Name: Autor im Rampenlicht: Effiziente CRISPR/Cas9-Genomeditierung in Makrophagen aus dem Knochenmark für präzisen Genaufschluss
Uploaded: 2023-08-04T14:50:00
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Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium 5R01AI144149 finanziert. Die schematischen Abbildungen wurden mit BioRender erstellt.

1. sgRNA-Design
HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Auswahl der Zielsequenzen und das Design der sgRNAs. Es ist hilfreich, Leitfäden zu entwerfen, die sich im ersten großen kodierenden Exon befinden, so dass jedes translatierte Protein früh im offenen Leserahmen gestört wird. Es ist auch hilfreich, Zielsequenzen auszuwählen, die innerhalb desselben Exons liegen, da dies die Analyse der Bearbeitungseffizienz rationalisiert (Schritt 6). Die Beispiele für Genom-Editierung,...

Ein Leitfaden für den präzisen Genaufschluss in primären Makrophagen aus dem Knochenmark

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis,+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis, and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. 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W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells.">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, e00471 (2013).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Craft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+primary+murine+bone+marrow-derived+macrophages.">CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages.</a> University of California, Davis. , (2022).</li><li>Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Kr&#246;nke, M., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+primary+macrophages+with+in+vitro+transcribed+mRNA.">Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+delivery+of+Cas9+protein/gRNA+complexes+using+lipofectamine+CRISPRMAX.">Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX.</a> Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).</li></ol>

Die Genom-Editierung mit elektroporierten Cas9-sgRNA-Komplexen ermöglicht eine effektive Störung der Genfunktion in BMDMs. Die Editiereffizienz variiert je nach Zielsequenz und Gen. In der Regel werden vier bis fünf sgRNAs gescreent, um eine hochaktive zu identifizieren. Einige Loci weisen eine geringere Editiereffizienz auf, was höchstwahrscheinlich auf die Chromatinstruktur zurückzuführen ist. In diesen Fällen können mehrere Änderungen vorgenommen werden, um die Bearbeitungseffizienz zu erhöhen. Die gleichzei...

Makrophagen sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die eine entscheidende Rolle bei der Gewebereparatur und Immunität spielen 1,2. Immortalisierte Makrophagen-Zelllinien, wie z. B. RAW 264.7-Zellen der Maus oder menschliche THP-1-Zellen, haben mehrere vorteilhafte Eigenschaften, darunter robustes Wachstum und einfache Genstörung durch die Bereitstellung von Vektoren für RNA-Interferenz oder CRISPR/Cas9 3,4. Die onkogene Transformation verändert jedoch dramatisch ihre Physiologie, was zu einer abnormen Aktivierung einiger Signalwege und zu gedämpften Reaktionen anderer führt 5,6. Primäre aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMDMs) rekapitulieren die Physiologie der Makrophagen in vivo genauer, sind aber aufgrund der geringen Effizienz sowohl der Plasmidtransfektion als auch der viralen Transduktion in diesen primären Immunzellen nach wie vor schwierig genetisch zu manipulieren 7,8. Daher werden effizientere Methoden zur Störung der Genfunktion benötigt.
Die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur genetischen Manipulation in einer Reihe biologischer Systeme, einschließlich Säugetierzellen 9,10,11,12. Das Cas9-Protein von Streptococcus pyogenes spaltet effizient und spezifisch doppelsträngige DNA, wenn es mit einer sequenzspezifischen Leit-RNA komplexiert wird. Die DNA-Reparatur durch die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) der gespaltenen DNA führt zu kleinen Insertionen oder Deletionen (Indels), die Frameshift-Mutationen erzeugen. In frühen Studien wurden Cas9 und sgRNAs über Plasmid- oder lentivirale Vektoren verabreicht, die für viele Zelllinien effektive Verabreichungsmethoden darstellen 9,10. Primärzellen und insbesondere primäre Immunzellen sind jedoch aufgrund der geringen Effizienz der Vektorverabreichung durch Transfektion oder Transduktion oft refraktär gegenüber diesen Methoden. In der Folge wurden Methoden entwickelt, um sgRNA-Cas9-Komplexe in vitro zu erzeugen und über Elektroporation zu verabreichen, und diese Methoden haben in einer Vielzahl von Zelltypen eine hohe Effizienz erreicht13,14. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Ansatz für die Genom-Editierung in primären Makrophagen verwendet werden kann.
Hier stellen wir ein Protokoll für die Verwendung von sgRNA-Cas9-Ribonukleoproteinkomplexen (RNPs) zur Durchführung von Genom-Editierung in primären BMDMs zur Verfügung. Es enthält Schritte, um die Aktivierung der in primären Immunzellen vorhandenen Immunsensoren zu mildern, und führt zu einer bis zu 95%igen Editierung an Zielorten mit minimaler Toxizität. Dieses Protokoll umfasst auch Arbeitsabläufe zur Bewertung der Bearbeitungseffizienz mithilfe der routinemäßigen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und der Sanger-Sequenzierung, gefolgt von der In-silico-Analyse durch Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, ein gut validiertes Online-Software-Tool.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-MCSF Cell Line</td>
			<td>Gift from Russell Vance</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP Reagent Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0525S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS -Ca/Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase DNA polymerase &#38; buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind conical tubes 15 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind Eppendorf tubes 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer r2.1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK5000, MPP100, MPS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 uL Tips</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK1025 or MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + 1mM EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02017F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer for ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS</td>
			<td>University of California Macro Lab</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>Available to non-UC investigators through&#160; https://qb3.berkeley.edu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency gene disruption in primary bone marrow-derived macrophages using electroporated cas9-sgrna complexes

Aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen (BMDMs) von Mäusen sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der komplexen Biologie von Gewebemakrophagen. Als Primärzellen modellieren sie die Physiologie von Makrophagen in vivo genauer als immortalisierte Makrophagen-Zelllinien und können von Mäusen abgeleitet werden, die bereits definierte genetische Veränderungen tragen. Die Störung der Genfunktion in BMDMs ist jedoch nach wie vor eine technische Herausforderung. Hier stellen wir ein Protokoll für die effiziente CRISPR/Cas9-Genom-Editierung in BMDMs zur Verfügung, das die Einführung kleiner Insertionen und Deletionen (Indels) ermöglicht, die zu Frameshift-Mutationen führen, die die Genfunktion stören. Das Protokoll beschreibt, wie Single-Guide-RNAs (sgRNA-Cas9) synthetisiert und gereinigte sgRNA-Cas9-Ribonukleoproteinkomplexe (RNPs) gebildet werden, die durch Elektroporation verabreicht werden können. Es bietet auch eine effiziente Methode zur Überwachung der Bearbeitungseffizienz mithilfe der routinemäßigen Sanger-Sequenzierung und eines frei verfügbaren Online-Analyseprogramms. Das Protokoll kann innerhalb von 1 Woche durchgeführt werden und erfordert keine Plasmidkonstruktion; Dies führt in der Regel zu einer Bearbeitungseffizienz von 85 % bis 95 %.

