Name: Author Spotlight: Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures
Uploaded: 2023-04-14T14:30:00
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Este trabajo es apoyado, en parte, por subvenciones de la Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), Fight for Sight (FFS) y la International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. cuenta actualmente con el apoyo de una subvención K08 del Instituto Nacional del Ojo (EY033420). No se utilizaron fondos federales para la investigación de HFT. El apoyo adicional proviene de la Iniciativa James Grosfeld para la DMAE seca y los siguientes donantes privados: Barbara Dunn y Dee & Dickson Brown.

El presente protocolo que implica la adquisición y el uso de tejido humano fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Michigan (HUM00105486).
1. Preparación de puntas y fragmentos de segmentos externos fotooxidados
NOTA: Las retinas bovinas adaptadas a la oscuridad se compraron y se enviaron en hielo (consulte la Tabla de materiales). A partir de estas retinas, la SG fue purificada siguiendo un protocolo pre...

Quantifying Retinal Pigment Epithelial Phagocytosis and Lipofuscin Accumulation

Si bien la lipofuscina RPE se ha estudiado durante décadas, su toxicidad se debate 2,9,16,42. Dada la ambigüedad sobre la toxicidad de la lipofuscina de modelos animales11, los modelos in vitro que utilizan EPR humano son valiosos. Se ha descrito una gama de modelos de acumulación de lipofuscina in vitro, pero ninguno ha utilizado tanto la alimentaci...

