Name: Yazar Spotlight: Hassas Gen Bozulması için Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Verimli CRISPR/Cas9 Genom Düzenleme
Uploaded: 2023-08-04T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient CRISPR/Cas9 Genome Editing in Bone Marrow-Derived Macrophages for Precise Gene Disruption at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibesi 5R01AI144149 tarafından finanse edilmiştir. Şematik şekiller BioRender ile oluşturulmuştur.

1. sgRNA tasarımı
NOT: Bu adım, hedef dizilerin seçimini ve sgRNA'ların tasarımını açıklar. İlk büyük kodlama ekzonunda bulunan kılavuzları tasarlamak yararlıdır, böylece çevrilmiş herhangi bir protein açık okuma çerçevesinin başlarında bozulur. Aynı ekzon içinde yer alan hedef dizileri seçmek de yararlıdır, çünkü bu, düzenleme verimliliğinin analizini kolaylaştıracaktır (6. adım). Bu protokolle sağlanan genom düzenleme örnekleri, S...

Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Kesin Gen Bozulması İçin Bir Kılavuz

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis,+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis, and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+gene+expression+by+RNAi+in+mammalian+cells.">Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).</li><li>Laugel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+isogenic+cells+deficient+for+MR1+with+a+CRISPR/Cas9+lentiviral+system:+Tools+to+study+microbial+antigen+processing+and+presentation+to+human+MR1-restricted+T+cells.">Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells.</a> The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+macrophages+and+J774+cells+respond+differently+to+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis.">Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> Scientific Reports. 7, 42225 (2017).</li><li>Roberts, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9++conditionally-immortalized+macrophages+as+a+tool+for+bacterial+pathogenesis+and+beyond.">Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond.</a> eLife. 8, e45957 (2019).</li><li>Oberdoerffer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+RNA+interference+in+the+mouse+hematopoietic+system+varies+between+cell+types+and+developmental+stages.">Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YTHDF2+orchestrates+tumor-associated+macrophage+reprogramming+and+controls+antitumor+immunity+through+CD8++T+cells.">YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells.">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, e00471 (2013).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Craft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+primary+murine+bone+marrow-derived+macrophages.">CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages.</a> University of California, Davis. , (2022).</li><li>Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Kr&#246;nke, M., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+primary+macrophages+with+in+vitro+transcribed+mRNA.">Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+delivery+of+Cas9+protein/gRNA+complexes+using+lipofectamine+CRISPRMAX.">Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX.</a> Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).</li></ol>

Elektroporasyonlu Cas9-sgRNA kompleksleri kullanılarak genom düzenleme, BMDM'lerde gen fonksiyonunun etkili bir şekilde bozulmasına izin verir. Düzenleme verimliliği, hedef diziye ve gene göre değişir. Tipik olarak, dört ila beş sgRNA, oldukça aktif olanı belirlemek için genellikle taranır. Bazı lokuslar, büyük olasılıkla kromatin yapısı nedeniyle daha düşük düzenleme verimliliğine sahiptir. Bu durumlarda, düzenleme verimliliğini artırmak için çeşitli değişiklikler yapılabilir. İki ak...

