Name: Author Spotlight: Investigating Islet Abnormalities and Function with a Pseudoislet Protocol
Uploaded: 2023-11-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Islet Abnormalities and Function with a Pseudoislet Protocol at JoVE.com

Organdonatorer och deras familjer uppskattas för sina ovärderliga donationer, och International Institute for Organ Procurement Organizations, Advancement of Medicine (IIAM) och National Disease Research Exchange (NDRI) uppmärksammas för sitt samarbete för att göra mänsklig bukspottkörtelvävnad tillgänglig för forskning. Detta arbete stöddes av Human Islet Research Network (RRID:SCR_014393), Human Pancreas Analysis Program (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 och DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), Leona M. och Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, U.S. Department of Veterans Affairs (BX000666), NIGMS från National Institutes of Health (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 och National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).

Humana öar (N = 4 preparat) erhölls genom partnerskap med Integrated Islet Distribution Program, Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. och Imagine Pharma. Vanderbilt University Institutional Review Board betraktar inte avidentifierade prover från bukspottkörteln som forskning på människor. Detta arbete skulle inte vara möjligt utan organdonatorer, deras familjer och organisationer som tillvaratar organ. Se tabell 1 för information om donatordemografi. Humana öar från bukspot...

Intracellular Signaling Events and Hormone Secretion in Human Pseudoislets

<ol>
	<li>Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+systemic+insulin+function.">The cell biology of systemic insulin function.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).</li><li>Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+controls+glucagon+secretion+by+directly+modulating+cAMP+in+alpha+cells.">Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells.</a> Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).</li><li>Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+islet+glucagon+secretion:+Beyond+calcium.">Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium.</a> Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).</li><li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Halban, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-cell+failure+in+type+2+diabetes:+Postulated+mechanisms+and+prospects+for+prevention+and+treatment.">&#946;-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;+cell+function+and+gene+expression+are+compromised+in+type+1+diabetes.">&#945; cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes.</a> Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).</li><li>Walker, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+human+pseudoislet+system+and+microfluidic+platform+demonstrate+differences+in+GPCR+signaling+in+islet+cells.">Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells.</a> JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).</li><li>Giannoukakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+intact+human+islets+by+a+lentiviral+vector.">Infection of intact human islets by a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).</li><li>Curran, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+pancreatic+islets+by+feline+immunodeficiency+virus+vectors1.">Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1.</a> Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).</li><li>Kayton, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islet+preparations+distributed+for+research+exhibit+a+variety+of+insulin-secretory+profiles.">Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function.">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).</li><li>Lenguito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resealable,+optically+accessible,+PDMS-free+fluidic+platform+for+ex+vivo+interrogation+of+pancreatic+islets.">Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets.</a> Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).</li><li>Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DAG+and+cAMP+sensors+optimized+for+live-cell+assays+in+automated+laboratories.">New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).</li><li>Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+dynamics+in+the+pancreatic+&#946;-cell.">Cyclic AMP dynamics in the pancreatic &#946;-cell.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).</li><li>Klemen, M. S., Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. S., Sto&#382;er, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triggering+pathway+to+insulin+secretion:+Functional+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+&#946;+cells+and+their+translational+relevance.">The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse &#946; cells and their translational relevance.</a> Islets. 9 (6), 109-139 (2017).</li></ol>

Integreringen av ett mikroperifusionssystem, pseudoöar som uttrycker biosensorer och konfokalmikroskopi med laserskanning möjliggör synkron bedömning av intracellulära signaleringshändelser och dynamiska hormonsekretoriska profiler. Det dynamiska mikroperifusionssystemet kan leverera en serie väldefinierade stimuli till pseudoöarna och möjliggör uppsamling av avloppsvattnet, där insulin- och glukagonkoncentrationerna kan mätas med kommersiellt tillgängliga ELISA. Samtidigt fångar levande cellavbildning av d...

