Name: Author Spotlight: Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells
Uploaded: 2023-05-12T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) e pela University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).

1. Preparação das soluções
<ol><li>Preparar a solução de esterilização de sementes misturando 15 mL de água sanitária com 35 mL de água destilada e 50 μL de Triton X-100.</li>
	<li>Preparar a solução de brefeldina A (BFA) dissolvendo o pó de BFA em etanol até uma concentração final de 10 mM (stock). Preparar a solução de wortmannin (Wm) dissolvendo o pó de Wm em DMSO até uma concentração final de 10 mM (stock).</li>
</ol>2. Semeando as sementes</str...

Spatiotemporal Investigation of ERL1 Dynamics via Confocal Imaging

<ol>
	<li>Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+endomembrane+trafficking+in+plants.">Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants.</a> Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).</li><li>Sigismund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+and+signaling:+Cell+logistics+shape+the+eukaryotic+cell+plan.">Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan.</a> Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).</li><li>Lyu, Z., Genereux, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+measuring+protein+trafficking+across+cellular+membranes.">Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes.</a> ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).</li><li>Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+roads:+Chemical+tools+and+cell+biology+to+study+unconventional+protein+secretion.">Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion.</a> Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).</li><li>Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+wortmannin-induced+reorganization+of+the+trans-Golgi+network+the+key+to+explain+charasome+formation.">Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).</li><li>Qi, X., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+and+environmental+signals+guiding+stomatal+development.">Hormonal and environmental signals guiding stomatal development.</a> BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).</li><li>Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+lineage+control+by+developmental+program+and+environmental+cues.">Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).</li><li>Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid-induced+stomatal+closure:+An+important+component+of+plant+defense+against+abiotic+and+biotic+stress.">Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).</li><li>Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , (2021).</li><li>Yang, M., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+too+many+mouths+and+four+lips+mutations+affect+stomatal+production+in+Arabidopsis.">The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).</li><li>Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretory+peptide+gene+EPF1+enforces+the+stomatal+one-cell-spacing+rule.">The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule.</a> Genes &amp; Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).</li><li>Hara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cell+density+is+autoregulated+via+a+secretory+peptide,+EPIDERMAL+PATTERNING+FACTOR+2+in+Arabidopsis+leaves.">Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).</li><li>Hunt, L., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signaling+peptide+EPF2+controls+asymmetric+cell+divisions+during+stomatal+development.">The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development.</a> Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).</li><li>Sugano, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomagen+positively+regulates+stomatal+density+in+Arabidopsis.">Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis.</a> Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).</li><li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+density+is+controlled+by+a+mesophyll-derived+signaling+molecule.">Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).</li><li>Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signalling+peptide+EPFL9+is+a+positive+regulator+of+stomatal+development.">The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development.</a> New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).</li><li>Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+patterning+and+differentiation+by+synergistic+interactions+of+receptor+kinases.">Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases.</a> Science. 309 (5732), 290-293 (2005).</li><li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor-like+protein+acts+as+a+specificity+switch+for+the+regulation+of+stomatal+development.">A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development.</a> Genes &amp; Development. 31 (9), 927-938 (2017).</li><li>Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interaction+of+ligand-receptor+pairs+specifying+stomatal+patterning.">Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning.</a> Genes &amp; Development. 26 (2), 126-136 (2012).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+manifold+actions+of+signaling+peptides+on+subcellular+dynamics+of+a+receptor+specify+stomatal+cell+fate.">The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate.</a> Elife. 9, e58097 (2020).</li><li>MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+control+of+asymmetric+cell+divisions+that+establish+the+stomatal+lineage.">Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage.</a> Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).</li><li>Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Termination+of+asymmetric+cell+division+and+differentiation+of+stomata.">Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata.</a> Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).</li><li>Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+FAMA+controls+the+final+proliferation/differentiation+switch+during+stomatal+development.">Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development.</a> Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).</li><li>Kanaoka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCREAM/ICE1+and+SCREAM2+specify+three+cell-state+transitional+steps+leading+to+Arabidopsis+stomatal+differentiation.">SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation.</a> Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).</li><li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase.">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).</li><li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis.">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).</li><li>Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulators+of+stomatal+lineage+signal+transduction+alter+membrane+contact+sites+and+reveal+specialization+among+ERECTA+kinases.">Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases.</a> Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).</li><li>Le, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+transport+and+activity+regulate+stomatal+patterning+and+development.">Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development.</a> Nature Communications. 5, 3090 (2014).</li><li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GNOM+ARF-GEF+mediates+endosomal+recycling,+auxin+transport,+and+auxin-dependent+plant+growth.">The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth.</a> Cell. 112 (2), 219-230 (2003).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+stomatal+differentiation+potential+by+EPF1+and+ERECTA-LIKE1+ligand-receptor+signaling.">Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling.</a> Elife. 6, 24102 (2017).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+super-resolution+imaging+techniques.">Label-free super-resolution imaging techniques.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinning-disk+confocal+microscopy:+Present+technology+and+future+trends.">Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), (2019).</li><li>Nwaneshiudu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+confocal+microscopy.">Introduction to confocal microscopy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).</li><li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy.">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).</li></ol>

