Name: Author Spotlight: Cistrome Analysis in Mouse Muscle Stem Cells
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00
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हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए अनास्तासिया बानवर्थ को धन्यवाद देते हैं। हम आईजीबीएमसी पशु घर सुविधा, सेल कल्चर, माउस क्लिनिकल इंस्टीट्यूट (आईसीएस, इलकिर्च, फ्रांस), इमेजिंग, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, फ्लो साइटोमेट्री और जेनोमईस्ट प्लेटफॉर्म को धन्यवाद देते हैं, जो 'फ्रांस जेनोमिक' कंसोर्टियम (एएनआर -10-आईएनबीएस -0009) का सदस्य है।
इंटरडिसिप्लिनरी थीमैटिक इंस्टीट्यूट आईएमसीबीआईओ का यह काम, स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय, सीएनआरएस और इनसेरम के आईटीआई 2021-2028 कार्यक्रम के हिस्से के रूप में, आईडीएक्स यूनिस्ट्रा (एएनआर -10-आईडीईएक्स -0002) और एसएफआरआई-स्ट्रैट'यूएस परियोजना (एएनआर 20-एसएफआरआई-0012) और यूरो आईएमसीबीआईओ (एएनआर -17-यूरो -002) द्वारा समर्थित था। आईएनएसईआरएम, सीएनआरएस, यूनिस्ट्रा, आईजीबीएमसी, एजेंस नेशनल डे ला रेचरचे (एएनआर-16-सीई11-0009, एआर2जीआर), एएफएम-टेलेथन रणनीतिक कार्यक्रम 24376 (डीडी को), आईएनएसईआरएम युवा शोधकर्ता अनुदान (डीडी को), एएनआर -10-एलएबीएक्स-0030-आईएनआरटी और एएनआर द्वारा प्रबंधित एक फ्रांसीसी राज्य निधि द्वारा अतिरिक्त वित्त पोषण प्रदान किया गया था। जे.आर. को यूनिवर्सिटी फ्रैंको-एलेमांडे और मिनिस्टेरे डी एल'एनसेग्नेमेंट सुपेरिअर डी ला रेचरचे एट डी एल'इनोवेशन से प्रोग्राम सीडीएफए-07-22 द्वारा समर्थित किया गया था, और केजी को एसोसिएशन ऑफ ला रेचरचे ए एल'आईजीबीएमसी (एआरआई) द्वारा समर्थित किया गया था।

चूहों को राष्ट्रीय पशु देखभाल दिशानिर्देशों (यूरोपीय आयोग के निर्देश 86/609 / सीईई) के अनुपालन में एक मान्यता प्राप्त पशु घर में रखा गया था; अनुसंधान के लिए प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग पर फ्रांसीसी डिक्री ?...

Satellite Cell Isolation from Mouse Limb Muscles and Flow Cytometry Analysis

<ol>
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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue.">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 20 (1), 139 (2018).</li><li>Rico, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+cell+doublet+profiles:+Comparison+of+light+scattering+with+fluorescence+measurement+techniques.">Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques.</a> Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).</li><li>Schreiber, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+NEUROG3+occupancy+in+the+human+pancreatic+endocrine+gene+regulatory+network.">Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network.</a> Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).</li><li>Rovito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myod1+and+GR+coordinate+myofiber-specific+transcriptional+enhancers.">Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+collagenase+XI+and+liberase+H1+for+the+isolation+of+human+pancreatic+islets.">Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets.</a> Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li><li>Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. 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Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa.">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).</li><li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells.">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).</li></ol>

वर्तमान अध्ययन माउस उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक मानकीकृत, विश्वसनीय और आसानी से प्रदर्शन करने वाली विधि की रिपोर्ट करता है, साथ ही साथ कट एंड रन विधि द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन ...

