Name: Author Spotlight: Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures
Uploaded: 2023-04-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures at JoVE.com

Bu çalışma, kısmen, Vitreo-Retinal Cerrahi Vakfı (VRSF), Görme için Mücadele (FFS) ve Uluslararası Retina Araştırma Vakfı (IRRF) tarafından verilen hibelerle desteklenmektedir. J.M.L.M. şu anda Ulusal Göz Enstitüsü'nden (EY033420) bir K08 hibesi ile desteklenmektedir. HFT araştırması için hiçbir federal fon kullanılmadı. Daha fazla destek James Grosfeld Initiative for Dry AMD ve aşağıdaki özel bağışçılardan geliyor: Barbara Dunn ve Dee &; Dickson Brown.

İnsan dokusunun edinimi ve kullanımını içeren mevcut protokol, Michigan Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (HUM00105486) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Foto-oksitlenmiş dış segment uçlarının ve parçalarının hazırlanması
NOT: Koyulaştırılmış sığır retinaları satın alınmış ve buz üzerinde sevk edilmiştir (bkz. Bu retinalardan, işletim sistemi daha önce yayınlanmış bir protokol<sup class=...

Quantifying Retinal Pigment Epithelial Phagocytosis and Lipofuscin Accumulation

RPE lipofuscin on yıllardır çalışılırken, toksisitesi 2,9,16,42 tartışılmaktadır. Hayvan modellerinden lipofuscin'in toksisitesi hakkında belirsizlik göz önüne alındığında11, insan RPE'sini kullanan in vitro modeller değerlidir. Bir dizi in vitro lipofussin birikim modeli tanımlanmıştır, ancak hiçbiri hem OS beslenmesini hem de ...

