Name: लेखक स्पॉटलाइट: सटीक जीन व्यवधान के लिए अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में कुशल CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन
Uploaded: 2023-08-04T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient CRISPR/Cas9 Genome Editing in Bone Marrow-Derived Macrophages for Precise Gene Disruption at JoVE.com

इस काम को एनआईएच अनुदान 5R01AI144149 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। योजनाबद्ध आंकड़े BioRender के साथ बनाए गए थे।

1. एसजीआरएनए डिजाइन
नोट: यह चरण एसजीआरएनए के लक्ष्य अनुक्रमों और डिजाइन के चयन का वर्णन करता है। यह उन गाइडों को डिजाइन करने में मददगार है जो पहले बड़े कोडिंग एक्सॉन में हैं, ताकि किसी भी ?...

प्राथमिक अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में सटीक जीन व्यवधान के लिए एक गाइड

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis,+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis, and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+gene+expression+by+RNAi+in+mammalian+cells.">Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).</li><li>Laugel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+isogenic+cells+deficient+for+MR1+with+a+CRISPR/Cas9+lentiviral+system:+Tools+to+study+microbial+antigen+processing+and+presentation+to+human+MR1-restricted+T+cells.">Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells.</a> The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+macrophages+and+J774+cells+respond+differently+to+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis.">Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> Scientific Reports. 7, 42225 (2017).</li><li>Roberts, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9++conditionally-immortalized+macrophages+as+a+tool+for+bacterial+pathogenesis+and+beyond.">Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond.</a> eLife. 8, e45957 (2019).</li><li>Oberdoerffer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+RNA+interference+in+the+mouse+hematopoietic+system+varies+between+cell+types+and+developmental+stages.">Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YTHDF2+orchestrates+tumor-associated+macrophage+reprogramming+and+controls+antitumor+immunity+through+CD8++T+cells.">YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells.">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, e00471 (2013).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Craft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+primary+murine+bone+marrow-derived+macrophages.">CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages.</a> University of California, Davis. , (2022).</li><li>Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Kr&#246;nke, M., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+primary+macrophages+with+in+vitro+transcribed+mRNA.">Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+delivery+of+Cas9+protein/gRNA+complexes+using+lipofectamine+CRISPRMAX.">Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX.</a> Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).</li></ol>

इलेक्ट्रोपोरेटेड Cas9-sgRNA परिसरों का उपयोग करके जीनोम संपादन BMDMs में जीन फ़ंक्शन के प्रभावी व्यवधान की अनुमति देता है। संपादन दक्षता लक्ष्य अनुक्रम और जीन द्वारा भिन्न होती है। आमतौर पर, चार से पांच एसजीआ?...