कंकाल धारीदार मांसपेशियां कुलमानव शरीर के वजन का औसतन 40% प्रतिनिधित्व करती हैं। मांसपेशी फाइबर चोट पर पुनर्जनन के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जिसे नवगठित मायोसाइट्स के संलयन और नए मायोफाइबर की पीढ़ी द्वारा वर्णित किया जाता है जोक्षतिग्रस्त लोगों को प्रतिस्थापित करते हैं2। 1961 में, अलेक्जेंडर माउरो ने मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की आबादी की सूचना दी जिसे उन्होंने उपग्रह कोशिका3 कहा। ये स्टेम सेल प्रतिलेखन कारक युग्मित बॉक्स 7 (पैक्स 7) को व्यक्त करते हैं, और बेसल लैमिना और मांसपेशी फाइबर4 के सरकोलेममा के बीच स्थित होते हैं। उन्हें भेदभाव 34 (सीडी 34; एक हेमटोपोइएटिक, एंडोथेलियल पूर्वज और मेसेनकाइमल स्टेम सेल मार्कर), इंटीग्रिन अल्फा 7 (आईटीजीए 7; एक चिकनी, हृदय और कंकाल की मांसपेशी मार्कर), साथ ही सी-एक्स-सी केमोकाइन रिसेप्टर टाइप 4 (सीएक्ससीआर 4; एक लिम्फोसाइट, हेमटोपोइएटिक और सैटेलाइट सेल मार्कर) के क्लस्टर को व्यक्त करने की सूचना दी गई थी। बेसल स्थितियों में, उपग्रह कोशिकाएं एक विशेष माइक्रोएन्वायरमेंट में रहती हैं जो उन्हें एकस्थिर अवस्था में रखती हैं। मांसपेशियों की क्षति पर, वे सक्रिय हो जाते हैं, प्रसार करते हैं, और मायोजेनेसिस7 से गुजरते हैं। हालांकि, मांसपेशियों की कोशिकाओं की कुल संख्या के केवल एक मामूली अंश में योगदान करते हुए, उनके जीनोम-व्यापी विश्लेषण विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, खासकर शारीरिक सेटिंग्स (कुल कोशिकाओं का <1%) के तहत।
उपग्रह कोशिकाओं से क्रोमैटिन अलगाव के लिए विभिन्न तरीकों का वर्णन किया गया है, जिसमें क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपेशन शामिल है, जिसके बाद बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण (CHIP-seq) या लक्ष्य और टैगेशन (CUT &tag) प्रयोगों के तहत दरार शामिल है। फिर भी, ये दो तकनीकें कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं प्रस्तुत करती हैं जो निर्विवाद रहती हैं। दरअसल, CHIP-seq को पर्याप्त क्रोमैटिन उत्पन्न करने के लिए उच्च मात्रा में प्रारंभिक सामग्री की आवश्यकता होती है, जिसका एक बड़ा हिस्सा सोनिकेशन चरण के दौरान खो जाता है। कट एंड टैग कम सेल संख्या के लिए अधिक उपयुक्त है, लेकिन टीएन 5 ट्रांसपोसेस गतिविधि के कारण सीएचआईपी-सेक की तुलना में अधिक ऑफ-टारगेट क्लीवेज साइट्स उत्पन्न करता है। इसके अलावा, चूंकि इस एंजाइम में ओपन-क्रोमैटिन क्षेत्रों के लिए एक उच्च संबंध है, इसलिए सीयूटी एंड टैग दृष्टिकोण का उपयोग हेटेरोक्रोमैटिन 8,9 के बजाय जीनोम के सक्रिय रूप से स्थानांतरित क्षेत्रों से जुड़े हिस्टोन संशोधनों या प्रतिलेखन कारकों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो एफएसीएस द्वारा माउस अंग मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है ताकि लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लियस (कट एंड रन) 10,11 विश्लेषण का उपयोग करके रिलीज किया जा सके। विभिन्न चरणों में ऊतक, सेल सॉर्टिंग और नाभिक अलगाव के यांत्रिक व्यवधान शामिल हैं। एक व्यवहार्य सेल निलंबन की तैयारी के संबंध में विधि की दक्षता, सहसंयोजक हिस्टोन संशोधनों और प्रतिलेखन कारकों के लिए कट एंड रन विश्लेषण करके प्रदर्शित की गई थी। पृथक कोशिकाओं की गुणवत्ता वर्णित विधि को क्रोमैटिन तैयार करने के लिए विशेष रूप से आकर्षक बनाती है जो मूल जीनोमिक अधिभोग स्थिति को ईमानदारी से पकड़ती है, और विशिष्ट लोकी (4 सी-सेक) या जीनोम-वाइड स्तरों (एचआई-सी) पर उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ संयोजन में गुणसूत्र रचना को पकड़ने के लिए उपयुक्त होने की संभावना है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2080422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtube</td>
			<td>Star Lab</td>
			<td>S1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tubes</td>
			<td>CORNING-FALCON</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AR</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab108341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD31</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0341-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CXCR4</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DMD</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-H3K27ac</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-H3K4me2</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ITGA7</td>
			<td>MBL</td>
			<td>k0046-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PAX7</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_528428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TER119</td>
			<td>BD Pharmingen TM</td>
			<td>553673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-3</td>
			<td>BioMag&#174;Plus Concanavalin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Corning&#174;&#160;</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning&#174;&#160;</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m</td>
			<td>Corning&#174;&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 1</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>521-0011</td>
			<td>Centrifuge 5415 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 2</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5805000010</td>
			<td>Centrifuge 5804 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slide System&#160;</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>171080</td>
			<td>Syst&#232;me Nunc&#8482; Lab-Tek&#8482; Chamber Slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning agent</td>
			<td>Sigma&#160;&#160;</td>
			<td>SLBQ7780V</td>
			<td>RNaseZAPTM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, type I&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17100017</td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag&#8482;-2 Aimant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD FACSAria&#8482; Fusion Flow Cytometer</td>
			<td>23-14816-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genome browser&#160;</td>
			<td>IGV</td>
			<td></td>
			<td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning&#174;&#160;</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel hESC qualified matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>Image J&#174;</td>
			<td></td>
			<td>V 1.8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>PARAFILM&#174; M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase LT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propyl gallate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer&#160;</td>
			<td>Illumina Hiseq 4000</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath</td>
			<td>Bioblock Scientific polytest 20</td>
			<td>18724</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient protocol for cut&amp;run analysis of facs-isolated mouse satellite cells