Retinal pigment epiteli (RPE), fotoreseptör dış segment uçlarının veya fragmanlarının günlük alımı ve bozulması da dahil olmak üzere üstteki fotoreseptörler için kritik destek sağlar (bu protokol boyunca, OS kısaltması, tüm dış segmentlerden ziyade OS uçları veya fragmanları anlamına gelir). Post-mitotik RPE'deki bu günlük alım sonunda fagolizozomal kapasiteyi aşırı yükler ve lipofussin adı verilen sindirilemeyen, otofloresan hücre içi materyalin birikmesine yol açar. İlginç bir şekilde, birkaç çalışma RPE lipofuscin'in OS fagositoz 1,2 olmadan birikebileceğini de göstermiştir. Lipofuscin, görsel siklus retinoidlerinden türetilen çapraz bağlı adduktlar da dahil olmak üzere birçok bileşene sahiptir ve 80 yaşın üzerindekiler için RPE hücre hacminin yaklaşık% 20'sini işgal edebilir3.
Lipofuscin'in toksik olup olmadığı sıcak bir şekilde tartışılmıştır. Stargardt hastalığı, fotoreseptörlerin ve RPE'nin otozomal resesif dejenerasyonudur ve ABCA4'teki bir mutasyon, fotoreseptör dış segmentlerinde bulunan görme döngüsü retinoidlerinin yanlış işlenmesini tetikler. Yanlış retinoid işleme, bis-retinoid N-retinylidene-N-retinilethanolamine (A2E) dahil olmak üzere bis-retinoid türlerinin anormal çapraz bağlanmasına ve oluşumuna yol açar. Çalışmalar A2E toksisitesi için çoklu mekanizmalar göstermiştir 4,5. Lipofuscin, klinik görüntüleme sırasında fundus otofloresan sinyallerine katkıda bulunur ve hem Stargardt'ın hastaları hem de hayvan modelleri, retinal dejenerasyondan önce fundus otofloresansının arttığını gösterir, bu da lipofussin seviyeleri ile toksisite arasında bir korelasyon olduğunudüşündürmektedir 6,7. Bununla birlikte, yaşla birlikte, lipofuscin tüm insanlarda RPE dejenerasyonunu tetiklemeden birikir. Ayrıca, RPE dejenerasyonunun sadece yaşlı hastalarda meydana geldiği yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD), hastalığın erken ve orta formlarına sahip olanlar, yaşa uygun hastalıksız insanlardan daha az fundus otofloresan sinyaline sahiptir8. Bu klinik bulgular histolojik düzeyde de doğrulanmıştır 9,10.
RPE lipofussin birikiminin hayvan modelleri de lipofussin toksisitesi hakkında bazı belirsizlikler bırakmıştır. ABCA4 nakavt faresi, pigmentli bir arka plan üzerinde retinal dejenerasyon göstermezken, albino bir arka planda veya mavi ışığa maruz kaldığında11,12 gösterir. Ayrıca, ABCA4 nakavtı yoluyla elde edilen lipofuscinin toksisitesi, AMD13'te görüldüğü gibi, doğal yaşlanma ile ortaya çıkan daha yavaş biriken lipofusinden farklıdır.
Lipofussin birikiminin in vitro modelleri, lipofussin birikiminin RPE sağlığı üzerindeki etkilerini incelemek için bir alternatif sunmaktadır. Bu tür modeller, tek retinoid bileşenlerin beslenmesinden işletim sisteminin beslenmesine kadar lipofuscin bileşenlerinin manipüle edilmesine izin verir ve hayvan RPE'sinden ziyade insanda çalışmaya izin verir. Son birkaç on yılda, RPE lipofuscin'i kültürde modellemek için birçok yöntem geliştirilmiştir. Diğer gruplarla birlikte, Dr. Boulton'un grubu, 4 ila 85yaşları arasındaki donörlerden 4 ila 7 insan birincil RPE hücresinin geçişinde üç aya kadar günlük olarak sığır OS'yi besledi. Alternatif olarak, otofajinin inhibisyonu da pasajlarda lipofussin birikimine yol açmıştır 3 ila 7 birincil insan RPE kültürleri15. Bununla birlikte, oldukça farklılaşmış, pasaj 1, primer insan prenatal RPE (hfRPE) kültürlerinde sub-ölümcül lizozomal inhibisyon, günlük olarak tekrarlanan OS ilavesiyle bile lipofuscin'i indükleyememiştir16.
Daha indirgemeci bir yaklaşım olarak, diğerleri kültürlere, özellikle bis-retinoid A2E 4,17'ye tek lipofuscin bileşenlerini beslemişlerdir. Bu tür çalışmalar, bireysel lipofussin bileşenleri için potansiyel doğrudan toksisite mekanizmalarını tanımladıkları için değerlidir, örneğin lizozomal kolesterol ve seramid homeostazı18'i içerir. Aynı zamanda, A2E19'un toksisitesi hakkında tartışmalar vardır ve doğrudan hücrelere beslenmesi, fotoreseptör OS'nin fagositozunu içeren lipofussin birikimi için tipik yolu atlatır. Boulton ve Marshall, lipofuscin'in tüm bileşenlerini RPE kültürlerine ulaştırma girişiminde, lipofuscin'i insan gözlerinden saflaştırdı ve bunu hem fetal hem de yaşlı insan donörlerinden türetilen 4 ila 7 insan birincil RPE kültürüne besledi20. Yenilikçi olsa da, bu yöntem tekrarlanan deneyler için sınırlı bir lipofuscin kaynağını temsil eder.
OS'nin RPE kültürlerine tekrar tekrar beslenmesi birçok sistemde lipofussin üretirken, oldukça farklılaşmış birincil RPE kültürlerinde bunu başaramaz16. Foto-oksitleyici OS, in vivo lipofussin oluşumu sırasında doğal olarak ortaya çıkan bis-retinoid oluşumu gibi çapraz bağlanma reaksiyonlarını indükler. Bu, RPE kültür sistemlerinde lipofussin benzeri granül oluşumunu hızlandırabilir, hatta lipofussin birikimine karşı oldukça farklılaşmış ve dirençli olanlarbile16. Burada, Wihlmark'ın yayınlanmış protokol21'inden modifiye edilmiş, oldukça farklılaşmış hfRPE ve insan iPSC-RPE'sinde lipofussin benzeri granül birikimini indükleyen bir yöntem tanıtılmıştır. Bu yöntem, in vivo lipofuscinogenez için olduğu gibi aynı kaynağı (fotoreseptör OS) ve yolu (fagolizozomal OS alımı) kullanan lipofussin benzeri granülleri indükleme avantajına sahiptir. Ayrıca, insan RPE'sini in vivo22,23,24 çoğaltmak için yapılan birçok çalışmada oldukça farklılaşmış ve doğrulanmış insan RPE kültürleri üzerinde yapılır. Bu lipofussin benzeri granüller sindirilemeyen otofloresan materyal (UAM) olarak adlandırılır ve bu protokolde UAM'yi in vivo lipofuscin ile karşılaştıran veri ve tartışma sağlar. Yüksek oranda farklılaşmış insan RPE'sinde UAM yüklü kültürleri oluşturma ve değerlendirme yöntemlerinin yanı sıra, RPE OS fagositozunu değerlendirmek için güncellenmiş bir yöntem de tanıtılmıştır. OS fagositozunu ölçmek için Western blotting, immünositokimya ve FACS25,26,27 dahil olmak üzere birçok mükemmel nabız kovalama yöntemi tanıtılmıştır. Bununla birlikte, işletim sistemi nabız kovalamacasının başlarında, zayıf işletim sistemi alımına yol açan koşullar, içselleştirilmiş işletim sisteminin hızlı bir şekilde bozulmasını teşvik eden koşullarla birleştirilebilir. Burada sunulan yöntem, RPE ("Toplam Tüketim Kapasitesi") tarafından tamamen tüketilen/bozulan tanıtılan işletim sisteminin toplam miktarını ölçer ve bu belirsizliğin ortadan kaldırılmasına yardımcı olur. "Toplam Tüketim Kapasitesi" yöntemi kullanılarak OS fagositoz oranları üzerindeki etkiler de dahil olmak üzere, bu protokolleri kullanan lipofussin toksisitesi hakkındaki bilgilerin, lipofuscin'in in vivo toksisitesine ışık tutmak için kullanılması beklenmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#353003</td>
			<td>Others also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LC3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#4801S</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin antibody 1D4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#5417</td>
			<td>1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin antibody 4D2</td>
			<td>EnCor Biotech</td>
			<td>MCA-B630</td>
			<td>1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescence quencher</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#23007</td>
			<td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescence quencher</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td>Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodipy 493/503</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol esterase&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>From A12216 kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Stellaris SP8 with FALCON module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-adapted bovine retinas</td>
			<td>W. L. Lawson Company</td>
			<td>Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)</td>
			<td>Contact information: 
			https://wllawsoncompany.com/ 
			(402) 499-3161 
			stacy@wllawsoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Attune NxT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer analysis software&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld UV light&#160;</td>
			<td>Analytik Jena US</td>
			<td>UVGL-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MFG-E8</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>10853-H08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human purified Protein S</td>
			<td>Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>HPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J60015-AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>J2380</td>
			<td>LDH-Glo Cytotoxicity Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#72485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene-coated slides</td>
			<td>Tekdon</td>
			<td>Customized</td>
			<td>Customized specifications: PTFE mask with the following &#34;cut-outs&#34; -&#160; 3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000122 RC DC protein assay</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrode</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet crosslinker device</td>
			<td>Analytik Jena US</td>
			<td>UVP CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved lipofuscin models and quantification of outer segment phagocytosis capacity in highly polarized human retinal pigment epithelial cultures