मैक्रोफेज जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं जो ऊतक की मरम्मत और प्रतिरक्षा 1,2 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। अमर मैक्रोफेज सेल लाइनें, जैसे कि माउस रॉ 264.7 कोशिकाएं या मानव टीएचपी-1 कोशिकाएं, में कई लाभकारी विशेषताएं हैं, जिनमें आरएनए हस्तक्षेप या सीआरआईएसपीआर/कैस 9 3,4 के लिए वैक्टर वितरित करके मजबूत विकास और जीन व्यवधान में आसानी शामिल है। हालांकि, ऑन्कोजेनिक परिवर्तन नाटकीय रूप से उनके शरीर विज्ञान को बदल देता है, जिसके परिणामस्वरूप कुछ मार्गों की असामान्य सक्रियता और दूसरों की मौन प्रतिक्रियाएं 5,6 हो जाती हैं। प्राथमिक अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) अधिक बारीकी से विवो मैक्रोफेज शरीर क्रिया विज्ञान में recapitulate, लेकिन इन प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं 7,8 में प्लाज्मिड अभिकर्मक और वायरल पारगमन दोनों की कम दक्षता के कारण आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए चुनौतीपूर्ण रहते हैं. इस प्रकार, जीन फ़ंक्शन को बाधित करने के लिए अधिक कुशल तरीकों की आवश्यकता है।
CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन स्तनधारी कोशिकाओं 9,10,11,12सहित जैविक प्रणालियों की एक श्रृंखला में आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेनेस कैस 9 प्रोटीन कुशलतापूर्वक और विशेष रूप से अनुक्रम-विशिष्ट गाइड आरएनए के साथ जटिल होने पर डबल-फंसे डीएनए को साफ करता है। क्लीव्ड डीएनए के गैर-होमोलॉगस एंड जॉइनिंग (NHEJ) के माध्यम से डीएनए की मरम्मत के परिणामस्वरूप छोटे सम्मिलन या विलोपन (इंडल्स) होते हैं जो फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन बनाते हैं। प्रारंभिक अध्ययनों में, Cas9 और sgRNAs प्लास्मिड या lentiviral वैक्टर, जो कई सेल लाइनों 9,10 के लिए प्रभावी वितरण विधियां हैं के माध्यम से वितरित किए गए थे. हालांकि, प्राथमिक कोशिकाओं और, विशेष रूप से, प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं अक्सर अभिकर्मक या पारगमन द्वारा वेक्टर वितरण की कम दक्षता के कारण इन तरीकों के लिए दुर्दम्य हैं. इसके बाद, तरीकों इन विट्रो में sgRNA-Cas9 परिसरों उत्पन्न करने के लिए और उन्हें electroporation के माध्यम से वितरित करने के लिए विकसित किया गया है, और इन तरीकों सेल प्रकार13,14 की एक किस्म में उच्च दक्षता हासिल की है. परिणामों ने प्राथमिक मैक्रोफेज में जीनोम संपादन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने की संभावना का सुझाव दिया है।
यहां, हम प्राथमिक बीएमडीएम में जीनोम संपादन करने के लिए एसजीआरएनए-कैस 9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स (आरएनपी) का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसमें प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं में मौजूद प्रतिरक्षा सेंसर की सक्रियता को कम करने के लिए कदम होते हैं और न्यूनतम विषाक्तता के साथ लक्षित लोकी पर 95% संपादन होता है। इस प्रोटोकॉल में नियमित पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और सेंगर अनुक्रमण का उपयोग करके संपादन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए वर्कफ़्लो भी शामिल हैं, इसके बाद ट्रैकिंग ऑफ इंडल्स बाय डिकंपोजिशन (टीआईडीई)15, एक अच्छी तरह से मान्य ऑनलाइन सॉफ्टवेयर टूल द्वारा सिलिको विश्लेषण किया जाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-MCSF Cell Line</td>
			<td>Gift from Russell Vance</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP Reagent Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0525S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS -Ca/Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase DNA polymerase &#38; buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind conical tubes 15 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind Eppendorf tubes 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer r2.1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK5000, MPP100, MPS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 uL Tips</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK1025 or MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + 1mM EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02017F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer for ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS</td>
			<td>University of California Macro Lab</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>Available to non-UC investigators through&#160; https://qb3.berkeley.edu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency gene disruption in primary bone marrow-derived macrophages using electroporated cas9-sgrna complexes

चूहों से अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) ऊतक मैक्रोफेज के जटिल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। प्राथमिक कोशिकाओं के रूप में, वे अमर मैक्रोफेज सेल लाइनों की तुलना में विवो में मैक्रोफेज के शरीर विज्ञान को अधिक बारीकी से मॉडल करते हैं और पहले से ही परिभाषित आनुवंशिक परिवर्तनों को ले जाने वाले चूहों से प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, बीएमडीएम में जीन फ़ंक्शन को बाधित करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। यहां, हम बीएमडीएम में कुशल सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 जीनोम संपादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो छोटे सम्मिलन और विलोपन (इंडल्स) की शुरूआत की अनुमति देता है जिसके परिणामस्वरूप फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन होते हैं जो जीन फ़ंक्शन को बाधित करते हैं। प्रोटोकॉल बताता है कि सिंगल-गाइड RNAs (sgRNA-Cas9) को कैसे संश्लेषित किया जाए और शुद्ध sgRNA-Cas9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स (RNPs) बनाया जाए जिसे इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा वितरित किया जा सके। यह नियमित सेंगर अनुक्रमण और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऑनलाइन विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करके संपादन दक्षता की निगरानी के लिए एक कुशल तरीका भी प्रदान करता है। प्रोटोकॉल 1 सप्ताह के भीतर किया जा सकता है और प्लास्मिड निर्माण की आवश्यकता नहीं है; यह आमतौर पर 85% से 95% संपादन दक्षता में परिणत होता है।