Macrophages are innate immune cells that play critical roles in tissue repair and immunity1,2. Immortalized macrophage cell lines, such as mouse RAW 264.7 cells or human THP-1 cells, have several beneficial characteristics, including robust growth and ease of gene disruption by delivering vectors for RNA interference or CRISPR/Cas93,4. However, oncogenic transformation dramatically alters their physiology, which results in the aberrant activation of some pathways and muted responses of others5,6. Primary bone marrow-derived macrophages (BMDMs) more closely recapitulate in vivo macrophage physiology, but remain challenging to genetically manipulate due to the low efficiency of both plasmid transfection and viral transduction in these primary immune cells7,8. Thus, more efficient methods for disrupting gene function are needed.
CRISPR/Cas9 genome editing is a powerful tool for genetic manipulation across a range of biological systems, including mammalian cells9,10,11,12. The Streptococcus pyogenes Cas9 protein efficiently and specifically cleaves double-stranded DNA when complexed with a sequence-specific guide RNA. DNA repair through the non-homologous end joining (NHEJ) of the cleaved DNA results in small insertions or deletions (indels) that create frameshift mutations. In early studies, Cas9 and sgRNAs were delivered through plasmid or lentiviral vectors, which are effective delivery methods for many cell lines9,10. However, primary cells and, in particular, primary immune cells are often refractory to these methods due to the low efficiency of vector delivery by transfection or transduction. Subsequently, methods have been developed to generate sgRNA-Cas9 complexes in vitro and to deliver them via electroporation, and these methods have achieved high efficiency in a variety of cell types13,14. The results have suggested the possibility of using this approach to carry out genome editing in primary macrophages.
Here, we provide a protocol for using sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) to carry out genome editing in primary BMDMs. It contains steps to mitigate the activation of the immune sensors present in primary immune cells and results in up to 95% editing at targeted loci with minimal toxicity. This protocol also includes workflows to evaluate editing efficiency using routine polymerase chain reaction (PCR) and Sanger sequencing, followed by in silico analysis by Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, a well-validated online software tool.

Autor im Rampenlicht: Effiziente CRISPR/Cas9-Genomeditierung in Makrophagen aus dem Knochenmark für präzisen Genaufschluss

Hocheffiziente Genzerstörung in primären Makrophagen aus dem Knochenmark unter Verwendung elektroporierter Cas9-sgRNA-Komplexe

Our laboratory studies the interaction between mycobacterium, tuberculosis and the host immune system, with a focus on the initial interaction between the bacterium and the macrophage. There's a variety of gene-disruption techniques used in macrophages, including RNAi technologies and CRISPR technologies. One of the major challenges is the low efficiency of gene disruption in macrophages.This protocol enables the rapid and high-efficiency genetic manipulation of primary macrophages without the need for cloning and plasmid construction. These methods should be broadly applicable in immunology, enabling researchers to disrupt genes in primary macrophages for a wide array of studies.

Bei der IVT-Vorlage handelt es sich um ein 127-bp-PCR-Produkt (Abbildung 1B). Das IVT-Produkt in voller Länge ist eine 98 nt RNA, die ähnlich wie ein 70 bp langes doppelsträngiges DNA-Fragment migriert (Abbildung 1C).
Nach der Elektroporation sollten die Zellen zu >90 % lebensfähig sein, mit einer Gesamtzellzahl von >70 % der Ausgangszellzahl. Der resultierende Pool mutierter Zellen sollte eine Vielzahl von Indels aufweisen, begin...

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Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Genom-Editierung in aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Makrophagen unter Verwendung von Cas9-sgRNA-Ribonukleoproteinkomplexen, die in vitro zusammengesetzt und durch Elektroporation verabreicht werden.

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

Unser Labor untersucht die Interaktion zwischen Mykobakterium, Tuberkulose und dem Immunsystem des Wirts, wobei der Schwerpunkt auf der anfänglichen Interaktion zwischen dem Bakterium und dem Makrophagen liegt. Es gibt eine Vielzahl von Genaufschlusstechniken, die in Makrophagen verwendet werden, darunter RNAi-Technologien und CRISPR-Technologien. Eine der größten Herausforderungen ist die geringe Effizienz der Genstörung in Makrophagen.Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle und hocheffiziente genetische Manipulation von primären Makrophagen, ohne dass Klonierung und Plasmidkonstruktion erforderlich sind. Diese Methoden sollten in der Immunologie breit anwendbar sein und es Forschern ermöglichen, Gene in primären Makrophagen für eine Vielzahl von Studien zu zerstören.

high-efficiency-gene-disruption-primary-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Genetics

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the physiology of macrophages in vivo more closely than immortalized macrophage cell lines and can be derived from mice already carrying defined genetic changes. However, disrupting gene function in BMDMs remains technically challenging. Here, we provide a protocol for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in BMDMs, which allows for the introduction of small insertions and deletions (indels) that result in frameshift mutations that disrupt gene function. The protocol describes how to synthesize single-guide RNAs (sgRNA-Cas9) and form purified sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) that can be delivered by electroporation. It also provides an efficient method for monitoring editing efficiency using routine Sanger sequencing and a freely available online analysis program. The protocol can be performed within 1 week and does not require plasmid construction; it typically results in 85% to 95% editing efficiency.