O sistema de endomembrana separa o citoplasma de uma célula eucariótica em diferentes compartimentos, o que possibilita a função biológica especializada dessas organelas. Para entregar proteínas de carga e macromoléculas ao seu destino final no momento certo, inúmeras vesículas são guiadas para transportar entre essas organelas. Eventos de tráfico de membrana altamente regulados desempenham papéis fundamentais na viabilidade, desenvolvimento e crescimento das células. O mecanismo que regula esse processo cru...

O tráfego de membranas é um processo celular conservado que distribui componentes da membrana (também conhecidos como cargas), incluindo proteínas, lipídios e outros produtos biológicos, entre diferentes organelas dentro de uma célula eucariótica ou através da membrana plasmática de e para o espaço extracelular1. Esse processo é facilitado por uma coleção de membranas e organelas denominada sistema endomembrana, que consiste na membrana nuclear, no retículo endoplasmático, no aparelho de Golgi, no vacúolo/lisossomos, na membrana plasmática e em múltiplos endossomos1. O sistema de endomembrana permite a modificação, empacotamento e transporte de componentes da membrana usando vesículas dinâmicas que transitam entre essas organelas. Os eventos de tráfico de membranas são cruciais para o desenvolvimento, crescimento e adaptação ambiental das células e, portanto, estão sob regulação rigorosa e complexa2. Atualmente, múltiplas abordagens em biologia molecular, biologia química, microscopia e espectrometria de massas têm sido desenvolvidas e aplicadas ao campo do tráfego de membranas e têm avançado muito o entendimento da regulação espaço-temporal do sistema endomembrana3,4. A biologia molecular é usada para manipulações genéticas clássicas dos possíveis atores envolvidos no tráfico de membranas, como alterar a expressão gênica da proteína de interesse ou rotular a proteína de interesse com certas etiquetas. Ferramentas em biologia química incluem o uso de moléculas que interferem especificamente no tráfego de determinadas rotas 4,5. A espectrometria de massas é poderosa para identificar os componentes de uma organela que foi isolada mecanicamente por abordagens bioquímicas 3,4. No entanto, o tráfego de membranas é um processo biológico dinâmico, diversificado e complexo1. Para visualizar o processo de tráfego de membranas em células vivas sob várias condições, a microscopia de luz é uma ferramenta essencial. Progressos contínuos têm sido feitos em técnicas avançadas de microscópio para superar os desafios na medição da eficiência, cinética e diversidade dos eventos4. Aqui, este estudo se concentra nas metodologias amplamente adotadas em biologia química/farmacológica, biologia molecular e microscopia para estudar eventos de tráfego de membranas em um sistema naturalmente simplificado e experimentalmente acessível, o processo de desenvolvimento estomático.
Estomatas são microporos na superfície aérea das plantas que se abrem e fecham para facilitar as trocas gasosas entre as células internas e o ambiente 6,7,8. Assim, os estômatos são essenciais para a fotossíntese e transpiração, dois eventos cruciais para a sobrevivência e crescimento das plantas. O desenvolvimento estomático é ajustado dinamicamente por pistas ambientais para otimizar a adaptação da planta ao entorno9. Remontando a estudos realizados em 2002, a identificação da proteína receptora Too Many Mouths (TMM) abriu as portas para uma nova era de investigação dos mecanismos moleculares do desenvolvimento estomático na planta-modelo Arabidopsis thaliana10. Após apenas algumas décadas, uma via de sinalização clássica foi identificada. De montante para jusante, essa via inclui um grupo de ligantes peptídicos secretores na família dos fatores de padronização epidérmica (EFP), várias quinases de receptores de repetição rica em leucina (LRR) de superfície celular da família EREECTA (ER), a proteína TMM do receptor LRR, uma cascata MAPK e vários fatores de transcrição bHLH, incluindo SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA, e SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Trabalhos anteriores indicam que uma das quinases receptoras, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstra comportamentos subcelulares ativos sobre a percepção do PFE20. O ERL2 também trafega dinamicamente entre a membrana plasmática e algumas organelas intracelulares27. O bloqueio das etapas de tráfego da membrana causa padrões estomáticos anormais, resultando em aglomerados estomáticos na superfície foliar28. Estes resultados sugerem que o tráfego de membranas desempenha um papel essencial no desenvolvimento estomático. Este estudo descreve um protocolo para investigar espaço-temporalmente a dinâmica do ERL1 usando análise de co-localização subcelular proteína-proteína combinada com tratamento farmacológico usando alguns inibidores do tráfego de membrana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309695</td>
			<td>Vacuum samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A (BFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651</td>
			<td>membrane trafficking drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Lecia SP8 TCS with LAS-X software package</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-402</td>
			<td>Genetic cross</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS AF software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>http://www.leica-microsystems.com</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic seeds of ERL1-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic seeds of RFP-Ara7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin (Wm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td>membrane trafficking drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image-based methods to study membrane trafficking events in stomatal lineage cells

