमार्कर की पहचान क्रमिक रूप से कठिन 3,16 हो जाती है। इस संबंध में, अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) अब एनएस-एनएससीएलसी 5,17 में जीन परिवर्तन के उच्च थ्रूपुट समानांतर मूल्यांकन के लिए इष्टतम दृष्टिकोण है।
हालाँकि, NGS वर्कफ़्लो में महारत हासिल करना मुश्किल हो सकता है और TAT18,19 तक काम कर सकता है। इस प्रकार, कई केंद्र अभी भी अनुक्रमिक दृष्टिकोण (इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), स्वस्थानी संकरण (मछली) और / या लक्षित अनुक्रमण में प्रतिदीप्ति करते हैं। हालांकि, यह रणनीति छोटे नमूने के आकार के मामले में सीमित है और सबसे ऊपर, एनएस-एनएससीएलसी20 में परीक्षण करने के लिए आवश्यक कार्रवाई योग्य उत्परिवर्तनों की बढ़ती संख्या के कारण। इस प्रकार, जीन परिवर्तनों के तेजी से मूल्यांकन की अनुमति देने वाली अल्ट्रा-फास्ट और सीधी परीक्षण विधियां इष्टतम नैदानिक निर्णय लेने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण हो गई हैं। इसके अलावा, आणविक परीक्षण के लिए अनुमोदित और मान्यता प्राप्त सिस्टम विशिष्ट लक्षित उपचारों के पर्चे के लिए अनिवार्य होते जा रहे हैं।
यहां, हम एनएस-एनएससीएलसी के आणविक परीक्षण के लिए एक अल्ट्रा-फास्ट और स्वचालित एम्पलीकॉन-आधारित डीएनए/आरएनए एनजीएस परख का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग क्लिनिकल एंड एक्सपेरिमेंटल पैथोलॉजी लेबोरेटरी (एलपीसीई), नाइस यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल, फ्रांस की प्रयोगशाला में किया जाता है और फ्रेंच प्रत्यायन समिति (सीओएफआरएसी) (https://www.cofrac.fr/) द्वारा आईएसओ 15189 मानदंड के अनुसार मान्यता प्राप्त है। COFRAC प्रमाणित करता है कि प्रयोगशाला द्वारा किए गए पैनल के साथ एक अनुक्रमक पर स्वचालित NGS में आणविक विश्लेषण में परीक्षण/अंशांकन की गतिविधियों के लिए आवेदन के मानक ISO 15189 और COFRAC नियमों की आवश्यकताओं को पूरा करती है। मान्यता प्राप्त अंतरराष्ट्रीय मानक आईएसओ 15189 के अनुसार प्रत्यायन एक परिभाषित दायरे और इस प्रयोगशाला में एक उपयुक्त प्रबंधन प्रणाली के उचित संचालन के लिए प्रयोगशाला की तकनीकी क्षमता को प्रदर्शित करता है। इस वर्कफ़्लो के लाभ और सीमाएं, रिपोर्ट प्राप्त करने के लिए ऊतक बायोप्सी नमूनों की तैयारी से शुरू होती हैं, पर चर्चा की जाती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well hard shell plate clear</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>4483354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive PCR Plate Foil</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>AB0626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoLys M tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>A38738</td>
			<td>FFPE sample processing tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genexus Barcodes 1-32 HD</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>A40261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>A40269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genexus Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>A40266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genexus Purification Instrument</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>A48148</td>
			<td>Automated purification instrument (API)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genexus Sequencing Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>A40271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>A40263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genexus Integrated Sequencer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>A45727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent&#160; Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>A45539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncomine&#160; Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td>
			<td>A46291</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-fast amplicon-based next-generation sequencing in non-squamous non-small cell lung cancer

गैर-स्क्वैमस गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएस-एनएससीएलसी) रोगियों के लक्षित चिकित्सा के लिए परीक्षण किए जाने वाले आणविक परिवर्तनों की संख्या में पिछले कुछ वर्षों में काफी वृद्धि हुई है। उन्नत या मेटास्टैटिक एनएस-एनएससीएलसी रोगियों की इष्टतम देखभाल के लिए आणविक असामान्यताओं का पता लगाना अनिवार्य है, जिससे लक्षित उपचारों को समग्र अस्तित्व में सुधार के साथ प्रशासित किया जा सकता है। फिर भी, ये ट्यूमर प्रतिरोध के तंत्र विकसित करते हैं जो उपन्यास उपचारों का उपयोग करके संभावित रूप से लक्षित होते हैं। कुछ आणविक परिवर्तन भी उपचार प्रतिक्रिया को संशोधित कर सकते हैं। NS-NSCLC के आणविक लक्षण वर्णन को अंतर्राष्ट्रीय दिशानिर्देशों द्वारा अनुशंसित 10 कार्य दिवसों से कम समय में थोड़े टर्नअराउंड समय (TAT) में किया जाना है। इसके अलावा, जीनोमिक विश्लेषण के लिए ऊतक बायोप्सी की उत्पत्ति विविध है, और कम आक्रामक तरीकों और प्रोटोकॉल के विकास के साथ उनका आकार लगातार कम हो रहा है। नतीजतन, पैथोलॉजिस्ट को एक कुशल और तेजी से निदान रणनीति बनाए रखते हुए प्रभावी आणविक टेकनीक करने के लिए चुनौती दी जा रही है। यहां, हम एनएस-एनएससीएलसी रोगियों के निदान पर दैनिक दिनचर्या अभ्यास में उपयोग किए जाने वाले अल्ट्रा-फास्ट एम्पलीकॉन-आधारित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं। हमने दिखाया कि यह प्रणाली एक उपयुक्त टीएटी में थोरैसिक ऑन्कोलॉजी में सटीक चिकित्सा में उपयोग किए जाने वाले वर्तमान आणविक लक्ष्यों की पहचान करने में सक्षम है।

