Name: Author Spotlight: Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells
Uploaded: 2023-04-07T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Hubei Anahtar Laboratuvarları Açılış Projesi (hibe no. 2021KFY055), Hubei Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (hibe no. 2020CFB240) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (hibe no. 2042020kf0065) tarafından finanse edilmiştir.

Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Kullanılan tüm C57BL / 6J fareleri, Wuhan Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden elde edildi ve ilgili tüm deneyler Wuhan Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etiği Komitesi tarafından onaylandı. Farelerin acısını en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.
1. Gözlerin enükleasyonu ve sabitlenmesi
<ol><li>Fareleri karbondioksit boğulması ile ötenazi yapın ve dişsiz cımbı...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma.">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li><li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy.">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).</li><li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma:+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI.">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li><li>Vidal-Sanz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+damage:+anatomical+and+functional+data+from+ocular+hypertensive+rodent+retinas.">Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).</li><li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush.">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 61 (2), 31 (2020).</li><li>Nadal-Nicol&#225;s, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells:+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas.">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li><li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+protein+with+multiple+splicing:+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells.">RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li><li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry.">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).</li><li>Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moniliform+deformation+of+retinal+ganglion+cells+by+formaldehyde-based+fixatives.">Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).</li><li>Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pfl&#252;ger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+methods+for+three-dimensional+reconstructions+from+confocal+images:+I.+Tissue+shrinking+and+axial+scaling.">Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).</li><li>Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+wide-ranging+panel+of+antigens+in+the+rat+retina+by+immunohistochemistry:+Comparison+of+Davidson's+solution+and+formalin+as+fixatives.">Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+A+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fixation+of+the+whole+bodies+of+fish+by+a+double-fixation+method+with+formalin+solution+and+Bouin's+fluid+or+Davidson's+fluid.">Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).</li><li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin:+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible.">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59 (2012).</li><li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine,+conjunctiva,+and+airway.">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li><li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method.">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization.">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li><li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining.">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li><li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma.">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li><li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush:+a+comparative+study.">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li></ol>

Fiksasyon, retinayı korumak için önemli bir adımdır ve morfolojiye dayalı sonraki RGC araştırmalarını etkileyebilir. Başarılı fiksasyon, retinaların yapısını ve durumunu, daha fazla analiz için kritik olan sabitleme ortamına maruz bıraktıkları anda hızla yakalar. Formaldehit, doku ve hücre fiksasyonu ve korunması için en yaygın sabitleme ajanlarından biri olarak kabul edilmesine rağmen, formaldehit tek başına bazı araştırmalar için en uygun kimyasal fiksatif olarak her zaman iyi çalı?...

Retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) retinadaki tek projeksiyon nöronlarıdır ve dış görsel bilgileri beyne entegre eder ve iletirler1. Glokom ve travmatik optik nöropati gibi birçok nörodejeneratif hastalık, geri dönüşümsüz hasar ve RGC 2,3 kaybı ile karakterizedir. RGC'lerin morfolojik ve kantitatif değişikliklerinin analiz edilmesi, nörodejeneratif hastalıkların nasıl geliştiğini ve ilerlediğini belirlemede çok önemli bir adımdır 4,5.
Dolaylı immünofloresan testi, proteinlerin dağılımını ve hücre sayımını izlemek için yaygın olarak kabul edilen bir yöntemdir. Laboratuvarda, retina6'nın fizyolojik ve patolojik koşullarını değerlendirmek için RGC'ler üzerinde yapılan deneysel çalışmalarda tam montajlı retinal immünoboyama yaygın olarak kullanılmaktadır. Tüm retinada RGC nicelleştirmesi için kullanılan en yaygın belirteçler arasında Brn3a, çoklu ekleme (RBPMS) ile RNA bağlayıcı protein ve benzeri 7,8 bulunur. RGC'lerin miktarını ve dağılımını karakterize etmek, yüksek kaliteli tam montajlı retinal immün boyama gerektirir. Genel olarak, immün boyama protokollerinde, retina antikorlarda inkübe edilmeden önce kimyasal fiksatiflere daldırılır. İdeal fiksatifler, hücrelerin şeklini, antikorlar için epitopların erişilebilirliğini veya afinitesini veya 9,10 dokusunun doğrusal boyutlarını değiştirmemelidir.
Retinanın karmaşık yapısı nedeniyle, retina kırılganlığı ve katlanması gibi sorunların yanı sıra hücre büzülmesi ve belirsiz çekirdekler gibi bazı yaygın zorluklar, deneysel araştırmalar üzerinde olumsuz bir etkisi olan tam montajlı retina yaması yaparken ortaya çıkmaya eğilimlidir. Ek olarak, tüm retinalar hemen immün boyanmaz, özellikle de değerli kökenli pahalı fiyatlara sahip transgenik farelerin retinaları söz konusu olduğunda, ekstra retinal örneklerin daha fazla kullanım için korunmasını gerektirir.
Uygun fiksatif çözelti dokuyu hızlı bir şekilde düzeltebilir, doku otolizini önleyebilir, doku hücrelerinin normal morfolojisini ve yapısını koruyabilir ve proteinlerin ve diğer maddelerin antijenitesini koruyabilir10. Günümüzde, formaldehit bazlı fiksasyon, ayrılmış retinalar, hemiseke edilmiş göz kapakları ve tüm göz küreleri dahil olmak üzere çeşitli dokularda yaygın olarak kullanılmaktadır10. Doku büzülmesi ve hücrelerin morfolojik değişimi, formaldehit11'e daldırıldıktan sonra karşılaşılan iki kritik zorluktur. Ek olarak, modifiye fiksasyon formülasyonları, retinanın ve hedef hücrelerin orijinal özelliklerinin korunmasını en üst düzeye çıkarmak için giderek daha fazla ortaya çıkmaktadır 9,10. Farklı retina fiksasyon tedavileri retina yapısını, protein immünojenitesini, floresan uyarımını ve zayıflama söndürme döngüsünü farklı şekilde etkileyebilir12,13. Davidson'un çözeltisi ile sabitlenmiş retinalar, formalin ile sabitlenenlere kıyasla morfolojik olarak daha sağlamdır, ancak Davidson'un çözeltisi, mikroglial marker-iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 112 gibi bazı antikorlarla daha az uyumludur. Retinaların kırılgan doğası göz önüne alındığında, araştırmacılar doğal olarak retina bütünlüğünün yanı sıra hedef hücrelerin özelliklerinin ve morfolojisinin uzun süreli depolamadan sonra değişip değişmeyeceğini merak edeceklerdir. Bununla birlikte, fiksasyon solüsyonunun birkaç ay bekletildikten sonra retina ve RGC hücre morfolojisi üzerindeki olası etkileri nadiren bildirilmiştir. Retina fiksasyonunun optimizasyonu, RGC'lerin değerlendirilmesi ve korunması için kritik öneme sahiptir.
Tüm montajlı murin retinal boyama için kullandığımız güvenilir ve teknik olarak basit bir yöntemin ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz. Yöntemimiz, retina dokusunun uzun süreli depolanması ihtiyacının yanı sıra florofor oluşumu veya bozulmasının spesifik yönlerini göz önünde bulundurarak, RGC araştırması için retinaların uygun şekilde hazırlanmasını ve depolanmasını vurgulamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well cell culture cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well hemagglutination plate</td>
			<td>Labedit Company</td>
			<td></td>
			<td>Incubation antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Citotest</td>
			<td></td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescent quenching mountant</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1401</td>
			<td>Slow down fluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>GC305010</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>Apply 40x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>RWD Life science Co.,LTD&#160;</td>
			<td>77001S</td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>20210624</td>
			<td>GC&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>SecheVite</td>
			<td></td>
			<td>Sealing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles&#160;</td>
			<td>Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Accelerate the fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1101</td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0002</td>
			<td>Rinse the eyeball&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>Cat. #1832-RBPMS</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>706-165-148</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells

Retinanın projeksiyon nöronları olan retinal ganglion hücreleri (RGC'ler), dış görsel bilgiyi beyne yayar. RGC'lerdeki patolojik değişiklikler çok sayıda retinal dejeneratif hastalık ile yakın ilişki içindedir. Tam montajlı retinal immün boyama, retinanın gelişimsel ve patolojik durumlarını değerlendirmek için RGC'ler üzerine yapılan deneysel çalışmalarda sıklıkla kullanılmaktadır. Bazı koşullar altında, transgenik farelerden alınanlar gibi bazı değerli retina örneklerinin, RGC'lerin morfolojisini veya sayısını etkilemeden uzun süre tutulması gerekebilir. Güvenilir ve tekrarlanabilir deneysel sonuçlar için, etkili bir koruma ortamı kullanmak esastır. Burada, metanolün retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak etkisini açıklıyoruz. Kısacası, izolasyon işlemi sırasında, dokuların sabitlenmesine ve geçirgenliklerinin kolaylaştırılmasına yardımcı olmak için retina yüzeyine soğuk metanol (-20 ° C) pipetlenir ve daha sonra retinalar immün boyanmadan önce soğuk metanol (-20 ° C) içinde saklanabilir. Bu protokol, RGC'lerin araştırılması için yararlı ve pratik olan retina izolasyon iş akışını ve doku örneği depolama protokolünü açıklar.

Retinal ganglion cells (RGCs) are the only projection neurons in the retina, and they integrate and transmit outside visual information to the brain1. Many neurodegenerative diseases such as glaucoma and traumatic optic neuropathy are characterized by irreversible damage and loss of RGCs2,3. Analyzing the morphological and quantitative changes of RGCs is a crucial step in determining how neurodegenerative diseases develop and advance4,5.
Indirect immunofluorescence assay is a widely accepted method to monitor the distribution of proteins and cell counting. In the laboratory, whole-mount retinal immunostaining is commonly used in experimental studies on RGCs to evaluate the physiological and pathological conditions of the retina6. The most common markers used for RGC quantification in the whole retina include Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), and so on7,8. Characterizing the amount and distribution of RGCs requires high-quality whole-mount retinal immunostaining. Generally, in immunostaining protocols, the retina is immersed in chemical fixatives before being incubated in antibodies. Ideal fixatives should not change the shape of cells, the accessibility or affinity of the epitopes for antibodies, or the linear dimensions of the tissue9,10. 
Due to the complex structure of the retina, problems such as retinal fragility and folding, as well as some common difficulties including cell shrinkage and unclear nuclei, are prone to occur when making a whole-mount retinal patch, which has a negative impact on experimental research. In addition, not all retinas are immunostained immediately, especially when it comes to the retinas of transgenic mice with expensive prices that are of precious origin, necessitating the preservation of the extra retinal samples for further use.
The appropriate fixative solution can fix the tissue quickly, avoid tissue autolysis, preserve the normal morphology and structure of the tissue cells, and keep the antigenicity of proteins and other substances10. At present, formaldehyde-based fixation has been widely used in various tissues, including separated retinas, hemisected eyecups, and whole eyeballs10. Tissue shrinkage and the morphological alteration of cells are the two critical challenges encountered following immersion in formaldehyde11. In addition, modified fixation formulations are increasingly emerging to maximize the retention of the original properties of the retina and the target cells9,10. Different retinal fixation treatments may affect the retinal structure, protein immunogenicity, fluorescence excitation , and attenuation quenching cycle differently12,13. Retinas fixed with Davidson's solution are more morphologically intact compared to those fixed with formalin, but Davidson's solution is less compatible with some antibodies, such as microglial marker-ionized calcium binding adaptor molecule 112. Considering the fragile nature of retinas, researchers would naturally wonder whether the retinal integrity, as well as the properties and morphology of the target cells, will change after long-term storage. However, the possible effects of fixation solution on retinal and RGC cell morphology after storage for several months have rarely been reported. The optimization of retinal fixation is critical for the evaluation and preservation of RGCs. 
We provide a detailed description of a reliable and technically straightforward method that we use for whole-mount murine retinal staining. Our method emphasizes the proper preparation and storage of retinas for RGC investigation, taking into account the need for the long-term storage of retinal tissue as well as specific aspects of fluorophore formation or degradation.

Author Spotlight: Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells  

Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat

Diseksiyondan sonra, retina düz dört yapraklı bir yonca gibi görünmelidir. Bu çalışmada, yukarıda özetlenen protokol kullanılarak, metanol eklendikten sonra retina beyaza dönmüştür (Şekil 1). Bu arada, retina yumuşaktan esnek ve düze değişti. Daha sonra, RGC'ler anti-RBPMS8 ile etiketlendi. Konfokal mikroskop (göz merceği: 10x; objektif: 40x) kullanılarak tüm montajlı retinada (n = 3) dört görüntü alanı alındı. Metanol işlenmeden önce...

Watch this Scientific Journal Video about Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Metanol, retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için yararlı olan retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak kullanılabilir.

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Araştırma, RGC'leri araştırmak için yararlı ve pratik olan modifiye edilmiş bir retina izolasyon iş akışı ve doku örneği depolama protokolü sağlamayı amaçlamaktadır. retinalar kırılgan ve katlanır, bu da tam montajlı retinal yama yaparken deneysel araştırmaları sınırlar. Ek olarak, tüm retinalar acil immünoboya gerektirmez.Bazen, ekstra retina örneklerinin daha fazla kullanım için korunması gerekir. RGC araştırması için retinaların uygun şekilde hazırlanmasını ve uzun süreli depolanması ihtiyacını vurgulayan güvenilir ve teknik olarak basit bir tam montajlı retina lekesi yönteminin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Dejeneratif optik nöropatilerin temel araştırmaları üzerinde çalışmaya devam edeceğiz.Ayrıca, optik sinir hasarı ve kaza rejenerasyonunun moleküler mekanizması ve nörodejeneratif hastalığın tanı ve tedavisi için potansiyel klinik hedefler araştırılacaktır.