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) proporciona un soporte crítico para los fotorreceptores suprayacentes, incluida la absorción diaria y la degradación de las puntas o fragmentos del segmento externo de los fotorreceptores (a lo largo de este protocolo, la abreviatura OS significa puntas o fragmentos del sistema operativo en lugar de segmentos externos completos). Esta absorción diaria en el EPR postmitótico eventualmente sobrecarga la capacidad fagolisosomal y conduce a la acumulación de material intracelular autofluorescente no digerible, denominado lipofuscina. Curiosamente, varios estudios también han demostrado que la lipofuscina RPE puede acumularse sin fagocitosis OS 1,2. La lipofuscina tiene muchos componentes, incluidos los aductos reticulados derivados de los retinoides del ciclo visual, y puede ocupar casi el 20% del volumen de células del EPR para los mayores de 80años.
Si la lipofuscina es tóxica ha sido objeto de acalorados debates. La enfermedad de Stargardt es una degeneración autosómica recesiva de los fotorreceptores y el EPR en la que una mutación en ABCA4 desencadena un procesamiento inadecuado de los retinoides del ciclo visual contenidos dentro de los segmentos externos de los fotorreceptores. El procesamiento inadecuado de retinoides conduce a la reticulación aberrante y la formación de especies de bis-retinoides, incluyendo el bis-retinoide N-retinilideno-N-retiniletanolamina (A2E). Los estudios han demostrado múltiples mecanismos para la toxicidad de A2E 4,5. La lipofuscina contribuye a las señales de autofluorescencia del fondo de ojo durante la imagen clínica, y tanto los pacientes de Stargardt como los modelos animales muestran un aumento de la autofluorescencia del fondo de ojo antes de la degeneración retiniana, lo que sugiere una correlación entre los niveles de lipofuscina y la toxicidad 6,7. Sin embargo, con la edad, la lipofuscina se acumula en todos los seres humanos sin desencadenar una degeneración del EPR. Además, en la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), donde la degeneración del EPR ocurre solo en pacientes de edad avanzada, aquellos con formas tempranas e intermedias de la enfermedad tienen menos señales de autofluorescencia del fondo de ojo que los humanos no enfermos de la misma edad8. Estos hallazgos clínicos han sido verificados también a nivel histológico 9,10.
Los modelos animales de acumulación de lipofuscina RPE también han dejado cierta ambigüedad sobre la toxicidad de la lipofuscina. El ratón knockout ABCA4 no muestra degeneración retiniana sobre un fondo pigmentado, mientras que sí lo hace sobre un fondo albino o cuando se expone a la luz azul11,12. Además, la toxicidad de la lipofuscina derivada a través del knockout ABCA4 probablemente difiere de la lipofuscina de acumulación más lenta que ocurre con el envejecimiento natural, como se ve en AMD13.
Los modelos in vitro de acumulación de lipofuscina proporcionan una alternativa al estudio de los efectos de la acumulación de lipofuscina en la salud del EPR. Tales modelos permiten manipular los componentes de la lipofuscina, desde la alimentación de componentes retinoides individuales hasta la alimentación de SG, y permiten el estudio en RPE humano en lugar de animal. En las últimas dos décadas, se han desarrollado múltiples métodos para modelar la lipofuscina RPE en cultivo. Junto con otros grupos, el grupo del Dr. Boulton alimentó la SG bovina diariamente durante un máximo de tres meses al pasar de 4 a 7 células RPE primarias humanas de donantes de 4 a 85 años de edad14. Alternativamente, la inhibición de la autofagia también ha llevado a la acumulación de lipofuscina en los pasajes 3 a 7 cultivos primarios de EPR humanos15. Sin embargo, la inhibición lisosomal subletal en cultivos de EPR prenatal humano primario (eRPH) altamente diferenciados, pasaje 1, no logró inducir lipofuscina, incluso con la adición repetida de SGdiariamente 16.
Como un enfoque más reduccionista, otros han alimentado componentes individuales de lipofuscina a cultivos, especialmente el bis-retinoide A2E 4,17. Tales estudios son valiosos porque definen posibles mecanismos directos de toxicidad para componentes individuales de lipofuscina, implicando, por ejemplo, el colesterol lisosomal y la homeostasis de ceramida18. Al mismo tiempo, existe un debate sobre la toxicidad de A2E19, y alimentarlo directamente a las células elude la vía típica para la acumulación de lipofuscina, que implica la fagocitosis de la SG fotorreceptora. En un intento de administrar todos los componentes de la lipofuscina a los cultivos de EPR, Boulton y Marshall purificaron la lipofuscina de los ojos humanos y la alimentaron con el paso de 4 a 7 cultivos primarios de EPR humanos derivados de donantes humanos fetales y ancianos20. Aunque innovador, este método representa una fuente limitada de lipofuscina para experimentos repetidos.
Mientras que la alimentación repetida de SG a cultivos de EPR produce lipofuscina en muchos sistemas, no lo hace en cultivos primarios de EPR altamente diferenciados16. La SG fotooxidante induce reacciones de reticulación como la formación de bis-retinoides que ocurre naturalmente durante la formación de lipofuscina in vivo. Esto puede acelerar la formación de gránulos similares a la lipofuscina en sistemas de cultivo de EPR, incluso aquellos que son altamente diferenciados y resistentes a la acumulación de lipofuscina16. Aquí, se introduce un método para inducir la acumulación de gránulos similares a la lipofuscina en hfRPE altamente diferenciado y iPSC-RPE humano, modificado del protocolo21 publicado por Wihlmark. Este método tiene la ventaja de inducir gránulos similares a la lipofuscina empleando la misma fuente (SG fotorreceptora) y vía (captación de SG fagolisomal) que ocurre para la lipofuscinogénesis in vivo. Además, se realiza en cultivos humanos de EPR altamente diferenciados y validados en múltiples estudios para replicar el EPR humano in vivo22,23,24. Estos gránulos similares a la lipofuscina se denominan material autofluorescente no digerible (UAM), y proporcionan datos y discusión en este protocolo que compara UAM con lipofuscina in vivo. Junto con los métodos para construir y evaluar cultivos cargados de UAM en RPE humano altamente diferenciado, también se introduce un método actualizado para evaluar la fagocitosis de SG RPE. Se han introducido múltiples métodos excelentes de persecución de pulsos para cuantificar la fagocitosis de SG, incluyendo Western blotting, inmunocitoquímica y FACS25,26,27. Sin embargo, al principio de la persecución del pulso del sistema operativo, las condiciones que conducen a una absorción deficiente del sistema operativo pueden combinarse con las condiciones que promueven la rápida degradación del sistema operativo internalizado. El método presentado aquí mide la cantidad total de sistema operativo introducido que es completamente consumido / degradado por el RPE ("Capacidad consuntiva total"), ayudando a eliminar esta ambigüedad. Se anticipa que los conocimientos sobre la toxicidad de la lipofuscina utilizando estos protocolos, incluidos los efectos sobre las tasas de fagocitosis de SG utilizando el método de "Capacidad consuntiva total", se utilizarán para arrojar luz sobre la toxicidad de la lipofuscina in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#353003</td>
			<td>Others also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LC3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#4801S</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin antibody 1D4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#5417</td>
			<td>1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin antibody 4D2</td>
			<td>EnCor Biotech</td>
			<td>MCA-B630</td>
			<td>1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescence quencher</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#23007</td>
			<td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescence quencher</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td>Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodipy 493/503</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol esterase&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>From A12216 kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Stellaris SP8 with FALCON module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-adapted bovine retinas</td>
			<td>W. L. Lawson Company</td>
			<td>Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)</td>
			<td>Contact information: 
			https://wllawsoncompany.com/ 
			(402) 499-3161 
			stacy@wllawsoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Attune NxT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer analysis software&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld UV light&#160;</td>
			<td>Analytik Jena US</td>
			<td>UVGL-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MFG-E8</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>10853-H08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human purified Protein S</td>
			<td>Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>HPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J60015-AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>J2380</td>
			<td>LDH-Glo Cytotoxicity Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#72485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene-coated slides</td>
			<td>Tekdon</td>
			<td>Customized</td>
			<td>Customized specifications: PTFE mask with the following &#34;cut-outs&#34; -&#160; 3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000122 RC DC protein assay</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrode</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet crosslinker device</td>
			<td>Analytik Jena US</td>
			<td>UVP CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved lipofuscin models and quantification of outer segment phagocytosis capacity in highly polarized human retinal pigment epithelial cultures