Over the last decade, the development of targeted and immuno-therapies has significantly increased the overall survival (OS) of non-squamous non-small cell lung cancer (NS-NSCLC)1,2. In this regard, the ,number of mandatory genes and molecular targets to analyze when treating NS-NSCLC has increased over the last few years3,4.
Current international guidelines recommend testing EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET, and MET at diagnosis of advanced NS-NSCLC5. Moreover, as new drugs have recently given very promising results in clinical trials, additional genomic alterations will shortly be screened in a number of additional genes, notably KRAS and HER2, along with BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1, and NUT6,7,8,9. In addition, the status of different associated genes, such as STK11, KEAP1, and TP53 may be of strong interest for a better prediction of the response or resistance to some targeted therapies and/or immune checkpoint inhibitors (ICIs)10,11,12.
Importantly, the molecular alterations must be reported without significant delay to ensure careful clinical decision-making. The absence of molecular characterization of a tumor may lead to the initiation of non-targeted therapies such as chemotherapy with/without immunotherapy, leading to a suboptimal treatment strategy, as chemotherapy response is limited in patients with actionable alterations, such as EGFR mutations or gene fusions13.
Moreover, the current development of targeted therapies/immunotherapies in neoadjuvant and/or adjuvant settings could lead to systematically looking for, at least, EGFR and ALK alterations in early-stage NS-NSCLC as ICIs should be administered only in tumors that are wild-type for EGFR and ALK14. It is now also mandatory to test for the presence of EGFR mutations in early-stage NS-NSCLC, since osimertinib (a third-generation EGFR tyrosine kinase inhibitor) can be used as adjuvant therapy in EGFR-mutant NS-NSCLC15.
The strategy for the assessment of the different biomarkers in predicting the response to different targeted therapies and/or immunotherapies in NS-NSCLC patients is moving fast, which makes the identification of these biomarkers sequentially difficult3,16. In this regard, Next-Generation Sequencing (NGS) is now the optimal approach for high throughput parallel assessment of gene alterations in NS-NSCLC5,17.
However, NGS workflow can be difficult to master and may conduct to longer TAT18,19. Thus, many centers still perform sequential approaches (immunohistochemistry (IHC), fluorescence in situ hybridization (FISH) and/or targeted sequencing). However, this strategy is limited in case of small sample size and, above all, because of the increased number of actionable mutations that are required to be tested in NS-NSCLC20. Thus, ultra-fast and straightforward testing methods allowing the rapid assessment of gene alterations have become increasingly important for optimal clinical decision-making. Moreover, approved and accreditated systems for molecular testing are becoming mandatory for the prescription of specific targeted therapies.
Here, we describe an ultra-fast and automated amplicon-based DNA/RNA NGS assay for molecular testing of NS-NSCLC that is used in the Laboratory of Clinical and Experimental Pathology Laboratory (LPCE), Nice University Hospital, France and is accredited according to the ISO 15189 norm by the French Accreditation Committee (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). The COFRAC certifies that the laboratory fulfills the requirements of the standard ISO 15189 and COFRAC rules of application for the activities of testing/calibration in molecular analysis in automated NGS on a sequencer with the panel performed by the laboratory. Accreditation per the recognized international standard ISO 15189 demonstrates the laboratory&#8217;s technical competence for a defined scope and the proper operation of an appropriate management system in this laboratory. The benefits and limitations of this workflow, starting from the preparation of tissue biopsy samples to obtaining the report, are discussed.

