Diese Forschung wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BO5534) ins Leben gerufen. Wir danken Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer und PD Dr. Ingo Königs für die Bereitstellung von Mustern. Darüber hinaus danken die Autoren dem Team der UKE Microscopy Imaging Facility (Core Facility, UKE Medical School) für die Unterstützung bei der Immunfluoreszenzmikroskopie.

Diese Studie umfasste Mausgewebe aus Experimenten, die von der Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, genehmigt wurden (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Bei den verwendeten Geweben handelte es sich um Maus, Lunge und Dickdarm aus einem septischen Modell und verbrannte Haut. Wir haben 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse verwendet. Bei allen Versuchen wurde die europäische Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere befolgt. Die anonymisierten menschlichen Proben umfassten Gewebe von neonataler Enterokolitis, verbrannter Haut, Gallengangsatresie, Spondylodiszitis und Myokard. Nach Angaben der Ethikkommission für medizinische Forschung Hamburg bedurften die Proben keiner Einverständniserklärung, die Studie wurde jedoch von der Kommission genehmigt (WF-026/21).
1. Proben-Fixierung
<ol><li>Verwenden Sie das folgende Protokoll, das von Abu Abed und Brinkmann abgeleitet wurde, für die Probenfixierung, Dehydratisierung, Paraffineinbettung, Schnitte und Einbettung 3,15.<ol><li>Bereiten Sie eine 4%ige Formaldehydlösung vor, indem Sie 40 g Paraformaldehyd (PFA) in 800 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 (TBS) auflösen.</li>
		<li>Die Mischung bei 60 °C unter einem Abzug rühren, bis sich das PFA aufgelöst hat. Bringen Sie die Lösung auf Raumtemperatur (RT) und stellen Sie das Volumen mit TBS auf 1.000 ml ein.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. 2-3 Wochen bei 4 °C oder bis zu 1 Jahr bei −20 °C lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Zur Fixierung der Probe wird frisches Gewebe in TBS-Puffer gelegt und in Stücke zerlegt, die kleiner als 20 mm x 30 mm x 3 mm sind. Tauchen Sie die Gewebeschnitte für 12-24 h in 4%ige Paraformaldehydlösung. HINWEIS: Das ursprüngliche Protokoll verwendete eine 2%ige PFA-Lösung und eine Fixierungszeit von 8-20 Stunden. Mit dieser Methode waren einige Gewebeschnitte nach 20 h nicht vollständig fixiert, so dass die PFA-Konzentration auf 4% PFA erhöht wurde.</li>
	<li>Überführen Sie die Proben in beschriftete Tissue-Processing-Kassetten. Verwenden Sie lösungsmittelbeständige Marker oder Bleistifte für die Beschriftung.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Dehydrierung der Probe, indem Sie die Kassetten 1 h lang in 70%iges Ethanol tauchen. Dann in 80 % Ethanol, 90 % Ethanol, 96 % Ethanol und zweimal in 100 % Ethanol eintauchen, wobei jeder Schritt 1 Stunde dauert.</li>
	<li>Zweimal in 100%iges Xylol (Dimethylbenzol) und dann zweimal für jeweils 1 h in 60 °C Paraffin eintauchen.</li>
	<li>Verwenden Sie Einbettformen für die Montage und lassen Sie das Paraffin erstarren, bevor Sie die Form entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Mikrotom zum Schneiden von 3 μm dicken Gewebeschnitten.</li>
	<li>Legen Sie die geschnittenen Abschnitte mit einer Pinzette in ein 37 °C warmes Wasserbad und lassen Sie sie auf der Oberfläche schwimmen, um die Gewebeschnitte zu dehnen.</li>
	<li>Legen Sie die Abschnitte auf selbstklebende Objektträger (Materialtabelle) und lassen Sie sie über Nacht in einer 40 °C heißen Wärmekammer trocknen.</li>
</ol>2. Rehydrierung der Probe
<ol><li>Zur Entparaffinierung werden die Objektträger in einem Objektträgergestell gestapelt und zweimal für jeweils 5 Minuten in das Xylol-Ersatzmedium Limonen (Materialtabelle) und einmal für 5 Minuten in ein 1:1-Limonen/Ethanol-Gemisch getaucht. ACHTUNG: Limonen ist bei 50 °C brennbar und kann allergische Reaktionen hervorrufen. Unter einem Abzug mit Augenschutz und Handschuhen verwenden. Von offenem Feuer fernhalten.</li>
	<li>Rehydrieren Sie die Proben in einer absteigenden Ethanolreihe, indem Sie das Objektträgergestell zweimal in 100 % Ethanol und einmal in 96 % Ethanol, 90 % Ethanol, 80 % Ethanol und 70 % Ethanol für jeweils 5 Minuten eintauchen.</li>
	<li>Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in deionisiertes Wasser (DI-Wasser), um das restliche Ethanol zu entfernen.</li>
</ol>3. Autofluoreszenz-Blockierung und Antigen-Rückgewinnung
<ol><li>pH 6 Citrat Target Retrieval Solution (TRS) (Table of Materials) gemäß dem Datenblatt vorbereiten. Dieses TRS ist 10-fach konzentriert. Daher 1:10 mit DI-Wasser verdünnen. In einem Färbeglas aus Kunststoff auf 96 °C vorheizen. HINWEIS: TRS bricht die Methylenbrücken, die während der Probenfixierung gebildet werden, um die Antigenepitope freizulegen. Dadurch können die Primärantikörper an ihr Zielantigen binden. Konzentriertes TRS 8 Monate lang bei 2-8 °C lagern. Bereiten Sie immer frisches TRS zu.</li>
	<li>Nehmen Sie die Objektträger aus dem Objektträgergestell und legen Sie sie in eine feuchte Kammer. Pipettieren Sie ein bis zwei Tropfen Autofluoreszenzreduktionsmittel (Materialtabelle) auf jede Probe. 5 Minuten inkubieren. HINWEIS: Das Autofluoreszenzreduktionsmittel blockiert die inhärente Autofluoreszenz des Gewebes, die durch endogene Fluorophore und Fixiermittel verursacht wird. Lagern Sie das Autofluoreszenz-Reduktionsmittel bis zu 1 Jahr bei RT. HINWEIS: Arbeiten Sie nur mit kleinen Gewebeabschnitten, um ein Austrocknen der Proben oder eine Überschreitung der Inkubationszeit zu vermeiden.</li>
	<li>Stapeln Sie die Objektträger wieder in das Objektträgergestell und spülen Sie sie 1 Minute lang in 60%igem Ethanol mit einer Aufwärts- und Abwärtsbewegung, bis das gesamte unbenutzte Autofluoreszenz-reduzierende Reagenz abgewaschen ist.</li>
	<li>Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in DI-Wasser.</li>
	<li>Für die Antigengewinnung werden die Objektträger mit dem vorgewärmten TRS in ein Färbegefäß gegeben. 10 min bei 96 °C im Wasserbad inkubieren. HINWEIS: Das 96 °C warme Wasserbad kann durch eine Mikrowelle oder einen Dampfgarer ersetzt werden, wenn der TRS auf 96 °C vorgeheizt ist und eine Inkubationszeit von 10 Minuten bei 96 °C gewährleistet ist.</li>
	<li>Nehmen Sie das Färbeglas heraus und lassen Sie es ca. 60-90 Minuten lang langsam auf RT abkühlen. HINWEIS: Das Protokoll kann hier für bis zu 4 Stunden pausiert werden, wobei die Folien im TRS verbleiben.</li>
	<li>Entferne die TRS, aber bewahre die Objektträger im Glas auf. Zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween (TBST, pH 7,4) jeweils 3 Minuten lang spülen, um alle übrig gebliebenen TRS-Rückstände abzuwaschen.</li>
	<li>Für die Permeabilisierung wird 0,2 % Triton in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 hergestellt und in das Färbegefäß gefüllt, um die Proben 10 Minuten lang zu permeabilisieren. HINWEIS: Die Permeabilisierung verbessert die Bindung der primären Antikörper an die intrazellulären Zielproteine in den fixierten Proben.</li>
	<li>Spülen Sie die Objektträger erneut zweimal in TBST für jeweils 3 min.</li>
	<li>Bereiten Sie die Nasskammer vor und legen Sie die Objektträger aus. Wischen Sie überschüssiges Wasser mit Papiertaschentüchern von den Objektträgern ab. Umkreisen Sie jede Probe mit einem hydrophoben Barrierestift, um zu verhindern, dass die Antikörperlösung abläuft. HINWEIS: Lassen Sie die Proben nicht austrocknen. Am besten ist es, mit kleinen Abschnitten zu arbeiten.</li>
</ol>4. Blockierung der unspezifischen Antikörperbindung
<ol><li>Nehmen Sie gebrauchsfertige Blockierungslösung mit Eselsserum (Materialtabelle) und pipettieren Sie einen Tropfen auf jede Probe. 30 Minuten bei RT inkubieren. HINWEIS: Dieser Blockierungsschritt minimiert die Bindung des sekundären Antikörpers an unspezifische Bindungsstellen auf der Probe. Nach der Blockierung dieser unspezifischen Epitope und dem Auftragen des Primärantikörpers bindet der Sekundärantikörper an den Primärantikörper und interagiert nicht mit der Oberfläche des Gewebes. Dieses gebrauchsfertige Blockierungsreagenz wird 6 Monate lang bei 2-8 °C gelagert.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Blockierungslösung von Objektträgern, indem Sie die Kante der Objektträger gegen eine harte Oberfläche klopfen. Spülen Sie sie nicht aus.</li>
</ol>5. Primärer Antikörper
<ol><li>Primärantikörper im Antikörperverdünnungspuffer verdünnen (Materialtabelle). Verwenden Sie für jede Probe ca. 100 μl der endgültigen Lösung. Für den NE- und H3cit-Antikörper (R8) und die Isokontrolle auf eine Konzentration von 5 μg/ml verdünnen. Für MPO und die entsprechende Isokontrolle verwenden Sie 10 μg/ml. Bereiten Sie ein Röhrchen für jeden Primärantikörper und eines für jeden Isocontrol-Antikörper vor. HINWEIS: H3cit (R8)/MPO oder NE/MPO und ihre Isokontrollen können für die NET-Färbung kombiniert werden. Für die Kombination von H3cit (R8)/MPO wird auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml für H3cit (R8) und 10 μg/ml für MPO auf ein Endvolumen von 100 μl pro Probe verdünnt. Bei NE/MPO auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml für NE und 10 μg/ml für MPO auf ein Endvolumen von 100 μl pro Probe verdünnen. Verwenden Sie für die Isokontrolle die gleiche Konzentration wie für jeden entsprechenden Antikörper. Verwenden Sie für jeden verwendeten Antikörper immer eine neue Pipettenspitze. Primärantikörper können bei 4 °C für 1-2 Wochen und bei −20 °C oder −80 °C für bis zu 1 Jahr gelagert werden.</li>
	<li>Verwenden Sie mit zwei Proben auf einem Objektträger eine für die Isocontrol-Antikörper und eine für die MPO/H3cit- oder MPO/NE-Antikörperverdünnung. Verwenden Sie ca. 100 μl für jede Probe und verteilen Sie die Antikörperlösung gleichmäßig. HINWEIS: Lassen Sie die Proben nicht austrocknen. Achten Sie darauf, dass Sie die Isokontroll- und Primärantikörper nicht verwechseln.</li>
	<li>Über Nacht in einer Feuchtkammer bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Klopfen Sie am nächsten Tag die überschüssige Primärantikörperlösung von den Objektträgern ab und stapeln Sie die Objektträger in einer Küvette. Dreimal für jeweils 5 Minuten mit TBST spülen, um die verbleibende Primärantikörperlösung abzuwaschen.</li>
</ol>6. Sekundärer Antikörper
<ol><li>Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung vor. Verwenden Sie zwei verschiedene fluoreszierende Sekundärantikörper: Esel-Anti-Ziege für MPO und Esel-Anti-Kaninchen für die H3cit-Färbung. Verdünnen Sie sie jeweils auf eine Konzentration von 7,5 μg/ml mit Antikörper-Verdünnungspuffer (Materialtabelle). HINWEIS: Verwenden Sie für die Doppelfärbung zwei fluoreszierende Antikörper mit unterschiedlichen Anregungsbereichen und minimaler spektraler Überlappung. Kombinieren Sie beide Sekundärantikörper und verdünnen Sie sie auf eine Endkonzentration von 7,5 μg/ml für jeden Antikörper, um ein Endvolumen von 100 μl pro Probe zu erhalten. Schützen Sie die Antikörper vor Licht. Die Sekundärantikörper können bei 2-8 °C für 6-8 Wochen oder bei -80 °C für bis zu 1 Jahr gelagert werden.</li>
	<li>Bewahren Sie die Objektträger in der Nasskammer auf und geben Sie 100 μl der Sekundärantikörperlösung auf jede Probe. Lassen Sie sie 30 Minuten bei RT und lichtgeschützt inkubieren.</li>
	<li>Klopfen Sie die überschüssige Sekundärantikörperlösung ab und stapeln Sie die Objektträger im Objektträgergestell. Dreimal für jeweils 5 Minuten in ein mit PBS gefülltes Färbegefäß eintauchen, um alle verbleibenden ungebundenen Antikörper abzuwaschen.</li>
	<li>Bereiten Sie die DAPI-Lösung (4',6-Diamidino-2-phenylindol) (Materialtabelle) vor und verdünnen Sie sie mit DI-Wasser auf eine Konzentration von 1 μg/ml. Tauchen Sie das Objektträgergestell in ein Färbegefäß mit DAPI-Lösung und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei RT im Dunkeln. HINWEIS: DAPI wird als Fluoreszenzfärbung für doppelsträngige DNA verwendet. Die vorbereitete DAPI-Lösung kann mehrfach verwendet werden. Bewahren Sie die vorbereitete DAPI-Lösung bei RT auf. Das DAPI-Konzentrat kann bei −20 °C bis zu 1 Jahr gelagert werden.</li>
	<li>Tauchen Sie das Objektträgergestell für 5 Minuten in ein Färbegefäß mit PBS, um die überschüssige DAPI-Lösung abzuwaschen.</li>
</ol>7. Montieren und Lagern der Proben, mikroskopische Analyse
<ol><li>Montieren Sie die Proben mit Deckgläsern und Eindeckmedium (Materialtabelle). HINWEIS: Verwenden Sie nur kleine Mengen des Eindeckmediums und wischen Sie das überschüssige Medium mit feuchten Taschentüchern ab. Tragen Sie Handschuhe und vermeiden Sie es, versehentlich Medien von den Deckgläsern oder Objektträgern abzuwischen. Vermeiden Sie Blasenbildung und drücken Sie mit Wattestäbchen vorsichtig auf die Deckgläser, um Blasen von den Objektträgern zu entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie für die Bildgebung ein Weitfeldmikroskop oder ein konfokales Mikroskop. HINWEIS: Machen Sie zuerst ein Bild von der Isokontrolle. Verringern Sie die Belichtungszeit für die Fluoreszenzfilter (mit Ausnahme des Blaufilters für DAPI), bis fast kein Signal mehr detektiert werden kann. Verwenden Sie dann diese Einstellung, um die entsprechenden Beispiele zu untersuchen. Suchen Sie nach Bereichen, in denen mit Hilfe des Fluoreszenzkanals ein Fluoreszenzsignal in jeder einzelnen Probe detektiert werden kann. Nach der Aufnahme eines Bildes des Bereichs erzeugt das Programm ein zusammengesetztes Bild aller Kanäle und zeigt die verschiedenen Fluoreszenzsignale als Überlappung verschiedener Farben an. Das Bild kann dann für die Co-Lokalisierung mit Bildgebungssoftware wie ImageJ weiter analysiert werden.</li>
	<li>Lagern Sie die Objektträger bis zu 6 Monate bei 4 °C.</li>
</ol>

Färbung und Bildgebung zur Visualisierung extrazellulärer Fallen von Neutrophilen

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+feline+arterial+thrombi+using+immunofluorescence+microscopy.">Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).</li><li>Stehr, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+drive+epithelial-mesenchymal+transition+of+human+colon+cancer.">Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer.</a> Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval:+Mechanisms+and+application+to+histochemistry.">Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li><li>Smyth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-vascular+interactions+drive+myeloperoxidase+accumulation+in+the+brain+in+Alzheimer's+disease.">Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue.">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).</li><li>Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+autofluorescence+quenching+techniques+on+formalin-fixed+chicken+tissues.">Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues.</a> Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVIG+regulates+the+survival+of+human+but+not+mouse+neutrophils.">IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+Multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In dieser Arbeit zielten wir darauf ab, die bestehenden Protokolle für die Bildgebung von NETs an weitere Gewebetypen anzupassen und zu optimieren, beginnend mit dem eigentlichen Färbeprozess. Der erste kritische Schritt für diese Methode ist die Auswahl der am besten geeigneten Antikörper. Für NE haben wir einen NE-Antikörper von einem Mauswirt auf menschlichem Gewebe getestet, der im Vergleich zu NE von einem Kaninchenwirt keine zuverlässige Färbung zeigte. Darüber hinaus schlugen Thålin et al. H3cit (R8) als...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated from:
Lavinia Sch&#246;enfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) wurden erstmals 2004 von Brinkmann et al. als ein Weg des Zelltods visualisiert, der sich von Apoptose und Nekrose unterscheidet1. Auf diesem Weg geben Neutrophile ihr dekondensiertes Chromatin in den extrazellulären Raum ab, um große netzartige Strukturen zu bilden, die mit antimikrobiellen Proteinen bedeckt sind, die zuvor in den Granula oder dem Zytosol gespeichert waren. Zu diesen antimikrobiellen Proteinen gehören neutrophile Elastase (NE), Myeloperoxidase (MPO) und citrulliniertes Histon H3 (H3cit), die üblicherweise für den indirekten Immunfluoreszenznachweis von NETsverwendet werden 2. Diese Methode identifiziert nicht nur das quantitative Vorhandensein dieser Proteine; in der Tat hat es den Vorteil, NET-ähnliche Strukturen spezifisch zu detektieren. In den NETs kolokalisieren die genannten Proteine mit extrazellulärer DNA, was durch eine Überlappung der Fluoreszenzsignale jedes gefärbten Proteins und der extrazellulären DNA nachgewiesen werden kann. Im Gegensatz zu den überlappenden Signalen, die auf die Kolokalisation von extrazellulärer DNA und Proteinen in NETs zurückzuführen sind, zeigen intakte Neutrophile keine Kolokalisation. Hier werden die NET-Komponenten in der Regel getrennt in den Granula, Zellkernen und Zytosol3 gelagert.
Seit ihrer ersten Entdeckung hat sich gezeigt, dass NETs bei zahlreichen Krankheiten, insbesondere bei Entzündungen, eine zentrale Rolle spielen. NETs zeigen antimikrobielle Funktionen während der Infektion, indem sie extrazelluläre Krankheitserreger in Blut und Gewebe einfangen und abtöten 4,5. NETs wurden jedoch auch mit Autoimmunerkrankungen und hyperinflammatorischen Reaktionen wie systemischem Lupus erythematodes, rheumatischer Arthritis und allergischem Asthma in Verbindung gebracht 6,7,8. NETs fördern Vaso-Verschluss und Entzündung bei Atherosklerose, Thrombozytenadhäsion und es wird spekuliert, dass sie eine Rolle bei metastasierendem Krebs spielen 9,10,11. Dennoch wird angenommen, dass sie entzündungshemmende Eigenschaften haben, indem sie den proinflammatorischen Zytokinspiegel senken12. Während NETs in einem breiteren Forschungsfeld immer mehr an Interesse gewinnen, ist eine robuste NET-Detektionsmethode für die zukünftige Forschung von grundlegender Bedeutung.
Auch wenn die Visualisierung von NETs in verschiedenen Geweben mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung komplex ist und angepasst werden muss, ist sie neben der Elektronenmikroskopie derzeit eine der renommiertesten Methoden zur Visualisierung der Wechselwirkungen zwischen NETs und Zellen und wird überwiegend in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben (FFPE) eingesetzt13,14. Der Vergleich der NET-Bildgebung ist jedoch schwierig, da verschiedene Labore ihre eigenen maßgeschneiderten Protokolle verwenden. Diese Protokolle unterscheiden sich in der Verwendung von Antikörpern, der Antigengewinnung oder der Permeabilisierungsmethode und sind oft für einen bestimmten Gewebetyp optimiert 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.
Nachdem Brinkmann et al. die erste methodische Studie mit immunfluoreszierender Visualisierung von NETs in FFPE-Gewebe veröffentlicht hatten, wollten wir dieses Protokoll für eine größere Vielfalt von Geweben und Spezies optimieren15. Um ein breit anwendbares Immunfluoreszenzprotokoll zu etablieren, testeten wir verschiedene modifizierte Protokolle aus Studien, die Immunfluoreszenzmethoden in FFPE-Gewebe zum Nachweis von NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 verwendeten. 26,27. Darüber hinaus haben wir einen neuen H3cit-Antikörper für eine spezifischere extrazelluläre Färbung ausprobiert28. Wir stellen die Hypothese auf, dass durch die systematische Anpassung aktueller Färbeprotokolle an verschiedene Spezies und Gewebe die In-vitro-Bildgebung verbessert werden kann, was zu einer besseren Darstellung der Interaktion zwischen Neutrophilen und NETs sowohl lokal als auch systemisch führt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 68672&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody&#160; 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 5103</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 25989</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 90810</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Microscopy Software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>&#160;GTX30972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 25 mg</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6335.1</td>
			<td>1:25000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCS antibody dilution 500 mL</td>
			<td>DCS diagnostics</td>
			<td>DCS AL120R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey ant goat Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit AF647</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide rack</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF 3667&#160;</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>MKP-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 37415</td>
			<td>1:2000 and 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml</td>
			<td>Maxvision</td>
			<td>MB-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCamHR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>HMT84M421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 negative control</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0931 Aglient</td>
			<td>1:50 and 1:5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-108-C&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Phosphate buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP staining jar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2292.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 219406</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 172730</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#160;6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Tris buffered saline (x10)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>830476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath rice cooker</td>
			<td>reishunger</td>
			<td>RCP-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet chamber</td>
			<td>Weckert Labortechnik</td>
			<td>600016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Widefield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of neutrophil extracellular traps in human and mouse tissues

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden von Neutrophilen als Reaktion auf bakterielle Infektionen oder traumatische Gewebeschäden freigesetzt, spielen aber auch eine Rolle bei Autoimmunerkrankungen und sterilen Entzündungen. Es handelt sich um netzartige Strukturen, die aus doppelsträngigen DNA-Filamenten, Histone und antimikrobiellen Proteinen bestehen. Einmal freigesetzt, können NETs extrazelluläre Krankheitserreger in Blut und Gewebe einfangen und abtöten. Darüber hinaus sind NETs an der homöostatischen Regulation beteiligt, indem sie die Adhäsion und Koagulation von Blutplättchen stimulieren. Die dysregulierte Produktion von NETs wurde jedoch auch mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Sepsis oder Autoimmunerkrankungen, was sie zu einem vielversprechenden Ziel für therapeutische Interventionen macht. Neben der Elektronenmikroskopie ist die Visualisierung von NETs mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung derzeit eine der wenigen bekannten Methoden, um NET-Wechselwirkungen im Gewebe nachzuweisen. Daher wurden verschiedene Färbemethoden zur Visualisierung von NETs eingesetzt. In der Literatur werden verschiedene Färbeprotokolle beschrieben, und wir haben vier Schlüsselkomponenten identifiziert, die eine hohe Variabilität zwischen den Protokollen aufweisen: (1) die Art der verwendeten Antikörper, (2) die Verwendung von Autofluoreszenz-reduzierenden Mitteln, (3) Antigen-Retrieval-Methoden und (4) Permeabilisierung. Daher wurden in dieser Arbeit in vitro Immunfluoreszenz-Färbeprotokolle systemisch angepasst und verbessert, um sie für verschiedene Spezies (Maus, Mensch) und Gewebe (Haut, Darm, Lunge, Leber, Herz, Bandscheibe) anwendbar zu machen. Nach der Fixierung und Paraffineinbettung wurden 3 μm dicke Schnitte auf Objektträger montiert. Diese Proben wurden mit primären Antikörpern gegen Myeloperoxidase (MPO), citrulliniertes Histon H3 (H3cit) und neutrophile Elastase (NE) nach einem modifizierten Färbeprotokoll gefärbt. Die Objektträger wurden mit Sekundärantikörpern gefärbt und mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Ergebnisse wurden anhand eines Bewertungsbogens analysiert und Unterschiede semi-quantitativ erfasst.
Hier stellen wir ein optimiertes NET-Färbeprotokoll vor, das für verschiedene Gewebe geeignet ist. Wir verwendeten einen neuartigen Primärantikörper zur Färbung von H3cit und reduzierten die unspezifische Färbung mit einem Autofluoreszenz-reduzierenden Mittel. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die NET-Färbung eine konstant hohe Temperatur und einen sorgfältigen Umgang mit den Proben erfordert.

Neutrophil extracellular traps (NETs) were first visualized by Brinkmann et al. as a pathway of cellular death different from apoptosis and necrosis in 20041. In this pathway, neutrophils release their decondensed chromatin into the extracellular space to form large web-like structures covered in antimicrobial proteins that were formerly stored in the granules or cytosol. These antimicrobial proteins include neutrophil elastase (NE), myeloperoxidase (MPO), and citrullinated histone H3 (H3cit), which are commonly used for indirect immunofluorescence detection of NETs2. This method not only identifies the quantitative presence of these proteins; indeed, it has the advantage of specifically detecting NET-like structures. In the NETs, the mentioned proteins co-localize with extracellular DNA, which can be detected by an overlap of the fluorescence signals of each stained protein and the extracellular DNA. In contrast to the overlapping signals due to extracellular DNA and protein co-localization in NETs, intact neutrophils show no co-localization. Here, the NET components are usually stored separately in the granules, nuclei, and cytosol3.
Since their first discovery, it has been shown that NETs play a central role in numerous diseases, particularly those involving inflammation. NETs show antimicrobial functions during infection through trapping and killing extracellular pathogens in blood and tissue4,5. However, NETs have also been connected to autoimmune diseases and hyperinflammatory responses, like systemic lupus erythematosus, rheumatic arthritis, and allergic asthma6,7,8. NETs promote vaso-occlusion and inflammation in atherosclerosis, platelet adhesion, and are speculated to play a role in metastatic cancer9,10,11. Nevertheless, they are thought to have anti-inflammatory properties by reducing proinflammatory cytokine levels12. While NETs are gaining more interest in a broader field of research, a robust NET detection method is fundamental for future research.
Even though the visualization of NETs in different tissue using immunofluorescence imaging is complex and requires customization, apart from electron microscopy, it is currently one of the most renowned methods for visualizing the interactions between NETs and cells and is predominantly used in formalin-fixed paraffin-embedded tissues (FFPE)13,14. However, comparing NET imaging is difficult, as different laboratories use their own customized protocols. These protocols differ in their use of antibodies, antigen retrieval, or permeabilization method and are often optimized for a specific type of tissue3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.
After Brinkmann et al. published the first methodic study using immunofluorescent visualization of NETs in FFPE tissue, we wanted to optimize this protocol for a wider variety of tissues and species15. Additionally, to establish a broadly applicable immunofluorescence protocol, we tested different modified protocols from studies that used immunofluorescence methods in FFPE tissue to detect NETs3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Furthermore, we tried a new H3cit antibody for more specific extracellular staining28. We hypothesize that by systematically adapting current staining protocols to different species and tissue, in vitro imaging can be improved, resulting in a better representation of the interaction between neutrophils and NETs both locally and systemically.

Autor im Rampenlicht: Bildgebung extrazellulärer Neutrophilenfallen in Geweben von Mensch und Maus 

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Among antibody selection for tissue imaging, the fixation process poses a challenge by epitope masking. