Name: Author Spotlight: Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure
Uploaded: 2023-04-28T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure at JoVE.com

Описанный здесь протокол был взят из статьи, опубликованной Jiang et al. (2020). Эта работа была поддержана грантами MOST (973 программы No 2011CB812502 и 2014CB849902) и финансовой поддержкой муниципального правительства Пекина.

Все расходные материалы, использованные в этом эксперименте, перечислены в таблице материалов. Пошаговый рабочий процесс текущего протокола показан на рисунке 1.
1. Культура клеток на сапфировых дисках
<ol><li>Перенесите сапфировые диски ...

Direct Synthesis of Gold Nanoparticles for Protein Localization Analysis

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Masters, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+the+electron+microscope+in+cell+biology.">History of the electron microscope in cell biology.</a> Encylopedia of Life Sciences. , (2009).</li><li>Griffiths, G., Hoppeler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+immunocytochemistry:+Correlation+of+immunogold+labeling+to+absolute+number+of+membrane+antigens.">Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+ultracryotomy+of+cell+suspensions+and+tissues.">A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues.</a> Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).</li><li>Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+into+and+out+of+the+Golgi+complex+studied+by+transfecting+cells+with+cDNAs+encoding+horseradish+peroxidase.">Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase.</a> Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).</li><li>Grabenbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+and+electron+tomography+of+GFP+through+photooxidation.">Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation.</a> Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).</li><li>Gaietta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296 (5567), 503-507 (2002).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).</li><li>Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+ascorbate+peroxidase+as+a+genetically+encoded+reporter+for+electron+microscopy.">Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Mavlyutov, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APEX2-enhanced+electron+microscopy+distinguishes+sigma-1+receptor+localization+in+the+nucleoplasmic+reticulum.">APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum.</a> Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).</li><li>Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ferritin-based+label+for+cellular+electron+cryotomography.">A ferritin-based label for cellular electron cryotomography.</a> Structure. 19 (2), 147-154 (2011).</li><li>Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streptavidin-metallothionein+chimera+that+allows+specific+labeling+of+biological+materials+with+many+different+heavy+metal+ions.">A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).</li><li>Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanocluster+formation+using+metallothionein:+Mass+spectrometry+and+electron+microscopy.">Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy.</a> Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).</li><li>Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concatenated+metallothionein+as+a+clonable+gold+label+for+electron+microscopy.">Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).</li><li>Morphew, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+as+a+clonable+tag+for+protein+localization+by+electron+microscopy+of+cells.">Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells.</a> Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).</li><li>Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+metallothionein+tag+enabling+efficient+protein+detection+by+electron+microscopy.">A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).</li><li>Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+as+a+clonable+high-density+marker+for+cryo-electron+microscopy.">Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).</li><li>Fukunaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+analysis+of+a+fusion+protein+of+postsynaptic+density-95+and+metallothionein+in+cultured+hippocampal+neurons.">Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).</li><li>Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+proteins+in+intact+cells+with+a+clonable+tag+for+electron+microscopy.">Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).</li><li>Risco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sensitive,+high-resolution+detection+of+protein+molecules+in+eukaryotic+cells+using+metal-tagging+transmission+electron+microscopy.">sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy.</a> Structure. 20 (5), 759-766 (2012).</li><li>Ding, S. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+role+for+the+host+Vps4+AAA++ATPase+ESCRT+protein+in+the+formation+of+tomato+bushy+stunt+virus+replicase.">Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).</li><li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+gold+nanoparticles+on+cysteine-rich+tags+in+yeast+cells.">Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells.</a> Protocol Exchange. , (2020).</li><li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+gold+nanoparticles+on+cysteine-rich+tags+in+mammalian+cells.">Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells.</a> Protocol Exchange. , (2020).</li><li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+tags+for+direct+synthesis+of+EM-visible+gold+nanoparticles+in+cells.">Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells.</a> Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).</li><li>Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+thiol-derivatised+gold+nanoparticles+in+a+two-phase+liquid-liquid+system.">Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system.</a> Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).</li></ol>

В исследовании представлена надежная клонируемая технология электромагнитной маркировки для визуализации одномолекулярных белковых молекул в клеточной среде с ультраструктурным разрешением. AuNP, непосредственно синтезированные на генетически кодируемых метках, богатых цистеином, ...

В постгеномную эпоху разработка зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве одномолекулярного репортера для световой микроскопии произвела революцию в области современных исследований в области наук о жизни 1,2. На протяжении десятилетий электронная микроскопия (ЭМ) была мощным инструментом для интуитивного наблюдения за клеточной ультраструктурой с наноразмерным разрешением3; Однако точная идентификация и локализация белковых молекул остаются сложной задачей.
Наиболее часто используемым методом ЭМ-мечения является метод маркировки иммуноэлектронной микроскопии (IEM), который основан на реакции антиген-антитело. Однако, несмотря на то, что в области маркировки ИЭМ было разработано множество методов, включая предварительную и поствстраиваемую ИЭМ (на срезах смолы или гидратированных криосекциях), она по-прежнему страдает от низкой эффективности маркировки (<10%)4,5, что связано с подготовкой образцов и качеством антител. Чтобы преодолеть эти ограничения, разработка генетически закодированных меток имеет большой потенциал применения.
В последние годы были тщательно изучены два основных типа электромагнитных меток. Одним из типов является метод окрашивания DAB, в котором используются такие метки, как APEX2, для окисления 3,3'-диаминобензидина (DAB) до осмофильных полимеров для ЭМ-визуализации 6,7,8,9,10,11,12. Он позволяет маркировать белки с высоким содержанием в субклеточных областях, но не подходит для подсчета отдельных молекул. Другой тип использует металлсвязывающие белки, такие как ферритин 13 и металлотионеин (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, для образования электронно-плотных металлических отложений в situ для ЭМ-визуализации. Только последний обладает реальным потенциалом для визуализации и подсчета одномолекул. Молекулярный размер ферритина слишком велик (~ 450 кДа), чтобы его можно было использовать в качестве перспективной метки, в то время как маленький размер (~ 5 кДа) МТ и его способность связывать различные ионы через свои 20 цистеинов привлекли большое внимание. Несколько лабораторий пытались маркировать очищенные белки слияния МТ или клетки, экспрессирующие МТ, путем инкубации непосредственно с Au +. Эти попытки первоначально доказали, что метки МТ могут связывать ионы золота с образованием высококонтрастных сигналов, но ни одна из них не достигла эффективной идентификации отдельных белков в клетках, и они не являются широко применимыми 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Метод синтеза AuNP на основе ANSM, который включает синтез AuNP размером 2-6 нм непосредственно на метках, богатых цистеином (например, MT, варианты MT MTn и MTα, AFP) в качестве электронно-плотных меток для ЭМ-визуализации, является первым надежным и применимым подходом к маркировке белков и обнаружению отдельных молекул в клетках24,25,26. Он позволяет осуществлять специфический синтез AuNP на изолированных белках слияния меток и достиг беспрецедентной эффективности маркировки в нефиксированных или химически фиксированных прокариотических (E. coli) и эукариотических (S. pombe) клетках. Однако реализация того же протокола в более продвинутых системах, таких как клетки млекопитающих или даже ткани, сопряжена с дополнительными проблемами, такими как более сложный внутриклеточный окислительно-восстановительный гомеостаз и более хрупкая клеточная структура.
В этом исследовании представлена клонируемая технология ЭМ-мечения, которая сочетает в себе новый метод синтеза AuNP на основе ANSM для маркировки генетически кодируемых цистеин-богатых меток (MT) с методом пробоподготовки HPF/FSF-регидратации-HPF/FSF, что позволяет однозначно идентифицировать меченые белки по одной молекуле в мембране ER, просвете ER и митохондриальном матриксе в клетках HeLa. Современный метод сочетает в себе такие характеристики, как высокая эффективность мечения, высокое отношение сигнал/шум, одномолекулярная маркировка и сильная универсальность, и этот метод имеет широкие перспективы применения в исследованиях в области наук о жизни.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier</td>
			<td>Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M HEPES buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL MaxyClear snaplock microtube</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL polypropylene screw cap microtubes</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>81-0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mesh hexagonal copper grid</td>
			<td>Tedpella inc</td>
			<td>G200HEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0482-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company</td>
			<td>31025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated freeze substitution machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td>AFS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF</td>
			<td>Beijing Wulundes Biotech Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-penicillamine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>GBICO</td>
			<td>C11965500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GBICO</td>
			<td>10099-141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom embedding capsule</td>
			<td>Tedpella inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam cryobox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar 15/95 resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAuCl4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4022-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>sigma&#160;</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPF machine</td>
			<td>Wohlwend&#160;</td>
			<td>HPF compact01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal&#160;</td>
			<td>Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company</td>
			<td>12397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>480886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-A buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper (medium speed)</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>FFT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire discs</td>
			<td>Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent resistant pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62053-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Pon 812 resin</td>
			<td>SPI Inc</td>
			<td>02659-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2 spirit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>GBICO</td>
			<td>C25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramictotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>FC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct synthesis of em-visible gold nanoparticles in cells for protein localization analysis with well-preserved ultrastructure

Анализ точной локализации белковых молекул в клетках с ультраструктурным разрешением имеет большое значение для изучения различных физиологических или патологических процессов во всех живых организмах. Таким образом, разработка клонируемых меток, которые можно использовать в качестве зондов электронной микроскопии, имеет большое значение, так же как флуоресцентные белки сыграли решающую роль в области оптической визуализации. Недавно был обнаружен механизм подавления аутонуклеации (ANSM), который позволяет осуществлять специфический синтез наночастиц золота (AuNP) на богатых цистеином метках, таких как металлотионеин (МТ) и антифризный белок (АФП).
На основе ANSM была разработана технология электронной микроскопии маркировки, которая позволяет специфически обнаруживать меченые белки в прокариотических и эукариотических клетках с беспрецедентной эффективностью мечения. Это исследование иллюстрирует протокол обнаружения слитых белков MTn (модифицированный вариант MT, в котором отсутствуют альдегид-реакционноспособные остатки) в клетках млекопитающих с хорошо сохранившейся ультраструктурой. В этом протоколе замораживание под высоким давлением и фиксация замораживанием выполнялись с использованием неальдегидных фиксаторов (таких как дубильная кислота, уранилацетат) для сохранения почти нативной ультраструктуры и предотвращения повреждения активности метки, вызванного альдегидным сшиванием.
Простая одностадийная регидратация использовалась до синтеза AuNP на основе ANSM. Результаты показали, что меченые белки нацелены на различные органеллы, включая мембраны и просвет эндоплазматического ретикулума (ER), а митохондриальные матрицы были обнаружены с высокой эффективностью и специфичностью. Это исследование предоставляет биологам надежный протокол для решения огромного круга биологических вопросов на уровне одной молекулы в клеточном ультраструктурном контексте.

In the postgenomic era, the development of green fluorescent protein (GFP) as a single-molecule reporter for light microscopy has revolutionized the field of modern life science research1,2. For decades, electron microscopy (EM) has been a powerful tool for intuitively observing the cellular ultrastructure with nanoscale resolution3; however, the precise identification and localization of protein molecules remain challenging.
The most commonly used EM labeling technique is the immunoelectron microscopy (IEM) labeling technique, which is based on the antigen-antibody reaction. However, although many techniques have been developed in the field of IEM labeling, including pre-embedding IEM and post-embedding IEM (on resin sections or hydrated cryosections), it still suffers from low labeling efficiency (&#60;10%)4,5, which is related to the sample preparation and antibody quality. To overcome these limitations, developing genetically encoded tags has great application potential.
Two main types of EM tags have been thoroughly explored in recent years. One type is the DAB staining method, which utilizes tags such as APEX2 to oxidize 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) to osmiophilic polymers for EM visualization6,7,8,9,10,11,12. It enables the labeling of high-abundance proteins in subcellular regions but is not suitable for single-molecule counting. The other type utilizes metal-binding proteins, such as ferritin13 and metallothionein (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, to generate electron-dense metal deposits in situ for EM visualization. Only the latter has real potential for single-molecule visualization and counting. The molecular size of ferritin is too large (~450 kD) for it to be used as a promising tag, whereas the small size (~5 kD) of MT and its ability to bind various ions through its 20 cysteines have attracted great attention. Several labs have tried to label purified MT-fusion proteins or MT-expressing cells by incubating directly with Au+. These attempts have initially proved that MT tags can bind gold ions to form high-contrast signals, but none have really achieved the effective identification of individual proteins in cells, and they are not widely applicable14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
The ANSM-based AuNP synthesis technique, which involves synthesizing 2-6 nm-sized AuNPs directly on cysteine-rich tags (e.g., MT, the MT variants MTn and MT&#945;, AFP) as electron-dense labels for EM visualization, is the first reliable and applicable approach for protein labeling and single molecule detection in cells24,25,26. It allows for the specific synthesis of AuNPs on isolated tag fusion proteins and has achieved an unprecedented labeling efficiency in nonfixed or chemically fixed prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (S. pombe) cells. However, implementing the same protocol in more advanced systems such as mammalian cells or even tissues involves additional challenges, such as the more complex intracellular redox homeostasis and more fragile cellular structure.
This study presents a clonable EM labeling technology, which combines the novel ANSM-based AuNP synthesis technique for labeling genetically encoded cysteine-rich tags (MT) with the HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF sample preparation method, enables the unambiguous single-molecule identification of tagged proteins in the ER membrane, ER lumen, and mitochondrial matrix in HeLa cells. The current method combines the characteristics of high labeling efficiency, a high signal-to-noise ratio, single-molecule labeling, and strong universality, and this method has broad application prospects in life science research.

Author Spotlight: Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure  

Прямой синтез ЭМ-видимых наночастиц золота в клетках для анализа локализации белка с хорошо сохранившейся ультраструктурой

Protein detection and localization are essential in biological research. Our protocol describes a novel EM-labeling technology using genetically-encoded tags which allows single-molecule visualization in situ with well-preserved ultrastructure. It is crucial to avoid over-fixation.The labeling method is based on the activity of cysteines in the tags, which are highly sensitive to aldehyde cross-linking. Our protocol avoids use of aldehyde fixatives and preserves the tag activity and ultrastructure. at the same time.EM labeling has always been challenging, suffering from poor morphology or inefficient labeling. Our protocols synthesizes in situ nanoparticles directly on individual proteins to provide clear and precise localization of the target proteins, with a high signal-to-noise ratio, high efficiency, and specificity. We have so far achieved excellent labeling in isolated proteins, E.coli cells, yeast cells, and HeLa cells.We will explore and optimize the method for application to tissue samples. Combining the prevailing cryo-FIB and cryo-EM technologies will allow us to address important biological questions.

Метод синтеза AuNP на основе ANSM является чрезвычайно полезным инструментом для маркировки и обнаружения белков, меченных МТ, с помощью TEM26. Чтобы подтвердить его устойчивость в клетках млекопитающих, были сгенерированы три стабильные клеточные линии, экспрессирующие EGFP-MTn-KDE...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure at JoVE.com

Настоящий протокол описывает технологию маркировки клонируемой электронной микроскопией для обнаружения белков, меченных металлотионеином, в клетках с использованием нового метода синтеза наночастиц золота, основанного на механизме подавления аутонуклеации.

Analyzing the precise localization of protein molecules in cells with ultrastructural resolution is of great significance for the study of various ...

Обнаружение и локализация белка имеют важное значение в биологических исследованиях. Наш протокол описывает новую технологию электромагнитной маркировки с использованием генетически кодируемых меток, которая позволяет визуализировать одну молекулу in situ с хорошо сохранившейся ультраструктурой. Крайне важно избегать чрезмерной фиксации.Метод мечения основан на активности цистеинов в метках, которые обладают высокой чувствительностью к альдегидному сшиванию. Наш протокол исключает использование альдегидных фиксаторов и сохраняет активность меток и ультраструктуру. в то же время.Маркировка ЭМ всегда была сложной задачей, страдая от плохой морфологии или неэффективной маркировки. Наши протоколы синтезируют наночастицы in situ непосредственно на отдельных белках, чтобы обеспечить четкую и точную локализацию целевых белков с высоким отношением сигнал/шум, высокой эффективностью и специфичностью. До сих пор мы достигли отличной маркировки в изолированных белках, клетках E.coli, дрожжевых клетках и клетках HeLa.Мы изучим и оптимизируем метод для нанесения на образцы тканей. Объединение преобладающих крио-FIB и крио-ЭМ технологий позволит нам решать важные биологические вопросы.