Em células eucarióticas, os componentes da membrana, incluindo proteínas e lipídios, são transportados espaço-temporalmente para seu destino dentro do sistema endomembrana. Isso inclui o transporte secretor de proteínas recém-sintetizadas para a superfície celular ou para o exterior da célula, o transporte endocítico de cargas extracelulares ou componentes da membrana plasmática para dentro da célula, e a reciclagem ou transporte de cargas entre as organelas subcelulares, etc. Os eventos de tráfico de membranas são cruciais para o desenvolvimento, crescimento e adaptação ambiental de todas as células eucarióticas e, portanto, estão sob regulamentação rigorosa. As quinases dos receptores de superfície celular, que percebem os sinais dos ligantes do espaço extracelular, sofrem transporte secretor e endocítico. Abordagens comumente usadas para estudar os eventos de tráfego de membrana usando uma quinase do receptor de leucina rica em repetição localizada na membrana plasmática, ERL1, são descritas aqui. As abordagens incluem preparação de material vegetal, tratamento farmacológico e configuração de imagens confocais. Para monitorar a regulação espaço-temporal do ERL1, este estudo descreve a análise de co-localização entre ERL1 e uma proteína marcador de corpo multivesicular, RFP-Ara7, a análise de séries temporais dessas duas proteínas e a análise z-stack de ERL1-YFP tratadas com os inibidores de tráfego de membrana brefeldina A e wortmannina.

Membrane traffic is a conserved cellular process that distributes membrane components (also known as cargoes), including proteins, lipids, and other biological products, between different organelles within a eukaryotic cell or across the plasma membrane to and from the extracellular space1. This process is facilitated by a collection of membranes and organelles named the endomembrane system, which consists of the nuclear membrane, the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, the vacuole/lysosomes, the plasma membrane, and multiple endosomes1. The endomembrane system enables the modification, packaging, and transport of membrane components using dynamic vesicles that shuttle between these organelles. Membrane trafficking events are crucial to cell development, growth, and environmental adaptation and, thus, are under stringent and complex regulation2. Currently, multiple approaches in molecular biology, chemical biology, microscopy, and mass spectrometry have been developed and applied to the field of membrane trafficking and have greatly advanced the understanding of the spatiotemporal regulation of the endomembrane system3,4. Molecular biology is used for classical genetic manipulations of the putative players involved in membrane trafficking, such as altering the gene expression of the protein of interest or labeling the protein of interest with certain tags. Tools in chemical biology include the usage of molecules that specifically interfere with the traffic of certain routes4,5. Mass spectrometry is powerful for identifying the components in an organelle that has been mechanically isolated by biochemical approaches3,4. However, membrane traffic is a dynamic, diverse, and complex biological process1. To visualize the membrane trafficking process in live cells under various conditions, light microscopy is an essential tool. Continuous progress has been made in advanced microscope techniques to overcome the challenges in measuring the efficiency, kinetics, and diversity of the events4. Here, this study focuses on the widely adopted methodologies in chemical/pharmacological biology, molecular biology, and microscopy to study membrane trafficking events in a naturally simplified and experimentally accessible system, the stomatal developmental process.
Stomata are micropores on plant aerial surfaces that open and close to facilitate gas exchange between the inner cells and the environment6,7,8. Hence, stomata are essential for photosynthesis and transpiration, two events that are crucial for plant survival and growth. Stomatal development is dynamically adjusted by environmental cues to optimize the plant&#39;s adaptation to the surroundings9. Dating back to studies in 2002, the identification of the receptor protein Too Many Mouths (TMM) opened the door to a new era of investigating the molecular mechanisms of stomatal development in the model plant Arabidopsis thaliana10. After just a few decades, a classical signaling pathway has been identified. From upstream to downstream, this pathway includes a group of secretory peptide ligands in the epidermal patterning factors (EFP) family, several cell-surface leucine-rich-repeat (LRR) receptor kinases in the EREECTA (ER) family, the LRR receptor protein TMM, a MAPK cascade, and several bHLH transcription factors including SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA, and SCREAM (SCRM)11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Previous work indicates that one of the receptor kinases, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstrates active subcellular behaviors upon EPF perception20. ERL2 also dynamically traffics between the plasma membrane and some intracellular organelles27. Blocking the membrane trafficking steps causes abnormal stomatal patterning, resulting in stomatal clusters on the leaf surface28. These results suggest that membrane traffic plays an essential role in stomatal development. This study describes a protocol to spatiotemporally investigate the ERL1 dynamics using protein-protein subcellular co-localization analysis combined with pharmacological treatment using some membrane trafficking inhibitors.

Author Spotlight: Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells  

Métodos Baseados em Imagem para Estudo de Eventos de Tráfego de Membranas em Células de Linhagem Estomática

This technique studies the membrane trafficking events in stomatal development, the micropores on plant aerial surface, to facilitate photosynthesis and the transpiration. Various techniques are used to study plant stomatal development. This includes molecular biology, cell biology or microscopy, chemical biology, mass spectrometry, biochemistry, and structural biology.Individual stomata form asynchronously. Each stoma is formed by three transcend cell fate transitions. So collecting enough stomata lineage cells at a particular cell fate is one of the big challenges.Membrane trafficking is essential for cell survival and growth. Stomata lineage cell is no exception. This protocol addresses the commonly used approach to study membrane trafficking events in stomata lineage cells.Plants face challenging environment in the face of climate change. Stomata are passages for plant gas exchange, and are highly flexible to environmental stress for adaptation. We are interested in studying how abiotic stress affects the stomata development by focusing on the membrane trafficking of certain proteins in stomata lineage cells.

Um estudo anterior indicou que ERL1 é um receptor quinase ativo que sofre eventos dinâmicos de tráfego de membrana20. ERL1 é uma quinase transmembrana do receptor LRR na membrana plasmática. O ERL1 recém-sintetizado no retículo endoplasmático é processado nos corpos de Golgi e posteriormente transportado para a membrana plasmática. As moléculas de ERL1 na membrana plasmática podem perceber ligantes de FPE usando seu domínio LRR extracelular18. Após a ativaçã...

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Vários métodos comumente usados são introduzidos aqui para estudar os eventos de tráfego de membrana de uma quinase do receptor de membrana plasmática. Este manuscrito descreve protocolos detalhados, incluindo a preparação do material vegetal, tratamento farmacológico e configuração de imagens confocais.

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

Esta técnica estuda os eventos de tráfego de membranas no desenvolvimento estomático, os microporos na superfície aérea das plantas, para facilitar a fotossíntese e a transpiração. Várias técnicas são utilizadas para estudar o desenvolvimento estomático das plantas. Isso inclui biologia molecular, biologia celular ou microscopia, biologia química, espectrometria de massas, bioquímica e biologia estrutural.Os estômatos individuais se formam de forma assíncrona. Cada estoma é formado por três transições transcendentes do destino celular. Portanto, coletar células de linhagem estômala suficientes em um determinado destino celular é um dos grandes desafios.O tráfego de membranas é essencial para a sobrevivência e crescimento celular. A célula da linhagem Stomata não é exceção. Este protocolo aborda a abordagem comumente usada para estudar eventos de tráfego de membrana em células de linhagem estomática.As plantas enfrentam um ambiente desafiador diante das mudanças climáticas. Os estômatos são passagens para trocas gasosas de plantas, e são altamente flexíveis ao estresse ambiental para adaptação. Estamos interessados em estudar como o estresse abiótico afeta o desenvolvimento dos estômatos, focando no tráfego de membrana de certas proteínas em células da linhagem estomática.