Name: Author Spotlight: Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells
Uploaded: 2023-04-07T12:20:00
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Questo lavoro è stato finanziato dall'Hubei Key Laboratories Opening Project (sovvenzione n. 2021KFY055), dalla Natural Science Foundation of Hubei Province (grant n. 2020CFB240) e dai Fundamental Research Funds for the Central Universities (grant no. 2042020kf0065).

Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente se non diversamente indicato. Tutti i topi C57BL / 6J utilizzati sono stati ottenuti dal Laboratory Animal Center dell'Università di Wuhan e tutti gli esperimenti correlati sono stati approvati dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Wuhan. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza dei topi.
1. Enucleazione e fissazione degli occhi
<ol><li>Eutanasia dei ...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma.">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li><li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy.">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).</li><li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma:+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI.">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li><li>Vidal-Sanz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+damage:+anatomical+and+functional+data+from+ocular+hypertensive+rodent+retinas.">Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).</li><li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush.">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 61 (2), 31 (2020).</li><li>Nadal-Nicol&#225;s, F. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+wide-ranging+panel+of+antigens+in+the+rat+retina+by+immunohistochemistry:+Comparison+of+Davidson's+solution+and+formalin+as+fixatives.">Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+A+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fixation+of+the+whole+bodies+of+fish+by+a+double-fixation+method+with+formalin+solution+and+Bouin's+fluid+or+Davidson's+fluid.">Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).</li><li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin:+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible.">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59 (2012).</li><li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine,+conjunctiva,+and+airway.">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li><li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method.">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization.">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li><li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining.">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li><li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma.">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li><li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush:+a+comparative+study.">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li></ol>

La fissazione è un passaggio essenziale per preservare la retina, che può influire su eventuali successive indagini RGC basate sulla morfologia. Una fissazione di successo cattura rapidamente la struttura e lo stato delle retine al momento di esporle al mezzo di fissaggio, che è fondamentale per ulteriori analisi. Sebbene la formaldeide sia stata considerata uno degli agenti fissanti più comuni per la fissazione e la conservazione di tessuti e cellule, la formaldeide da sola non sempre funziona bene come fissativo ch...