De Langerhanska öarna är miniorgan utspridda i bukspottkörteln vars funktion är avgörande för upprätthållandet av glukoshomeostas. Insulin utsöndras från betaceller efter metabolism av glukos, en ökning av ATP/ADP-kvoten, stängning av ATP-känsliga kaliumkanaler, depolarisering av plasmamembranet och inflöde av extracellulärt kalcium1. Glukagonsekretionen från alfaceller är mindre känd, men det har antagits att intracellulära och parakrina vägar bidrar till glukagongranulär exocytos 2,3,4. Både typ 1- och typ 2-diabetes är associerade med ö-cellsdysfunktion 5,6,7. Därför är det viktigt att belysa de intracellulära signalvägarna som förmedlar ö-hormonutsöndring för att förstå fysiologiska och patologiska mekanismer i bukspottkörtelns öar.
Holmarnas sfäriska arkitektur utgör vissa hinder för experiment. Dessa utmaningar inkluderar variation i östorlek och 3D-karaktären hos öar, vilket minskar viral transduktion inom ökärnan 8,9. För att övervinna dessa utmaningar utvecklades ett pseudoislet-system, där primära mänskliga öar sprids i enskilda celler, adenoviralt transduceras med konstruktioner som kodar för mål av intresse, och reaggregeras för att bilda storlekskontrollerade, ö-liknande strukturer som kallas pseudoislets7. Jämfört med inhemska öar från samma donator som har odlats parallellt, är dessa pseudoöar likartade i morfologi, endokrin cellsammansättning och hormonutsöndring7. Denna metod gör det möjligt att uttrycka konstruktioner i hela pseudoön, vilket innebär att den övervinner en tidigare barriär för enhetlig genetisk manipulation av primära mänskliga öar 7,8,9.
I detta protokoll är pseudoislet-systemet integrerat med en mikrofluidisk anordning för att uttrycka biosensorer i primära humana ö-celler och få tidsmässig upplösning av pseudoislet-hormonutsöndring under dynamisk perifusion10,11,12. Pseudoöarna placeras i ett mikrochip och utsätts för ett jämnt flöde av olika sekretagoger via en peristaltisk pump12. Mikrochipet har en genomskinlig glasbotten och är monterat på ett konfokalmikroskop för att registrera den intracellulära signaldynamiken via förändringar i biosensorns fluorescensintensitet. Biosensoravbildning synkroniseras med uppsamling av mikroperifusionsavloppsvatten för efterföljande analys av insulin- och glukagonsekretion7. Jämfört med makroperifusion gör denna mikroperifusionsmetod det möjligt att använda färre pseudoöar på grund av den mindre volymen av den mikrofluidiska enheten jämfört med makroperifusionskammaren7.
För att utnyttja användbarheten av detta system uttrycktes den cykliska adenosinmonofosfatdosametern (cADDis) biosensor in situ (cADDis) i humana pseudoöar för att bedöma cAMP-dynamik och hormonutsöndring. cADDis-biosensorn består av ett cirkulärt permuterat grönt fluorescerande protein (cpGFP) placerat i gångjärnsregionen av ett utbytesprotein som aktiveras av cAMP 2 (EPAC2), som förbinder dess regulatoriska och katalytiska regioner. Bindningen av cAMP till den regulatoriska regionen av EPAC2 framkallar en konformationsförändring i gångjärnsområdet som ökar fluorescensen från cpGFP13. Intracellulära budbärare såsom cAMP framkallar insulin- och glukagonsekretion efter uppströmsaktivering av G-proteinkopplade receptorer14. Avbildning av levande celler i kombination med mikroperifusion hjälper till att koppla ihop den intracellulära cAMP-dynamiken med utsöndring av ö-hormon. Specifikt, i detta protokoll, genereras cADDis-uttryckande pseudoislets för att övervaka cAMP-svar i alfa- och betaceller på olika stimuli: lågt glukos (2 mM glukos; G 2), högt glukos plus isobutylmetylxantin (IBMX; 20 mM glukos + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) och lågt glukos plus adrenalin (Epi; 2 mM glukos + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Detta behandlingsarbetsflöde möjliggör bedömning av den intracellulära cAMP-dynamiken direkt via 1) IBMX-medierad fosfodiesterashämning, som förbättrar intracellulära cAMP-nivåer genom att förhindra dess nedbrytning, och 2) adrenalin, en känd cAMP-beroende stimulator av alfacellsglukagonsekretion medierad av β-adrenerg receptoraktivering. Stegen för att installera mikroperifusionsapparaten för avbildningsexperiment med levande celler, laddning av pseudoislets i mikrochipet, synkron avbildning av levande celler och mikroperifusion samt analys av biosensorspår och hormonutsöndring med mikroplattbaserade hormonanalyser beskrivs nedan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad-CMV-cADDis</td>
			<td>Welgen</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.01&#8221; FEP tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1527L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL and conical tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;m PTFE filter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-21940-41</td>
			<td>Change every 8-10 runs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>2816</td>
			<td>Acid Ethanol Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM GlutaMAX-I Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap&#160;</td>
			<td>Omnifit</td>
			<td>006BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier ULA&#160;96-well Microplates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>v3.1</td>
			<td>Software used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL 1066</td>
			<td>MediaTech&#160;</td>
			<td>15-110-CV</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical adapter (IDEX, P-794)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>P-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5030</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>okolab</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinepherine (Epi)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4250</td>
			<td>Stimulation Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12306C</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon ELISA</td>
			<td>Mercodia</td>
			<td>10-1281-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon Kit HTRF</td>
			<td>Cisbio</td>
			<td>62CGLPEH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (12N)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Acid Ethanol Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7523</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cell Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td>iEC Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idex Derlin nut &#38; ferrule 1/4-24</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-00414-LW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin ELISA</td>
			<td>Mercodia</td>
			<td>10-1113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutylmethylonine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Stimulation Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microchip (University of Miami, FP-3W)</td>
			<td>University of Miami</td>
			<td>FP-3W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microchip holder&#160;</td>
			<td>Micronit Microfluidics</td>
			<td>FC_PRO_CH4525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 2110 Fraction Collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10, P200, and P1000 pipets and tips</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Instech</td>
			<td>P720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>depends on dish diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td>&#160;DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Filter (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Filter all buffers twice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Cell Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>iEC Media Component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human pseudoislet system for synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and hormone secretory profiles