Makrofajlar, doku onarımı ve bağışıklıktakritik rol oynayan doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir 1,2. Fare RAW 264.7 hücreleri veya insan THP-1 hücreleri gibi ölümsüzleştirilmiş makrofaj hücre hatları, RNA girişimi veya CRISPR/Cas9 3,4 için vektörler sağlayarak sağlam büyüme ve gen bozulması kolaylığı dahil olmak üzere çeşitli faydalı özelliklere sahiptir. Bununla birlikte, onkojenik transformasyon fizyolojilerini önemli ölçüde değiştirir, bu da bazı yolların anormal aktivasyonuna ve diğerlerinin sessiz tepkilerine neden olur 5,6. Primer kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM'ler) in vivo makrofaj fizyolojisini daha yakından özetler, ancak bu primer immün hücrelerde hem plazmit transfeksiyonunun hem de viral transdüksiyonun düşük etkinliği nedeniyle genetik olarak manipüle edilmesi zor olmaya devam etmektedir 7,8. Bu nedenle, gen fonksiyonunu bozmak için daha verimli yöntemlere ihtiyaç vardır.
CRISPR/Cas9 genom düzenleme, memeli hücreleri 9,10,11,12 dahil olmak üzere bir dizi biyolojik sistemde genetik manipülasyon için güçlü bir araçtır. Streptococcus pyogenes Cas9 proteini, diziye özgü bir kılavuz RNA ile kompleks haline getirildiğinde çift sarmallı DNA'yı verimli ve spesifik olarak parçalar. Bölünmüş DNA'nın homolog olmayan uç birleşmesi (NHEJ) yoluyla DNA onarımı, çerçeve kayması mutasyonları oluşturan küçük eklemeler veya delesyonlar (indels) ile sonuçlanır. Erken çalışmalarda, Cas9 ve sgRNA'lar, birçok hücre hattı için etkili dağıtım yöntemleri olan plazmit veya lentiviral vektörler yoluyla verildi 9,10. Bununla birlikte, birincil hücreler ve özellikle birincil bağışıklık hücreleri, transfeksiyon veya transdüksiyon yoluyla vektör iletiminin düşük verimliliği nedeniyle genellikle bu yöntemlere dirençlidir. Daha sonra, in vitro olarak sgRNA-Cas9 kompleksleri oluşturmak ve bunları elektroporasyon yoluyla vermek için yöntemler geliştirilmiş ve bu yöntemler çeşitli hücre tiplerinde yüksek verimlilik sağlamıştır13,14. Sonuçlar, primer makrofajlarda genom düzenlemesi yapmak için bu yaklaşımı kullanma olasılığını ortaya koymuştur.
Burada, birincil BMDM'lerde genom düzenlemesi yapmak için sgRNA-Cas9 ribonükleoprotein komplekslerini (RNP'ler) kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Birincil bağışıklık hücrelerinde bulunan bağışıklık sensörlerinin aktivasyonunu azaltmak için adımlar içerir ve minimum toksisite ile hedeflenen lokuslarda %95'e kadar düzenleme ile sonuçlanır. Bu protokol aynı zamanda rutin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve Sanger dizilemesi kullanarak düzenleme verimliliğini değerlendirmek için iş akışlarını ve ardından iyi doğrulanmış bir çevrimiçi yazılım aracı olan Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15 ile in silico analizi içerir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-MCSF Cell Line</td>
			<td>Gift from Russell Vance</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP Reagent Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0525S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS -Ca/Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase DNA polymerase &#38; buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind conical tubes 15 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind Eppendorf tubes 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer r2.1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK5000, MPP100, MPS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 uL Tips</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK1025 or MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + 1mM EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02017F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer for ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS</td>
			<td>University of California Macro Lab</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>Available to non-UC investigators through&#160; https://qb3.berkeley.edu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency gene disruption in primary bone marrow-derived macrophages using electroporated cas9-sgrna complexes

Farelerden elde edilen kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM'ler), doku makrofajlarının karmaşık biyolojisini incelemek için önemli bir araçtır. Birincil hücreler olarak, makrofajların fizyolojisini in vivo olarak ölümsüzleştirilmiş makrofaj hücre dizilerinden daha yakından modellerler ve halihazırda tanımlanmış genetik değişiklikleri taşıyan farelerden türetilebilirler. Bununla birlikte, BMDM'lerde gen fonksiyonunu bozmak teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Burada, BMDM'lerde verimli CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi için bir protokol sunuyoruz, bu da gen fonksiyonunu bozan çerçeve kayması mutasyonlarıyla sonuçlanan küçük eklemelerin ve delesyonların (indels) kullanılmasına izin veriyor. Protokol, tek kılavuzlu RNA'ların (sgRNA-Cas9) nasıl sentezleneceğini ve elektroporasyon yoluyla verilebilen saflaştırılmış sgRNA-Cas9 ribonükleoprotein komplekslerinin (RNP'ler) nasıl oluşturulacağını açıklar. Ayrıca, rutin Sanger dizileme ve ücretsiz olarak kullanılabilen bir çevrimiçi analiz programı kullanarak düzenleme verimliliğini izlemek için etkili bir yöntem sağlar. Protokol 1 hafta içinde yapılabilir ve plazmit yapımı gerektirmez; Genellikle %85 ila %95 düzenleme verimliliği sağlar.