This protocol describes the procedure for genome editing in mouse bone marrow-derived macrophages using Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes assembled in vitro and delivered by electroporation.

Forschung

Genetik

Preparation for Electroporation and Ribonucleoprotein Delivery for Genome Editing in Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages

To begin, set the parameters of the pipette station placed in the laminar flow hood to 1, 900 volts, 20 milliseconds in one pulse. Carefully remove a transfection tube from the package to keep it sterile and fill it with three milliliters of E buffer. To prepare the cells for electroporation, remove the growth medium from the cells and wash them using PBS to remove the serum and divalent cations that promote adhesion.Then add a mixture of PBS and one millimolar EDTA to the cells and incubate at room temperature for about five minutes until the cells begin to detach. Pipette up and down gently to detach the cells and transfer the cells to a low protein binding 15 milliliter tube. Pellet the cells at 500 G for five minutes.After centrifugation quickly remove most of the supernatant, leaving about one milliliter of the supernatant in the tube. Resuspend the cells in the remaining supernatant and transfer it to a low protein binding 1.5 milliliter microfuge tube. Remove a small aliquot of cells to count and pellet the remaining cells by centrifusion at 500 G at room temperature for five minutes.Count the cells during centrifugation. Take 1x sgRNA in 20 millimolar Cas9 solution and warm the tubes to room temperature. After centrifugation, remove all the supernatant from the cell pellet and resuspend the cells in PBS with calcium chloride and magnesium chloride at a concentration of 40 million cells per milliliter.For the sgRNA Cas9 ribonucleoprotein complex assembly, add 2.5 microliters of sgRNA to one microliter of the diluted Cas9 in sterilized PCR tubes and dispense the sgRNA slowly with mixing for about 15 seconds to prevent precipitation. Incubate for five minutes at room temperature to allow the ribonucleoprotein complex formation. To deliver the ribonucleoprotein complex by electroporation, prepare the electroporation tip by depressing the plunger to extend the stem.Then insert the stem into the tip. Resuspend the cells by pipetting up and down. Load the electroporation tip with the cells and withdraw the full 10 microliters volume capacity of the tip.Starting with the negative control sgRNA, transfer 10 microliters of cells in the electroporation tip to the sample tube containing 3.5 microliters of ribonucleoprotein. Pipette up and down three times to mix well, and draw 10 microliters of the mixture back into the tip. Place the tip into the electroporation station, lowering it into the buffer, and push Start on the touchscreen display.After completion, the display will indicate a successful pulse. Remove the pipette from the device and place the cells in a dry well of the uncoated 12 well plate. Rinse the tip by pipetting up and down twice in 15 milliliters of PBS with calcium chloride and magnesium chloride.Set aside the pipette with the tip still attached. Immediately add one milliliter of the antibiotic free medium aliquoted earlier to the cells and gently shake the plate to mix. The representative Sanger sequencing chromatogram of the Rosa 26 locus from the bone marrow derived macrophages electroporated with a controlled non-targeting sgRNA Cas9 ribonucleoprotein, Rosa 26 specific sgRNA, and Src and Cblb genes in the edited macrophages are shown here.The analysis of the targeted genes by PCR and Sanger sequencing shows multiple nucleotides at each position downstream of the Cas9 cleavage site. These results validate the attainment of a high editing efficiency for multiple targeted genes.

Vorbereitung für die Elektroporation und die Verabreichung von Ribonukleoproteinen für die Genom-Editierung in Makrophagen aus dem Knochenmark von Mäusen