Macrophages are innate immune cells that play critical roles in tissue repair and immunity1,2. Immortalized macrophage cell lines, such as mouse RAW 264.7 cells or human THP-1 cells, have several beneficial characteristics, including robust growth and ease of gene disruption by delivering vectors for RNA interference or CRISPR/Cas93,4. However, oncogenic transformation dramatically alters their physiology, which results in the aberrant activation of some pathways and muted responses of others5,6. Primary bone marrow-derived macrophages (BMDMs) more closely recapitulate in vivo macrophage physiology, but remain challenging to genetically manipulate due to the low efficiency of both plasmid transfection and viral transduction in these primary immune cells7,8. Thus, more efficient methods for disrupting gene function are needed.
CRISPR/Cas9 genome editing is a powerful tool for genetic manipulation across a range of biological systems, including mammalian cells9,10,11,12. The Streptococcus pyogenes Cas9 protein efficiently and specifically cleaves double-stranded DNA when complexed with a sequence-specific guide RNA. DNA repair through the non-homologous end joining (NHEJ) of the cleaved DNA results in small insertions or deletions (indels) that create frameshift mutations. In early studies, Cas9 and sgRNAs were delivered through plasmid or lentiviral vectors, which are effective delivery methods for many cell lines9,10. However, primary cells and, in particular, primary immune cells are often refractory to these methods due to the low efficiency of vector delivery by transfection or transduction. Subsequently, methods have been developed to generate sgRNA-Cas9 complexes in vitro and to deliver them via electroporation, and these methods have achieved high efficiency in a variety of cell types13,14. The results have suggested the possibility of using this approach to carry out genome editing in primary macrophages.
Here, we provide a protocol for using sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) to carry out genome editing in primary BMDMs. It contains steps to mitigate the activation of the immune sensors present in primary immune cells and results in up to 95% editing at targeted loci with minimal toxicity. This protocol also includes workflows to evaluate editing efficiency using routine polymerase chain reaction (PCR) and Sanger sequencing, followed by in silico analysis by Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, a well-validated online software tool.

लेखक स्पॉटलाइट: सटीक जीन व्यवधान के लिए अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में कुशल CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन

इलेक्ट्रोपोरेटेड Cas9-sgRNA परिसरों का उपयोग करके प्राथमिक अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में उच्च दक्षता जीन व्यवधान

Our laboratory studies the interaction between mycobacterium, tuberculosis and the host immune system, with a focus on the initial interaction between the bacterium and the macrophage. There's a variety of gene-disruption techniques used in macrophages, including RNAi technologies and CRISPR technologies. One of the major challenges is the low efficiency of gene disruption in macrophages.This protocol enables the rapid and high-efficiency genetic manipulation of primary macrophages without the need for cloning and plasmid construction. These methods should be broadly applicable in immunology, enabling researchers to disrupt genes in primary macrophages for a wide array of studies.

आईवीटी टेम्पलेट एक 127 बीपी पीसीआर उत्पाद (चित्रा 1 बी) है। पूर्ण लंबाई आईवीटी उत्पाद एक 98 एनटी आरएनए है, जो 70 बीपी डबल-फंसे डीएनए टुकड़े(चित्रा 1सी)के समान माइग्रेट करता है।
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Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient CRISPR/Cas9 Genome Editing in Bone Marrow-Derived Macrophages for Precise Gene Disruption at JoVE.com

यह प्रोटोकॉल माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज में जीनोम संपादन के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है Cas9-sgRNA राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन परिसरों इन विट्रो में इकट्ठे और electroporation द्वारा वितरित.

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

हमारी प्रयोगशाला माइकोबैक्टीरियम, तपेदिक और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच बातचीत का अध्ययन करती है, जिसमें जीवाणु और मैक्रोफेज के बीच प्रारंभिक बातचीत पर ध्यान केंद्रित किया जाता है। मैक्रोफेज में उपयोग की जाने वाली विभिन्न प्रकार की जीन-व्यवधान तकनीकें हैं, जिनमें आरएनएआई प्रौद्योगिकियां और सीआरआईएसपीआर प्रौद्योगिकियां शामिल हैं। प्रमुख चुनौतियों में से एक मैक्रोफेज में जीन व्यवधान की कम दक्षता है।यह प्रोटोकॉल क्लोनिंग और प्लास्मिड निर्माण की आवश्यकता के बिना प्राथमिक मैक्रोफेज के तेजी से और उच्च दक्षता वाले आनुवंशिक हेरफेर को सक्षम बनाता है। इन विधियों को इम्यूनोलॉजी में मोटे तौर पर लागू किया जाना चाहिए, जिससे शोधकर्ताओं को अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्राथमिक मैक्रोफेज में जीन को बाधित करने में सक्षम बनाया जा सके।

high-efficiency-gene-disruption-primary-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Genetics