Author Spotlight: Advancements in Molecular Biomarker Testing for Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer 

गैर-स्क्वैमस गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर में अल्ट्रा-फास्ट एम्पलीकॉन-आधारित अगली पीढ़ी का अनुक्रमण

Nowadays, targeted therapies for non-small cell lung cancer require rapid detection of multiple genomic alterations. So it's crucial for an optimal care, as thoracic biopsy are often small and contain few tumor cells. So we present an ultra-fast Next-Generation Sequencing workflow that is implemented for routine non-small cell lung cancer diagnosis in the pathology laboratory.Currently targeted NGS using different panel sizes, one gene sequencing testing using RT-PCR, digital PCR, fluorescence in situ hybridization, and immunohistochemistry are the different methods used to detect molecular alterations. However, most of these methods can be time and tissue material consuming, leading to a delayed diagnosis, and a risk of tissue exertion. The challenge lies in efficiently detecting multiple molecular alterations while saving materials and answering a speeding diagnosis.The workflow provides thoracic oncologist with comprehensive tumor information, including histological diagnosis, PD-L1 status, and targetable genomic aberrations. It enables rapid treatment decision making for optimal therapy selection. Our protocol identify all key molecular targets in thoracic oncology based on ESMO, NCCN, and ASCO recommendations, delivers timely results even with small samples sizes and limited DNA/RNA.And so the automated system reduced technician workload with just three hours of wet lab manipulation. We aim to focus on the rapid and comprehensive genomic profiling characterizations of tumors by developing a large NGS panel for tissue and plasma samples in the future. However, increased strategies to detect numerous molecular alterations in small sample sizes and cytological samples using large panels are urgently needed.

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हमारे हाल के प्रकाशनों21 में विस्तार से वर्णित है, हमने अल्ट्रा-फास्ट एम्पलीकॉन-आधारित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण का उपयोग करके एनएस-एनएससीएल...

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गैर-स्क्वैमस गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएस-एनएससीएलसी) देखभाल प्रबंधन के लिए परीक्षण किए जाने वाले आणविक बायोमार्कर की वृद्धि ने तेजी से और विश्वसनीय आणविक पहचान विधियों के विकास को प्रेरित किया है। हम अल्ट्रा-फास्ट-अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) दृष्टिकोण का उपयोग करके एनएस-एनएससीएलसी रोगियों के लिए जीनोमिक परिवर्तन मूल्यांकन के लिए एक वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं।

The number of molecular alterations to be tested for targeted therapy of non-squamous non-small cell lung cancer (NS-NSCLC) patients has significantly ...

आजकल, गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के लिए लक्षित उपचारों में कई जीनोमिक परिवर्तनों का तेजी से पता लगाने की आवश्यकता होती है। इसलिए यह एक इष्टतम देखभाल के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि थोरैसिक बायोप्सी अक्सर छोटी होती है और इसमें कुछ ट्यूमर कोशिकाएं होती हैं। इसलिए हम एक अल्ट्रा-फास्ट नेक्स्ट-जेनरेशन सीक्वेंसिंग वर्कफ़्लो प्रस्तुत करते हैं जो पैथोलॉजी प्रयोगशाला में नियमित गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर निदान के लिए लागू किया जाता है।वर्तमान में विभिन्न पैनल आकारों का उपयोग करके लक्षित एनजीएस, आरटी-पीसीआर, डिजिटल पीसीआर, सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति, और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके एक जीन अनुक्रमण परीक्षण आणविक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न तरीके हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश विधियां समय और ऊतक सामग्री की खपत कर सकती हैं, जिससे निदान में देरी हो सकती है, और ऊतक परिश्रम का खतरा हो सकता है। चुनौती सामग्री को बचाने और तेजी से निदान का जवाब देने के दौरान कई आणविक परिवर्तनों का कुशलतापूर्वक पता लगाने में निहित है।वर्कफ़्लो थोरैसिक ऑन्कोलॉजिस्ट को व्यापक ट्यूमर जानकारी प्रदान करता है, जिसमें हिस्टोलॉजिकल निदान, पीडी-एल 1 स्थिति और लक्षित जीनोमिक विपथन शामिल हैं। यह इष्टतम चिकित्सा चयन के लिए तेजी से उपचार निर्णय लेने में सक्षम बनाता है। हमारा प्रोटोकॉल ईएसएमओ, एनसीसीएन और एएससीओ सिफारिशों के आधार पर थोरैसिक ऑन्कोलॉजी में सभी प्रमुख आणविक लक्ष्यों की पहचान करता है, छोटे नमूनों के आकार और सीमित डीएनए / आरएनए के साथ भी समय पर परिणाम देता है।और इसलिए स्वचालित प्रणाली ने केवल तीन घंटे के गीले प्रयोगशाला हेरफेर के साथ तकनीशियन कार्यभार को कम कर दिया। हम भविष्य में ऊतक और प्लाज्मा नमूनों के लिए एक बड़ा एनजीएस पैनल विकसित करके ट्यूमर के तेजी से और व्यापक जीनोमिक प्रोफाइलिंग लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित करना चाहते हैं। हालांकि, बड़े पैनलों का उपयोग करके छोटे नमूना आकारों और साइटोलॉजिकल नमूनों में कई आणविक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए बढ़ी हुई रणनीतियों की तत्काल आवश्यकता है।