छोटे सेल आबादी के साथ जीनोम-व्यापक विश्लेषण अध्ययन के लिए एक प्रमुख बाधा है, खासकर स्टेम सेल क्षेत्र में। यह काम अंग की मांसपेशियों से उपग्रह कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) अलगाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, संरचनात्मक प्रोटीन की उच्च सामग्री वाला ऊतक। वयस्क चूहों से विच्छेदित अंग की मांसपेशियों को यांत्रिक रूप से डिस्पैस और टाइप 1 कोलेजनेस के साथ पूरक माध्यम में घुमाकर बाधित किया गया था। पाचन पर, होमोजेनेट को सेल स्ट्रेनर्स के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था, और कोशिकाओं को एफएसीएस बफर में निलंबित कर दिया गया था। व्यवहार्यता को ठीक करने योग्य व्यवहार्यता दाग के साथ निर्धारित किया गया था, और इम्यूनोस्टेन्ड उपग्रह कोशिकाओं को एफएसीएस द्वारा अलग किया गया था। कोशिकाओं को ट्राइटन एक्स -100 के साथ जोड़ा गया था और जारी नाभिक को कोनकानावेलिन ए चुंबकीय मोतियों से बांधा गया था। न्यूक्लियस /बीड कॉम्प्लेक्स को प्रतिलेखन कारक या रुचि के हिस्टोन संशोधनों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। धोने के बाद, न्यूक्लियस / बीड कॉम्प्लेक्स को प्रोटीन ए-माइक्रोकोकल न्यूक्लियस के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और क्रोमैटिन क्लीवेज को सीएसीएल2 के साथ शुरू किया गया था। डीएनए निष्कर्षण के बाद, पुस्तकालयों को उत्पन्न और अनुक्रमित किया गया था, और जीनोम-वाइड ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बाइंडिंग और सहसंयोजक हिस्टोन संशोधनों के लिए प्रोफाइल जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण द्वारा प्राप्त किए गए थे। विभिन्न हिस्टोन चिह्नों के लिए प्राप्त चोटियों से पता चला कि बाध्यकारी घटनाएं उपग्रह कोशिकाओं के लिए विशिष्ट थीं। इसके अलावा, ज्ञात आकृति विश्लेषण ने खुलासा किया कि प्रतिलेखन कारक अपने आत्मीय प्रतिक्रिया तत्व के माध्यम से क्रोमैटिन से बंधा था। इसलिए यह प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के अंग मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं में जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित है।