De Langerhanska öarna i bukspottkörteln, som är små 3D-samlingar av specialiserade endokrina celler och stödceller insprängda i bukspottkörteln, har en central roll i kontrollen av glukoshomeostas genom utsöndring av insulin av betaceller, vilket sänker blodsockret, och glukagon av alfaceller, vilket höjer blodsockret. Intracellulära signalvägar, inklusive de som medieras av cAMP, är nyckeln till reglerad alfa- och betacellshormonutsöndring. 3D-östrukturen, även om den är nödvändig för koordinerad öfunktion, utgör experimentella utmaningar för mekanistiska studier av de intracellulära signalvägarna i primära humana ö-celler. För att övervinna dessa utmaningar och begränsningar beskriver detta protokoll en integrerad plattform för avbildning av levande celler och mikrofluidik som använder primära humana pseudoöar som genereras från donatorer utan diabetes och som liknar inhemska öar i sin morfologi, sammansättning och funktion. Dessa pseudoislets är storlekskontrollerade genom dispersions- och reaggregeringsprocessen av primära humana öceller. I det dispergerade tillståndet kan genuttrycket hos ö-celler manipuleras; Till exempel kan biosensorer som den genetiskt kodade cAMP-biosensorn, cADDis, introduceras. När pseudoöar väl har bildats kan de uttrycka en genetiskt kodad biosensor, i kombination med konfokalmikroskopi och en mikroperifusionsplattform, möjliggöra synkron bedömning av fluorescerande biosensordynamik och alfa- och betacellshormonsekretoriska profiler för att ge mer insikt i cellulära processer och funktion.