Le cellule gangliari retiniche (RGC) sono gli unici neuroni di proiezione nella retina e integrano e trasmettono informazioni visive esterne al cervello1. Molte malattie neurodegenerative come il glaucoma e la neuropatia ottica traumatica sono caratterizzate da danni irreversibili e perdita di RGC 2,3. L'analisi dei cambiamenti morfologici e quantitativi delle RGC è un passo cruciale nel determinare come le malattie neurodegenerative si sviluppano e avanzano 4,5.
Il saggio di immunofluorescenza indiretta è un metodo ampiamente accettato per monitorare la distribuzione delle proteine e il conteggio delle cellule. In laboratorio, l'immunocolorazione retinica a montaggio intero è comunemente utilizzata negli studi sperimentali sulle RGC per valutare le condizioni fisiologiche e patologiche della retina6. I marcatori più comuni utilizzati per la quantificazione RGC nell'intera retina includono Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), e così via 7,8. La caratterizzazione della quantità e della distribuzione delle RGC richiede un'immunocolorazione retinica a montaggio intero di alta qualità. Generalmente, nei protocolli di immunocolorazione, la retina viene immersa in fissativi chimici prima di essere incubata in anticorpi. I fissativi ideali non dovrebbero cambiare la forma delle cellule, l'accessibilità o l'affinità degli epitopi per gli anticorpi o le dimensioni lineari del tessuto 9,10.
A causa della complessa struttura della retina, problemi come la fragilità e il ripiegamento della retina, così come alcune difficoltà comuni tra cui il restringimento delle cellule e nuclei poco chiari, sono inclini a verificarsi quando si realizza un cerotto retinico a montaggio intero, che ha un impatto negativo sulla ricerca sperimentale. Inoltre, non tutte le retine sono immunocolorate immediatamente, specialmente quando si tratta di retine di topi transgenici con prezzi costosi che sono di origine preziosa, rendendo necessaria la conservazione dei campioni retinici extra per un ulteriore utilizzo.
La soluzione fissativa appropriata può fissare rapidamente il tessuto, evitare l'autolisi tissutale, preservare la normale morfologia e struttura delle cellule tissutali e mantenere l'antigenicità delle proteine e di altre sostanze10. Allo stato attuale, la fissazione a base di formaldeide è stata ampiamente utilizzata in vari tessuti, tra cui retine separate, conchiglie oculari emisecate e bulbi oculari interi10. Il restringimento tissutale e l'alterazione morfologica delle cellule sono le due sfide critiche incontrate dopo l'immersione in formaldeide11. Inoltre, stanno emergendo sempre più formulazioni di fissazione modificate per massimizzare la conservazione delle proprietà originali della retina e delle cellule bersaglio 9,10. Diversi trattamenti di fissazione retinica possono influenzare la struttura retinica, l'immunogenicità delle proteine, l'eccitazione della fluorescenza e il ciclo di tempra dell'attenuazione in modo diverso12,13. Le retine fissate con la soluzione di Davidson sono morfologicamente più intatte rispetto a quelle fissate con formalina, ma la soluzione di Davidson è meno compatibile con alcuni anticorpi, come la molecola 112 dell'adattatore legante il calcio ionizzato con marcatore microgliale. Considerando la natura fragile delle retine, i ricercatori si chiederanno naturalmente se l'integrità della retina, così come le proprietà e la morfologia delle cellule bersaglio, cambieranno dopo la conservazione a lungo termine. Tuttavia, i possibili effetti della soluzione di fissazione sulla morfologia delle cellule retiniche e RGC dopo la conservazione per diversi mesi sono stati raramente riportati. L'ottimizzazione della fissazione retinica è fondamentale per la valutazione e la conservazione delle RGC.
Forniamo una descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice che utilizziamo per la colorazione retinica murina a montaggio intero. Il nostro metodo enfatizza la corretta preparazione e conservazione delle retine per l'indagine RGC, tenendo conto della necessità di conservazione a lungo termine del tessuto retinico e degli aspetti specifici della formazione o della degradazione dei fluorofori.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well cell culture cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well hemagglutination plate</td>
			<td>Labedit Company</td>
			<td></td>
			<td>Incubation antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Citotest</td>
			<td></td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescent quenching mountant</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1401</td>
			<td>Slow down fluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>GC305010</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>Apply 40x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>RWD Life science Co.,LTD&#160;</td>
			<td>77001S</td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>20210624</td>
			<td>GC&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>SecheVite</td>
			<td></td>
			<td>Sealing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles&#160;</td>
			<td>Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Accelerate the fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1101</td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0002</td>
			<td>Rinse the eyeball&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>Cat. #1832-RBPMS</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>706-165-148</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells

Le cellule gangliari retiniche (RGC), che sono i neuroni di proiezione della retina, propagano le informazioni visive esterne al cervello. I cambiamenti patologici nelle RGC hanno una stretta relazione con numerose malattie degenerative della retina. L'immunocolorazione retinica a montaggio intero è frequentemente utilizzata negli studi sperimentali sulle RGC per valutare le condizioni di sviluppo e patologiche della retina. In alcune circostanze, alcuni preziosi campioni di retina, come quelli di topi transgenici, potrebbero dover essere conservati per un lungo periodo senza influenzare la morfologia o il numero di RGC. Per risultati sperimentali credibili e riproducibili, l'utilizzo di un mezzo di conservazione efficace è essenziale. Qui, descriviamo l'effetto del metanolo come mezzo fisso ausiliario per i preparati retinici a montaggio intero e la conservazione a lungo termine. In breve, durante il processo di isolamento, il metanolo freddo (-20 °C) viene pipettato sulla superficie della retina per aiutare a fissare i tessuti e facilitarne la permeabilità, quindi le retine possono essere conservate in metanolo freddo (-20 °C) prima di essere immunocolorate. Questo protocollo descrive il flusso di lavoro di isolamento della retina e il protocollo di conservazione dei campioni di tessuto, che è utile e pratico per lo studio delle RGC.