Macrophages are innate immune cells that play critical roles in tissue repair and immunity1,2. Immortalized macrophage cell lines, such as mouse RAW 264.7 cells or human THP-1 cells, have several beneficial characteristics, including robust growth and ease of gene disruption by delivering vectors for RNA interference or CRISPR/Cas93,4. However, oncogenic transformation dramatically alters their physiology, which results in the aberrant activation of some pathways and muted responses of others5,6. Primary bone marrow-derived macrophages (BMDMs) more closely recapitulate in vivo macrophage physiology, but remain challenging to genetically manipulate due to the low efficiency of both plasmid transfection and viral transduction in these primary immune cells7,8. Thus, more efficient methods for disrupting gene function are needed.
CRISPR/Cas9 genome editing is a powerful tool for genetic manipulation across a range of biological systems, including mammalian cells9,10,11,12. The Streptococcus pyogenes Cas9 protein efficiently and specifically cleaves double-stranded DNA when complexed with a sequence-specific guide RNA. DNA repair through the non-homologous end joining (NHEJ) of the cleaved DNA results in small insertions or deletions (indels) that create frameshift mutations. In early studies, Cas9 and sgRNAs were delivered through plasmid or lentiviral vectors, which are effective delivery methods for many cell lines9,10. However, primary cells and, in particular, primary immune cells are often refractory to these methods due to the low efficiency of vector delivery by transfection or transduction. Subsequently, methods have been developed to generate sgRNA-Cas9 complexes in vitro and to deliver them via electroporation, and these methods have achieved high efficiency in a variety of cell types13,14. The results have suggested the possibility of using this approach to carry out genome editing in primary macrophages.
Here, we provide a protocol for using sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) to carry out genome editing in primary BMDMs. It contains steps to mitigate the activation of the immune sensors present in primary immune cells and results in up to 95% editing at targeted loci with minimal toxicity. This protocol also includes workflows to evaluate editing efficiency using routine polymerase chain reaction (PCR) and Sanger sequencing, followed by in silico analysis by Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, a well-validated online software tool.

Yazar Spotlight: Hassas Gen Bozulması için Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Verimli CRISPR/Cas9 Genom Düzenleme

Elektropore Cas9-sgRNA Kompleksleri Kullanılarak Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Yüksek Verimli Gen Bozulması

Our laboratory studies the interaction between mycobacterium, tuberculosis and the host immune system, with a focus on the initial interaction between the bacterium and the macrophage. There's a variety of gene-disruption techniques used in macrophages, including RNAi technologies and CRISPR technologies. One of the major challenges is the low efficiency of gene disruption in macrophages.This protocol enables the rapid and high-efficiency genetic manipulation of primary macrophages without the need for cloning and plasmid construction. These methods should be broadly applicable in immunology, enabling researchers to disrupt genes in primary macrophages for a wide array of studies.

IVT şablonu 127 bp'lik bir PCR ürünüdür (Şekil 1B). Tam uzunlukta IVT ürünü, 70 bp çift sarmallı DNA fragmanına benzer şekilde göç eden 98 nt'lik bir RNA'dır (Şekil 1C).
Elektroporasyondan sonra, hücreler %>90 canlı olmalı ve toplam hücre sayısı başlangıç hücre sayısının %>70'i olmalıdır. Ortaya çıkan mutant hücre havuzu, Cas9 bölünme bölgesinin yakınından başlayarak çeşitli bir indel setine ...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient CRISPR/Cas9 Genome Editing in Bone Marrow-Derived Macrophages for Precise Gene Disruption at JoVE.com

Bu protokol, in vitro olarak bir araya getirilen ve elektroporasyon yoluyla iletilen Cas9-sgRNA ribonükleoprotein kompleksleri kullanılarak fare kemik iliği türevi makrofajlarda genom düzenleme prosedürünü açıklar.