Retinal pigment epiteli (RPE) tarafından fotoreseptör dış segmentlerin günlük fagositozu, lipofussin adı verilen hücre içi yaşlanma pigmentinin birikmesine katkıda bulunur. Lipofusin toksisitesi, en yaygın kalıtsal retinal dejenerasyon olan Stargardt hastalığında iyi bilinmektedir, ancak gelişmiş dünyada geri dönüşümsüz körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD) daha tartışmalıdır. İnsanlarda lipofussin toksisitesini belirlemek zor olmuştur ve Stargardt'ın hayvan modelleri sınırlı toksisiteye sahiptir. Bu nedenle, lipofussin üretimini, klirensini ve toksisitesini daha iyi anlamak için insan RPE'sini in vivo olarak taklit eden in vitro modellere ihtiyaç vardır. Bugüne kadar hücre kültürü lipofussin modellerinin çoğunluğu hücre hatlarındaydı veya RPE'yi tüm fotoreseptör dış segmentinin parçaları / uçları yerine karmaşık lipofuscin karışımının tek bir bileşeni ile beslemeyi içeriyordu, bu da daha eksiksiz ve fizyolojik bir lipofuscin modeli oluşturuyordu. Burada tarif edilen, lipofussin benzeri materyalin (sindirilemeyen otofloresan materyal veya UAM olarak adlandırılır) yüksek oranda farklılaşmış primer insan doğum öncesi RPE'sinde (hfRPE) ve indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı RPE'de birikmesini indükleyen bir yöntemdir. UAM, RPE tarafından fagositoz yoluyla alınan ultraviyole ışıkla işlenmiş OS parçalarının tekrar tekrar beslenmesiyle kültürlerde birikmiştir. UAM'nin lipofuscin in vivo olarak yaklaştığı ve ondan farklı olduğu anahtar yollar da tartışılmaktadır. Bu lipofussin benzeri birikim modeline eşlik ederek, UAM granüllerinin geniş otofloresan spektrumunu eşzamanlı antikor boyamasından ayırt etmek için görüntüleme yöntemleri tanıtılmıştır. Son olarak, UAM'nin RPE fagositoz kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, dış segment fragmanı / uçlarının alımını ve parçalanmasını ölçmek için yeni bir yöntem tanıtılmıştır. "Toplam Tüketim Kapasitesi" olarak adlandırılan bu yöntem, klasik dış segment "nabız kovalamaca" testlerinde bulunan RPE fagositoz kapasitesinin potansiyel yanlış yorumlarının üstesinden gelir. Burada tanıtılan modeller ve teknikler, lipofussin üretimi ve klirens yollarını ve varsayılan toksisiteyi incelemek için kullanılabilir.

The retinal pigment epithelium (RPE) provides critical support for overlying photoreceptors, including the daily uptake and degradation of photoreceptor outer segment tips or fragments (throughout this protocol, the abbreviation OS stands for OS tips or fragments rather than whole outer segments). This daily uptake in the post-mitotic RPE eventually overloads phagolysosomal capacity and leads to the buildup of undigestible, autofluorescent intracellular material, termed lipofuscin. Interestingly, several studies have also demonstrated that RPE lipofuscin can accumulate without OS phagocytosis1,2. Lipofuscin has many components, including cross-linked adducts derived from visual cycle retinoids, and can occupy nearly 20% of RPE cell volume for those over the age of 803.
Whether lipofuscin is toxic has been hotly debated. Stargardt&#39;s disease is an autosomal recessive degeneration of the photoreceptors and RPE in which a mutation in ABCA4 triggers improper processing of visual cycle retinoids contained within photoreceptor outer segments. Improper retinoid processing leads to aberrant cross-linking and formation of bis-retinoid species, including the bis-retinoid N-retinylidene-N-retinylethanolamine (A2E). Studies have demonstrated multiple mechanisms for A2E toxicity4,5. Lipofuscin contributes to fundus autofluorescence signals during clinical imaging, and both Stargardt&#39;s patients and animal models display increased fundus autofluorescence prior to retinal degeneration, suggesting a correlation between lipofuscin levels and toxicity6,7. However, with age, lipofuscin accumulates in all humans without triggering an RPE degeneration. Further, in age-related macular degeneration (AMD), where RPE degeneration occurs only in elderly patients, those with early and intermediate forms of the disease have less fundus autofluorescence signals than age-matched non-diseased humans8. These clinical findings have been verified at the histologic level as well9,10.
Animal models of RPE lipofuscin accumulation have also left some ambiguity about lipofuscin toxicity. The ABCA4 knockout mouse does not display retinal degeneration on a pigmented background, whereas it does on an albino background or when exposed to blue light11,12. Further, the toxicity of lipofuscin derived via ABCA4 knockout likely differs from the more slowly accumulating lipofuscin that occurs with natural aging, as seen in AMD13.
In vitro models of lipofuscin accumulation provide an alternative to studying the effects of lipofuscin accumulation on RPE health. Such models allow for manipulating lipofuscin components, from feeding single retinoid components to feeding OS, and allow study in human rather than animal RPE. In the last couple of decades, multiple methods have been developed to model RPE lipofuscin in culture. Along with other groups, Dr. Boulton&#39;s group fed bovine OS daily for up to three months on passage 4 to 7 human primary RPE cells from donors aged 4 to 85 years old14. Alternatively, inhibition of autophagy has also led to lipofuscin accumulation in passages 3 to 7 primary human RPE cultures15. However, sub-lethal lysosomal inhibition in highly differentiated, passage 1, primary human pre-natal RPE (hfRPE) cultures failed to induce lipofuscin, even with the repeated addition of OS on a daily basis16.
As a more reductionist approach, others have fed single lipofuscin components to cultures, especially the bis-retinoid A2E4,17. Such studies are valuable in that they define potential direct mechanisms of toxicity for individual lipofuscin components, implicating, for example, lysosomal cholesterol and ceramide homeostasis18. At the same time, there is debate about the toxicity of A2E19, and feeding it directly to cells circumvents the typical pathway for lipofuscin accumulation, which involves phagocytosis of photoreceptor OS. In an attempt to deliver all components of lipofuscin to RPE cultures, Boulton and Marshall purified lipofuscin from human eyes and fed this to passage 4 to 7 human primary RPE cultures derived from both fetal and elderly human donors20. While innovative, this method represents a limited lipofuscin source for repeated experiments.
While repeated feedings of OS to RPE cultures produce lipofuscin in many systems, it fails to do so in highly differentiated primary RPE cultures16. Photo-oxidizing OS induces cross-linking reactions like bis-retinoid formation that naturally occurs during lipofuscin formation in vivo. This can accelerate lipofuscin-like granule formation in RPE culture systems, even those that are highly differentiated and resistant to lipofuscin accumulation16. Here, a method to induce lipofuscin-like granule accumulation in highly differentiated hfRPE and human iPSC-RPE is introduced, modified from Wihlmark&#39;s published protocol21. This method has the advantage of inducing lipofuscin-like granules employing the same source (photoreceptor OS) and pathway (phagolysosomal OS uptake) as occurs for lipofuscinogenesis in vivo. Further, it is done on human RPE cultures that are highly differentiated and validated in multiple studies to replicate human RPE in vivo22,23,24. These lipofuscin-like granules are termed undigestible autofluorescent material (UAM), and provide data and discussion in this protocol comparing UAM to in vivo lipofuscin. Along with methods for building and evaluating UAM-laden cultures in highly differentiated human RPE, an updated method to assess RPE OS phagocytosis is also introduced. Multiple excellent pulse-chase methods for quantifying OS phagocytosis have been introduced, including Western blotting, immunocytochemistry, and FACS25,26,27. However, early in the OS pulse-chase, conditions that lead to poor OS uptake can be conflated with conditions that promote rapid degradation of internalized OS. The method presented here measures the total amount of introduced OS that is fully consumed/degraded by the RPE (&#34;Total Consumptive Capacity&#34;), helping eliminate this ambiguity. It is anticipated that insights about lipofuscin toxicity utilizing these protocols, including effects on OS phagocytosis rates utilizing the &#34;Total Consumptive Capacity&#34; method, will be used to shed light on the toxicity of lipofuscin in vivo.