Retinal ganglion cells (RGCs) are the only projection neurons in the retina, and they integrate and transmit outside visual information to the brain1. Many neurodegenerative diseases such as glaucoma and traumatic optic neuropathy are characterized by irreversible damage and loss of RGCs2,3. Analyzing the morphological and quantitative changes of RGCs is a crucial step in determining how neurodegenerative diseases develop and advance4,5.
Indirect immunofluorescence assay is a widely accepted method to monitor the distribution of proteins and cell counting. In the laboratory, whole-mount retinal immunostaining is commonly used in experimental studies on RGCs to evaluate the physiological and pathological conditions of the retina6. The most common markers used for RGC quantification in the whole retina include Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), and so on7,8. Characterizing the amount and distribution of RGCs requires high-quality whole-mount retinal immunostaining. Generally, in immunostaining protocols, the retina is immersed in chemical fixatives before being incubated in antibodies. Ideal fixatives should not change the shape of cells, the accessibility or affinity of the epitopes for antibodies, or the linear dimensions of the tissue9,10. 
Due to the complex structure of the retina, problems such as retinal fragility and folding, as well as some common difficulties including cell shrinkage and unclear nuclei, are prone to occur when making a whole-mount retinal patch, which has a negative impact on experimental research. In addition, not all retinas are immunostained immediately, especially when it comes to the retinas of transgenic mice with expensive prices that are of precious origin, necessitating the preservation of the extra retinal samples for further use.
The appropriate fixative solution can fix the tissue quickly, avoid tissue autolysis, preserve the normal morphology and structure of the tissue cells, and keep the antigenicity of proteins and other substances10. At present, formaldehyde-based fixation has been widely used in various tissues, including separated retinas, hemisected eyecups, and whole eyeballs10. Tissue shrinkage and the morphological alteration of cells are the two critical challenges encountered following immersion in formaldehyde11. In addition, modified fixation formulations are increasingly emerging to maximize the retention of the original properties of the retina and the target cells9,10. Different retinal fixation treatments may affect the retinal structure, protein immunogenicity, fluorescence excitation , and attenuation quenching cycle differently12,13. Retinas fixed with Davidson's solution are more morphologically intact compared to those fixed with formalin, but Davidson's solution is less compatible with some antibodies, such as microglial marker-ionized calcium binding adaptor molecule 112. Considering the fragile nature of retinas, researchers would naturally wonder whether the retinal integrity, as well as the properties and morphology of the target cells, will change after long-term storage. However, the possible effects of fixation solution on retinal and RGC cell morphology after storage for several months have rarely been reported. The optimization of retinal fixation is critical for the evaluation and preservation of RGCs. 
We provide a detailed description of a reliable and technically straightforward method that we use for whole-mount murine retinal staining. Our method emphasizes the proper preparation and storage of retinas for RGC investigation, taking into account the need for the long-term storage of retinal tissue as well as specific aspects of fluorophore formation or degradation.

Author Spotlight: Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells  

Preparato a base di metanolo a montaggio intero per lo studio delle cellule gangliari retiniche

Dopo la dissezione, la retina dovrebbe apparire come un trifoglio piatto a quattro foglie. In questo studio, utilizzando il protocollo sopra descritto, la retina è diventata bianca dopo l'aggiunta di metanolo (Figura 1). Nel frattempo, la retina è cambiata da morbida a flessibile e piatta. Successivamente, gli RGC sono stati etichettati con anti-RBPMS8. Quattro campi di immagini sono stati presi nella retina a montatura intera (n = 3) utilizzando un microscopio conf...

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Il metanolo può essere utilizzato come mezzo fisso ausiliario per preparazioni retiniche a montaggio intero e conservazione a lungo termine, utile per lo studio delle cellule gangliari retiniche.

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

La ricerca mira a fornire un flusso di lavoro modificato per l'isolamento della retina e un protocollo di conservazione dei campioni di tessuto, utile e pratico per studiare gli RGC. Le retine sono fragili e pieghevoli, il che limita la ricerca sperimentale quando si realizza un cerotto retinico a montaggio intero. Inoltre, tutte le retine non richiedono immunocolorazione immediata.A volte, i campioni di retina extra devono essere conservati per un ulteriore utilizzo. Forniamo una descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice di colorazione retinica a montaggio intero che sottolinea la corretta preparazione e la necessità di conservazione a lungo termine delle retine per l'indagine RGC. Continueremo a lavorare sulla ricerca di base delle neuropatie ottiche degenerative.Inoltre, saranno esplorati il meccanismo molecolare della lesione del nervo ottico e della rigenerazione accidentale e potenziali bersagli clinici per la diagnosi e il trattamento di malattie neurodegenerative.