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

Laboratuvarımız, bakteri ve makrofaj arasındaki ilk etkileşime odaklanarak mikobakteri, tüberküloz ve konakçı bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimi inceler. RNAi teknolojileri ve CRISPR teknolojileri de dahil olmak üzere makrofajlarda kullanılan çeşitli gen bozulma teknikleri vardır. En büyük zorluklardan biri, makrofajlarda gen bozulmasının düşük verimliliğidir.Bu protokol, klonlama ve plazmit yapımına gerek kalmadan primer makrofajların hızlı ve yüksek verimli genetik manipülasyonunu sağlar. Bu yöntemler immünolojide geniş çapta uygulanabilir olmalı ve araştırmacıların çok çeşitli çalışmalar için primer makrofajlardaki genleri bozmalarını sağlamalıdır.

high-efficiency-gene-disruption-primary-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Genetics

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the physiology of macrophages in vivo more closely than immortalized macrophage cell lines and can be derived from mice already carrying defined genetic changes. However, disrupting gene function in BMDMs remains technically challenging. Here, we provide a protocol for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in BMDMs, which allows for the introduction of small insertions and deletions (indels) that result in frameshift mutations that disrupt gene function. The protocol describes how to synthesize single-guide RNAs (sgRNA-Cas9) and form purified sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) that can be delivered by electroporation. It also provides an efficient method for monitoring editing efficiency using routine Sanger sequencing and a freely available online analysis program. The protocol can be performed within 1 week and does not require plasmid construction; it typically results in 85% to 95% editing efficiency.

This protocol describes the procedure for genome editing in mouse bone marrow-derived macrophages using Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes assembled in vitro and delivered by electroporation.

Genetik

Preparation for Electroporation and Ribonucleoprotein Delivery for Genome Editing in Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages

To begin, set the parameters of the pipette station placed in the laminar flow hood to 1, 900 volts, 20 milliseconds in one pulse. Carefully remove a transfection tube from the package to keep it sterile and fill it with three milliliters of E buffer. To prepare the cells for electroporation, remove the growth medium from the cells and wash them using PBS to remove the serum and divalent cations that promote adhesion.Then add a mixture of PBS and one millimolar EDTA to the cells and incubate at room temperature for about five minutes until the cells begin to detach. Pipette up and down gently to detach the cells and transfer the cells to a low protein binding 15 milliliter tube. Pellet the cells at 500 G for five minutes.After centrifugation quickly remove most of the supernatant, leaving about one milliliter of the supernatant in the tube. Resuspend the cells in the remaining supernatant and transfer it to a low protein binding 1.5 milliliter microfuge tube. Remove a small aliquot of cells to count and pellet the remaining cells by centrifusion at 500 G at room temperature for five minutes.Count the cells during centrifugation. Take 1x sgRNA in 20 millimolar Cas9 solution and warm the tubes to room temperature. After centrifugation, remove all the supernatant from the cell pellet and resuspend the cells in PBS with calcium chloride and magnesium chloride at a concentration of 40 million cells per milliliter.For the sgRNA Cas9 ribonucleoprotein complex assembly, add 2.5 microliters of sgRNA to one microliter of the diluted Cas9 in sterilized PCR tubes and dispense the sgRNA slowly with mixing for about 15 seconds to prevent precipitation. Incubate for five minutes at room temperature to allow the ribonucleoprotein complex formation. To deliver the ribonucleoprotein complex by electroporation, prepare the electroporation tip by depressing the plunger to extend the stem.Then insert the stem into the tip. Resuspend the cells by pipetting up and down. Load the electroporation tip with the cells and withdraw the full 10 microliters volume capacity of the tip.Starting with the negative control sgRNA, transfer 10 microliters of cells in the electroporation tip to the sample tube containing 3.5 microliters of ribonucleoprotein. Pipette up and down three times to mix well, and draw 10 microliters of the mixture back into the tip. Place the tip into the electroporation station, lowering it into the buffer, and push Start on the touchscreen display.After completion, the display will indicate a successful pulse. Remove the pipette from the device and place the cells in a dry well of the uncoated 12 well plate. Rinse the tip by pipetting up and down twice in 15 milliliters of PBS with calcium chloride and magnesium chloride.Set aside the pipette with the tip still attached. Immediately add one milliliter of the antibiotic free medium aliquoted earlier to the cells and gently shake the plate to mix. The representative Sanger sequencing chromatogram of the Rosa 26 locus from the bone marrow derived macrophages electroporated with a controlled non-targeting sgRNA Cas9 ribonucleoprotein, Rosa 26 specific sgRNA, and Src and Cblb genes in the edited macrophages are shown here.The analysis of the targeted genes by PCR and Sanger sequencing shows multiple nucleotides at each position downstream of the Cas9 cleavage site. These results validate the attainment of a high editing efficiency for multiple targeted genes.