Author Spotlight: Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures  

Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi

İşletim sisteminin foto-oksidasyonu için kurulum Şekil 1Ai'de gösterilmiştir. Politetrafloroetilen kaplı kızaklar, slaydın geri kalanına yayılmadan açık dikdörtgen başına büyük miktarda çözelti içinde işletim sistemi yüklenmesini sağlar. İşletim sistemli slayt, kapağı kapalı steril bir Petri kabı içinde bulunur ve Şekil 1Aii'de gösterildiği gibi slaytın üzerine bir UV lambası yerleştirilir. Alternatif olarak, slayt <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures at JoVE.com

Bu protokol, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize olmuş insan retinal pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde bir lipofussin birikim modelini ve RPE'nin toplam OS tüketimini/bozulma kapasitesini saptamak için geliştirilmiş bir dış segment (OS) fagositoz testini tanımlamaktadır. Bu yöntemler, önceki lipofussin modellerinin ve klasik nabız kovalama dış segment fagositoz testlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmektedir.

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...

Lipofussin yaşlanma ile birlikte RPE'de evrensel olarak birikirken, toksisitesini ayırt etmek zor olmuştur. Burada, lipofuscin'in RPE fizyolojisi üzerindeki etkilerini ayırt etmeye yardımcı olmak için yüksek polarize ve olgun RPE kültürlerinde lipofussin benzeri birikim geliştirmemize izin veren protokoller geliştiriyoruz. İnsanlarda lipofussin toksisitesinin incelenmesi, RPE öldükçe lipofuscinin azalması gerçeğiyle karıştırılmaktadır.Lipofussin toksisitesinin hayvan modelleri çok farklı sonuçlara sahiptir. Lipofussin toksisitesinin incelenmesini kolaylaştırmak için lipofussin benzeri materyal birikiminin in vitro modellerini dikkatlice oluşturduk. Modellerimizin başarısının anahtarı, lipofuscin in vivo'yu tetikleyen aynı işlemle, yani fotoreseptör dış segmentlerinin fagositozuyla lipofussin genezini indüklerken, oldukça farklılaşmış kültürleri korumaktır.İn vitro protokolümüz, lipofussin benzeri materyalin, RPE'yi in vivo olarak sadık bir şekilde taklit etmek için oldukça farklılaşmış RPE kültürlerinde birikmesi bakımından benzersizdir. Bu koşullarda, RPE kültürünün lipofusin birikimine ve lipofuscinin toksik etkisine karşı oldukça dirençli olduğunu bulduk. Ek olarak, RPE kültürlerimizde lipofussin benzeri birikimin neden olduğu fenotipler için tahlil sürecinde, toplam tüketim kapasitesi adı verilen yeni bir fagositoz testi türü oluşturduk.Bu tahlil, RPE'nin dış segmentleri fagositoz haline getirme kapasitesinin tamamını belirlememize izin verirken, klasik nabız kovalama fagositoz tahlilleriyle birlikte gelen bazı kafa karıştırıcı yorumlardan kaçınmamızı sağlar. RPE stresörlerinin normalde inert lipofuscin'i RPE hücre ölümlerinde daha patolojik bir role sokabileceğini daha iyi anlamak için bu lipofussin benzeri materyal birikimi modelini kullanmaktan heyecan duyuyoruz.