La fagocitosis diaria de los segmentos externos de los fotorreceptores por el epitelio pigmentario de la retina (EPR) contribuye a la acumulación de un pigmento de envejecimiento intracelular denominado lipofuscina. La toxicidad de la lipofuscina está bien establecida en la enfermedad de Stargardt, la degeneración retiniana hereditaria más común, pero es más controvertida en la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la principal causa de ceguera irreversible en el mundo desarrollado. Determinar la toxicidad de la lipofuscina en humanos ha sido difícil, y los modelos animales de Stargardt tienen una toxicidad limitada. Por lo tanto, se necesitan modelos in vitro que imiten el EPR humano in vivo para comprender mejor la generación, eliminación y toxicidad de la lipofuscina. La mayoría de los modelos de lipofuscina de cultivo celular hasta la fecha han estado en líneas celulares o han implicado alimentar al EPR con un solo componente de la mezcla compleja de lipofuscina en lugar de fragmentos/puntas de todo el segmento externo de los fotorreceptores, lo que genera un modelo de lipofuscina más completo y fisiológico. Aquí se describe un método para inducir la acumulación de material similar a la lipofuscina (denominado material de autofluorescencia no digerible, o UAM) en RPE prenatal humano primario altamente diferenciado (hfRPE) y RPE derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). La UAM se acumuló en cultivos mediante la alimentación repetida de fragmentos de SG tratados con luz ultravioleta absorbidos por el EPR a través de fagocitosis. También se discuten las formas clave en que UAM se aproxima y difiere de la lipofuscina in vivo . Acompañando a este modelo de acumulación similar a la lipofuscina, se introducen métodos de imagen para distinguir el amplio espectro de autofluorescencia de los gránulos de UAM de la tinción concurrente de anticuerpos. Finalmente, para evaluar el impacto de UAM en la capacidad de fagocitosis del EPR, se ha introducido un nuevo método para cuantificar la captación y descomposición de fragmentos / puntas del segmento externo. Denominado "capacidad consuntiva total", este método supera posibles interpretaciones erróneas de la capacidad de fagocitosis del EPR inherente a los ensayos clásicos de "persecución de pulsos" del segmento externo. Los modelos y técnicas introducidos aquí se pueden utilizar para estudiar las vías de generación y eliminación de lipofuscina y la toxicidad putativa.

The retinal pigment epithelium (RPE) provides critical support for overlying photoreceptors, including the daily uptake and degradation of photoreceptor outer segment tips or fragments (throughout this protocol, the abbreviation OS stands for OS tips or fragments rather than whole outer segments). This daily uptake in the post-mitotic RPE eventually overloads phagolysosomal capacity and leads to the buildup of undigestible, autofluorescent intracellular material, termed lipofuscin. Interestingly, several studies have also demonstrated that RPE lipofuscin can accumulate without OS phagocytosis1,2. Lipofuscin has many components, including cross-linked adducts derived from visual cycle retinoids, and can occupy nearly 20% of RPE cell volume for those over the age of 803.
Whether lipofuscin is toxic has been hotly debated. Stargardt&#39;s disease is an autosomal recessive degeneration of the photoreceptors and RPE in which a mutation in ABCA4 triggers improper processing of visual cycle retinoids contained within photoreceptor outer segments. Improper retinoid processing leads to aberrant cross-linking and formation of bis-retinoid species, including the bis-retinoid N-retinylidene-N-retinylethanolamine (A2E). Studies have demonstrated multiple mechanisms for A2E toxicity4,5. Lipofuscin contributes to fundus autofluorescence signals during clinical imaging, and both Stargardt&#39;s patients and animal models display increased fundus autofluorescence prior to retinal degeneration, suggesting a correlation between lipofuscin levels and toxicity6,7. However, with age, lipofuscin accumulates in all humans without triggering an RPE degeneration. Further, in age-related macular degeneration (AMD), where RPE degeneration occurs only in elderly patients, those with early and intermediate forms of the disease have less fundus autofluorescence signals than age-matched non-diseased humans8. These clinical findings have been verified at the histologic level as well9,10.
Animal models of RPE lipofuscin accumulation have also left some ambiguity about lipofuscin toxicity. The ABCA4 knockout mouse does not display retinal degeneration on a pigmented background, whereas it does on an albino background or when exposed to blue light11,12. Further, the toxicity of lipofuscin derived via ABCA4 knockout likely differs from the more slowly accumulating lipofuscin that occurs with natural aging, as seen in AMD13.
In vitro models of lipofuscin accumulation provide an alternative to studying the effects of lipofuscin accumulation on RPE health. Such models allow for manipulating lipofuscin components, from feeding single retinoid components to feeding OS, and allow study in human rather than animal RPE. In the last couple of decades, multiple methods have been developed to model RPE lipofuscin in culture. Along with other groups, Dr. Boulton&#39;s group fed bovine OS daily for up to three months on passage 4 to 7 human primary RPE cells from donors aged 4 to 85 years old14. Alternatively, inhibition of autophagy has also led to lipofuscin accumulation in passages 3 to 7 primary human RPE cultures15. However, sub-lethal lysosomal inhibition in highly differentiated, passage 1, primary human pre-natal RPE (hfRPE) cultures failed to induce lipofuscin, even with the repeated addition of OS on a daily basis16.
As a more reductionist approach, others have fed single lipofuscin components to cultures, especially the bis-retinoid A2E4,17. Such studies are valuable in that they define potential direct mechanisms of toxicity for individual lipofuscin components, implicating, for example, lysosomal cholesterol and ceramide homeostasis18. At the same time, there is debate about the toxicity of A2E19, and feeding it directly to cells circumvents the typical pathway for lipofuscin accumulation, which involves phagocytosis of photoreceptor OS. In an attempt to deliver all components of lipofuscin to RPE cultures, Boulton and Marshall purified lipofuscin from human eyes and fed this to passage 4 to 7 human primary RPE cultures derived from both fetal and elderly human donors20. While innovative, this method represents a limited lipofuscin source for repeated experiments.
While repeated feedings of OS to RPE cultures produce lipofuscin in many systems, it fails to do so in highly differentiated primary RPE cultures16. Photo-oxidizing OS induces cross-linking reactions like bis-retinoid formation that naturally occurs during lipofuscin formation in vivo. This can accelerate lipofuscin-like granule formation in RPE culture systems, even those that are highly differentiated and resistant to lipofuscin accumulation16. Here, a method to induce lipofuscin-like granule accumulation in highly differentiated hfRPE and human iPSC-RPE is introduced, modified from Wihlmark&#39;s published protocol21. This method has the advantage of inducing lipofuscin-like granules employing the same source (photoreceptor OS) and pathway (phagolysosomal OS uptake) as occurs for lipofuscinogenesis in vivo. Further, it is done on human RPE cultures that are highly differentiated and validated in multiple studies to replicate human RPE in vivo22,23,24. These lipofuscin-like granules are termed undigestible autofluorescent material (UAM), and provide data and discussion in this protocol comparing UAM to in vivo lipofuscin. Along with methods for building and evaluating UAM-laden cultures in highly differentiated human RPE, an updated method to assess RPE OS phagocytosis is also introduced. Multiple excellent pulse-chase methods for quantifying OS phagocytosis have been introduced, including Western blotting, immunocytochemistry, and FACS25,26,27. However, early in the OS pulse-chase, conditions that lead to poor OS uptake can be conflated with conditions that promote rapid degradation of internalized OS. The method presented here measures the total amount of introduced OS that is fully consumed/degraded by the RPE (&#34;Total Consumptive Capacity&#34;), helping eliminate this ambiguity. It is anticipated that insights about lipofuscin toxicity utilizing these protocols, including effects on OS phagocytosis rates utilizing the &#34;Total Consumptive Capacity&#34; method, will be used to shed light on the toxicity of lipofuscin in vivo.

Author Spotlight: Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures  

Modelos mejorados de lipofuscina y cuantificación de la capacidad de fagocitosis del segmento externo en cultivos epiteliales de pigmento retiniano humano altamente polarizados

La configuración para la fotooxidación de la SG se demuestra en la Figura 1Ai. Los portaobjetos recubiertos de politetrafluoroetileno permiten cargar un gran volumen de OS en solución por rectángulo abierto sin extenderse por el resto del portaobjetos. El portaobjetos con OS está contenido dentro de una placa de Petri estéril con la tapa apagada, y se coloca una lámpara UV sobre el portaobjetos como se muestra en la Figura 1Aii. Alternativamente, la diapo...

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Este protocolo describe un modelo de acumulación de lipofuscina en cultivos epiteliales pigmentarios (EPR) humanos altamente diferenciados y polarizados y un ensayo de fagocitosis de segmento externo (SG) mejorado para detectar la capacidad total de consumo/degradación de SG del EPR. Estos métodos superan las limitaciones de los modelos anteriores de lipofuscina y los ensayos clásicos de fagocitosis del segmento externo de persecución de pulsos.

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...

Si bien la lipofuscina se acumula universalmente en el EPR con el envejecimiento, discernir su toxicidad ha sido difícil. Aquí, desarrollamos protocolos que nos permiten desarrollar una acumulación similar a la lipofuscina en cultivos de EPR altamente polarizados y maduros para ayudar a discernir los efectos de la lipofuscina en la fisiología del EPR. El estudio de la toxicidad de la lipofuscina en humanos se confunde por el hecho de que la lipofuscina disminuye a medida que muere el EPR.Los modelos animales de toxicidad por lipofuscina han tenido resultados muy dispares. Hemos creado cuidadosamente modelos in vitro de acumulación de material similar a la lipofuscina para facilitar el estudio de la toxicidad de la lipofuscina. La clave del éxito de nuestros modelos es mantener cultivos altamente diferenciados mientras se induce la génesis de lipofuscina a través del mismo proceso que desencadena la lipofuscina in vivo, es decir, la fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores.Nuestro protocolo in vitro es único en el sentido de que el material similar a la lipofuscina se acumula en cultivos de EPR que están altamente diferenciados para imitar fielmente el EPR in vivo. En estas circunstancias, encontramos que el cultivo de EPR es altamente resistente a la acumulación de lipofuscina y al efecto tóxico de la lipofuscina. Además, en el proceso de ensayo de fenotipos inducidos por la acumulación similar a la lipofuscina en nuestros cultivos de EPR, creamos un nuevo tipo de ensayo de fagocitosis llamado capacidad consuntiva total.Este ensayo nos permite determinar toda la capacidad del EPR para fagocitar segmentos externos al tiempo que evitamos algunas de las interpretaciones confusas que vienen con los ensayos clásicos de fagocitosis de persecución de pulso. Estamos entusiasmados de utilizar este modelo de acumulación de material similar a la lipofuscina para comprender mejor qué factores estresantes del EPR pueden llevar a la lipofuscina normalmente inerte a un papel más patológico en las muertes celulares del EPR.