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the physiology of macrophages in vivo more closely than immortalized macrophage cell lines and can be derived from mice already carrying defined genetic changes. However, disrupting gene function in BMDMs remains technically challenging. Here, we provide a protocol for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in BMDMs, which allows for the introduction of small insertions and deletions (indels) that result in frameshift mutations that disrupt gene function. The protocol describes how to synthesize single-guide RNAs (sgRNA-Cas9) and form purified sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) that can be delivered by electroporation. It also provides an efficient method for monitoring editing efficiency using routine Sanger sequencing and a freely available online analysis program. The protocol can be performed within 1 week and does not require plasmid construction; it typically results in 85% to 95% editing efficiency.

This protocol describes the procedure for genome editing in mouse bone marrow-derived macrophages using Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes assembled in vitro and delivered by electroporation.

Preparation for Electroporation and Ribonucleoprotein Delivery for Genome Editing in Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages

To begin, set the parameters of the pipette station placed in the laminar flow hood to 1, 900 volts, 20 milliseconds in one pulse. Carefully remove a transfection tube from the package to keep it sterile and fill it with three milliliters of E buffer. To prepare the cells for electroporation, remove the growth medium from the cells and wash them using PBS to remove the serum and divalent cations that promote adhesion.Then add a mixture of PBS and one millimolar EDTA to the cells and incubate at room temperature for about five minutes until the cells begin to detach. Pipette up and down gently to detach the cells and transfer the cells to a low protein binding 15 milliliter tube. Pellet the cells at 500 G for five minutes.After centrifugation quickly remove most of the supernatant, leaving about one milliliter of the supernatant in the tube. Resuspend the cells in the remaining supernatant and transfer it to a low protein binding 1.5 milliliter microfuge tube. Remove a small aliquot of cells to count and pellet the remaining cells by centrifusion at 500 G at room temperature for five minutes.Count the cells during centrifugation. Take 1x sgRNA in 20 millimolar Cas9 solution and warm the tubes to room temperature. After centrifugation, remove all the supernatant from the cell pellet and resuspend the cells in PBS with calcium chloride and magnesium chloride at a concentration of 40 million cells per milliliter.For the sgRNA Cas9 ribonucleoprotein complex assembly, add 2.5 microliters of sgRNA to one microliter of the diluted Cas9 in sterilized PCR tubes and dispense the sgRNA slowly with mixing for about 15 seconds to prevent precipitation. Incubate for five minutes at room temperature to allow the ribonucleoprotein complex formation. To deliver the ribonucleoprotein complex by electroporation, prepare the electroporation tip by depressing the plunger to extend the stem.Then insert the stem into the tip. Resuspend the cells by pipetting up and down. Load the electroporation tip with the cells and withdraw the full 10 microliters volume capacity of the tip.Starting with the negative control sgRNA, transfer 10 microliters of cells in the electroporation tip to the sample tube containing 3.5 microliters of ribonucleoprotein. Pipette up and down three times to mix well, and draw 10 microliters of the mixture back into the tip. Place the tip into the electroporation station, lowering it into the buffer, and push Start on the touchscreen display.After completion, the display will indicate a successful pulse. Remove the pipette from the device and place the cells in a dry well of the uncoated 12 well plate. Rinse the tip by pipetting up and down twice in 15 milliliters of PBS with calcium chloride and magnesium chloride.Set aside the pipette with the tip still attached. Immediately add one milliliter of the antibiotic free medium aliquoted earlier to the cells and gently shake the plate to mix. The representative Sanger sequencing chromatogram of the Rosa 26 locus from the bone marrow derived macrophages electroporated with a controlled non-targeting sgRNA Cas9 ribonucleoprotein, Rosa 26 specific sgRNA, and Src and Cblb genes in the edited macrophages are shown here.The analysis of the targeted genes by PCR and Sanger sequencing shows multiple nucleotides at each position downstream of the Cas9 cleavage site. These results validate the attainment of a high editing efficiency for multiple targeted genes.