Skeletal striated muscles represent on average 40% of the weight of the total human body1. Muscle fibers exhibit a remarkable capacity for regeneration upon injury, which is described by the fusion of newly formed myocytes and the generation of new myofibers that replace the damaged ones2. In 1961, Alexander Mauro reported a population of mononuclear cells that he termed as satellite cells3. These stem cells express the transcription factor paired box 7 (PAX7), and are located between the basal lamina and the sarcolemma of muscle fibers4. They were reported to express the cluster of differentiation 34 (CD34; a hematopoietic, endothelial progenitor and mesenchymal stem cell marker), integrin alpha 7 (ITGA7; a smooth, cardiac and skeletal muscle marker), as well as the C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4; a lymphocyte, hematopoietic, and satellite cell marker)5. In basal conditions, satellite cells reside in a particular microenvironment that keeps them in a quiescent state6. Upon muscle damage, they become activated, proliferate, and undergo myogenesis7. However, contributing only to a minor fraction of the total number of muscle cells, their genome-wide analyses are particularly challenging, especially under physiological settings (&#60;1% of total cells).
Various methods for chromatin isolation from satellite cells have been described, which involve chromatin immunoprecipitation followed by massive parallel sequencing (ChIP-seq) or cleavage under targets and tagmentation (CUT&#38;Tag) experiments. Nevertheless, these two techniques present some significant limitations that remain unchallenged. Indeed, ChIP-seq requires a high amount of starting material to generate enough chromatin, a large proportion of which is lost during the sonication step. CUT&#38;Tag is more appropriate for low cell number, but generates more off-target cleavage sites than ChIP-seq due to the Tn5 transposase activity. In addition, since this enzyme has a high affinity for open-chromatin regions, the CUT&#38;Tag approach might be preferentially used for analyzing histone modifications or transcription factors associated with actively transcribed regions of the genome, instead of silenced heterochromatin8,9.
Presented here is a detailed protocol that allows the isolation of mouse limb muscle satellite cells by FACS for cleavage under targets and release using nuclease (CUT&#38;RUN)10,11 analysis. The various steps involve the mechanical disruption of tissue, cell sorting, and nuclei isolation. The method&#39;s efficiency, regarding the preparation of a viable cell suspension, was demonstrated by performing CUT&#38;RUN analysis for covalent histone modifications and transcription factors. The quality of isolated cells makes the described method particularly attractive for preparing chromatin that captures the native genomic occupancy state faithfully, and is likely to be suitable for capturing the chromosome conformation in combination with high-throughput sequencing at specific loci (4C-seq) or at genome-wide levels (Hi-C).

Author Spotlight: Cistrome Analysis in Mouse Muscle Stem Cells 

FACS-पृथक माउस उपग्रह कोशिकाओं के CUT &amp;RUN विश्लेषण के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल

Since more than 20 years, our lab is interested in the pathophysiological role of nuclear receptors. To decipher their in vivo function, we engineered mouse model allowing the spatial and temporal control of their expression. In parallel, we developed cutting-edge techniques to investigate their molecular function in the mouse tissues.Our scientific interest recently led us to determine secosteroid and steroid receptor signaling in various tissues, including skeletal muscle. We have recently demonstrated that the androgen receptor in myofibers that differentiate cells of the skeletal muscle is instrumental in their contractile and metabolic functions. Our recent findings deliver a deeper understanding of skeletal muscle pathophysiological dynamics that is crucial to develop effective treatments for muscle-associated disorders.We developed this protocol to be able to perform cistrome analysis on muscle stem cells in vivo. All former protocols used in vitro modals, which completely dissociates the investigation from a whole organism context. In addition to being low-cost and time-efficient, this protocol provides an effective experimental setting to study transcription factor recruitment and chromatin landscape in skeletal muscle progenitor cells.Chromatin prepared by this protocol has provided the first genome-wide analysis of AR cistrome in satellite cells, and will facilitate future studies on gene regulation. Among many, our future aim would be to extend these investigations onto other oxosteroid receptors and explore their specific co-regulators in the various cell types involved in the regeneration process in skeletal muscle.

माउस कंकाल की मांसपेशियों से उपग्रह कोशिकाओं को गुंथर एट अल (इसके बाद प्रोटोकॉल 1)12 और लियू एट अल .23 (इसके बाद प्रोटोकॉल 2) के प्रोटोकॉल के संयोजन से अलग किया गया था। चूंकि प्रोटोकॉल 1 में प...

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यहां प्रस्तुत माउस अंग मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) अलगाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल है जो लक्ष्य के तहत दरार द्वारा मांसपेशी फाइबर में प्रतिलेखन विनियमन के अध्ययन के लिए अनुकूलित है और न्यूक्लियस (कट एंड रन) का उपयोग करके रिलीज करता है।

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

20 से अधिक वर्षों से, हमारी प्रयोगशाला परमाणु रिसेप्टर्स की पैथोफिजियोलॉजिकल भूमिका में रुचि रखती है। विवो फ़ंक्शन में उन्हें समझने के लिए, हमने माउस मॉडल को इंजीनियर किया जो उनकी अभिव्यक्ति के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण की अनुमति देता है। समानांतर में, हमने माउस ऊतकों में उनके आणविक कार्य की जांच करने के लिए अत्याधुनिक तकनीकविकसित की।हमारी वैज्ञानिक रुचि ने हाल ही में हमें कंकाल की मांसपेशियों सहित विभिन्न ऊतकों में सेकोस्टेरॉयड और स्टेरॉयड रिसेप्टर सिग्नलिंग निर्धारित करने के लिए प्रेरित किया। हमने हाल ही में प्रदर्शित किया है कि मायोफाइबर में एण्ड्रोजन रिसेप्टर जो कंकाल की मांसपेशियों की कोशिकाओं को अलग करता है, उनके संकुचन और चयापचय कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हमारे हालिया निष्कर्ष कंकाल की मांसपेशी पैथोफिजियोलॉजिकल गतिशीलता की गहरी समझ प्रदान करते हैं जो मांसपेशियों से जुड़े विकारों के लिए प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।हमने विवो में मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं पर सिस्ट्रोम विश्लेषण करने में सक्षम होने के लिए इस प्रोटोकॉल को विकसित किया है। सभी पूर्व प्रोटोकॉल इन विट्रो मोडल्स का उपयोग करते थे, जो पूरे जीव संदर्भ से जांच को पूरी तरह से अलग करता है। कम लागत और समय-कुशल होने के अलावा, यह प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशी पूर्वज कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारक भर्ती और क्रोमैटिन परिदृश्य का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी प्रयोगात्मक सेटिंग प्रदान करता है।इस प्रोटोकॉल द्वारा तैयार क्रोमैटिन ने उपग्रह कोशिकाओं में एआर सिस्ट्रोम का पहला जीनोम-व्यापी विश्लेषण प्रदान किया है, और जीन विनियमन पर भविष्य के अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगा। कई के बीच, हमारा भविष्य का उद्देश्य इन जांचों को अन्य ऑक्सोस्टेरॉइड रिसेप्टर्स पर विस्तारित करना और कंकाल की मांसपेशियों में पुनर्जनन प्रक्रिया में शामिल विभिन्न सेल प्रकारों में उनके विशिष्ट सह-नियामकों का पता लगाना होगा।