The islets of Langerhans are mini organs scattered throughout the pancreas whose function is crucial for the maintenance of glucose homeostasis. Insulin is secreted from beta cells following the metabolism of glucose, an increase in the ATP/ADP ratio, the closure of ATP-sensitive potassium channels, depolarization of the plasma membrane, and the influx of extracellular calcium1. Glucagon secretion from alpha cells is less understood, but it has been postulated that intracellular and paracrine pathways contribute to glucagon granule exocytosis2,3,4. Both type 1 and type 2 diabetes are associated with islet cell dysfunction5,6,7. Therefore, elucidating the intracellular signaling pathways mediating islet hormone secretion is essential for understanding physiologic and pathologic mechanisms in pancreatic islets.
The spherical architecture of islets presents certain obstacles to experimentation. These challenges include islet size variation and the 3D nature of islets, which reduces viral transduction within the islet core8,9. To overcome these challenges, a pseudoislet system was developed, in which primary human islets are dispersed into single cells, adenovirally transduced with constructs encoding targets of interest, and reaggregated to form size-controlled, islet-like structures termed pseudoislets7. Compared to native islets from the same donor that have been cultured in parallel, these pseudoislets are similar in morphology, endocrine cell composition, and hormone secretion7. This method allows for the expression of constructs throughout the pseudoislet, meaning it overcomes a previous barrier to the uniform genetic manipulation of primary human islets7,8,9.
In this protocol, the pseudoislet system is integrated with a microfluidic device to express biosensors in primary human islet cells and gain temporal resolution of&#160;pseudoislet hormone secretion during dynamic perifusion10,11,12. The pseudoislets are placed in a microchip and exposed to a steady flow of different secretagogues via a peristaltic pump12. The microchip has a transparent glass bottom and is mounted on a confocal microscope to record the intracellular signaling dynamics via changes in the biosensor fluorescence intensity. Biosensor imaging is synchronized with the collection of microperifusion effluent for the subsequent analysis of insulin and glucagon secretion7. Compared to macroperifusion, this microperifusion approach allows for fewer pseudoislets to be used due to the smaller volume of the microfluidic device compared to the macroperifusion chamber7.
To harness the utility of this system, the cyclic adenosine monophosphate (cAMP) difference detector in situ (cADDis) biosensor was expressed in human pseudoislets to assess cAMP dynamics and hormone secretion. The cADDis biosensor is composed of a circularly permuted green fluorescent protein (cpGFP) positioned in the hinge region of an exchange protein activated by cAMP 2 (EPAC2), connecting its regulatory and catalytic regions. The binding of cAMP to the regulatory region of EPAC2 elicits a conformational change in the hinge region that increases fluorescence from the cpGFP13. Intracellular messengers such as cAMP elicit insulin and glucagon secretion after the upstream activation of G-protein coupled receptors14. Live-cell imaging coupled with microperifusion helps to connect the intracellular cAMP dynamics with islet hormone secretion. Specifically, in this protocol, cADDis-expressing pseudoislets are generated to monitor cAMP responses in alpha and beta cells to various stimuli: low glucose (2 mM glucose; G 2), high glucose plus isobutylmethylxanthine (IBMX; 20 mM glucose + 100 &#181;M IBMX; G 20 + IBMX), and low glucose plus epinephrine (Epi; 2 mM glucose + 1 &#181;M Epi; G 2 + Epi). This treatment workflow allows for the assessment of the intracellular cAMP dynamics directly via 1) IBMX-mediated phosphodiesterase inhibition, which enhances intracellular cAMP levels by preventing its degradation, and 2) epinephrine, a known cAMP-dependent stimulator of alpha cell glucagon secretion mediated by &#946;-adrenergic receptor activation. The steps for setting up the microperifusion apparatus for live-cell imaging experiments, the loading of the pseudoislets into the microchip, synchronous live-cell imaging and microperifusion, and the analysis of the biosensor traces and hormone secretion by microplate-based hormone assays are detailed below.

Author Spotlight: Investigating Islet Abnormalities and Function with a Pseudoislet Protocol 

Humant pseudoislet-system för synkron bedömning av fluorescerande biosensordynamik och hormonsekretoriska profiler

Our lab is working to understand, prevent, and reverse beta cell dysfunction and other eyelid abnormalities in type one and type two diabetes. Our studies focus on the pathogenesis of human diabetes by integrating studies of the human pancreas and eyelid biology and health and disease. Human eyelets are 3D spherical structures, and accessing cells throughout the entire eyelet presents some experimental challenges.For example, when trying to introduce biosensors to understand eyelet cell signaling, our pseudo eyelid protocol overcomes this challenge by performing genetic manipulations in the single cell state and aggregating these transduced human eyelet cells into pseudo eyelids for downstream studies. Our pseudo eyelid system allows us to express biosensors throughout the entire eyelet, rather than just the eyelid surface. Combined with our live cell imaging and Microperfusion System, we can both measure and co-register dynamic intracellular processes with downstream hormone secretion.This protocol could be applied to answer a variety of important scientific questions. For example, gene silencing strategies could be combined with this approach to understand the impact of a gene of interest on eyelid function and associated signaling pathways, either globally or in a self-specific manner.

Biosensoruttryckande humana pseudoislets skapades via adenoviral leverans av konstrukt som kodar för cAMP-biosensorn cADDis (Figur 1A). Figur 1B visar återaggregeringen av de transducerade humana ö-cellerna över tid, med fullt utvecklade pseudoöar observerade efter 6 dagars odling. Cellerna började visa synlig cADDis-fluorescens inom 48 timmar, och det fanns ett högt biosensoruttryck i transducerade celler i slutet av odlingsperioden. Med hjälp ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Islet Abnormalities and Function with a Pseudoislet Protocol at JoVE.com

Detta protokoll beskriver en metod för synkron insamling och samregistrering av intracellulära signaleringshändelser och utsöndring av insulin och glukagon av primära humana pseudoöar med hjälp av adenoviral tillförsel av en cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP) biosensor, en cAMP-differensdetektor in situ (cADDis) och ett mikroperifusionssystem.

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

Vårt labb arbetar för att förstå, förebygga och vända betacellsdysfunktion och andra ögonlocksavvikelser vid typ 1- och typ två-diabetes. Våra studier fokuserar på patogenesen av human diabetes genom att integrera studier av bukspottkörtelns och ögonlockens biologi samt hälsa och sjukdom. Mänskliga öljetter är sfäriska 3D-strukturer, och att komma åt celler i hela öljetten innebär vissa experimentella utmaningar.Till exempel, när vi försöker introducera biosensorer för att förstå ögonhålscellsignalering, övervinner vårt pseudoögonlocksprotokoll denna utmaning genom att utföra genetiska manipulationer i encellstillståndet och aggregera dessa transducerade mänskliga öljettceller till pseudoögonlock för nedströmsstudier. Vårt pseudoögonlockssystem gör det möjligt för oss att uttrycka biosensorer i hela öljetten, snarare än bara ögonlocksytan. I kombination med vår levande cellavbildning och mikroperfusionssystem kan vi både mäta och samregistrera dynamiska intracellulära processer med nedströms hormonutsöndring.Detta protokoll kan användas för att besvara en rad viktiga vetenskapliga frågor. Till exempel kan strategier för nedtystning av gener kombineras med detta tillvägagångssätt för att förstå effekten av en gen av intresse på ögonlocksfunktionen och tillhörande signalvägar, antingen globalt eller på ett självspecifikt sätt.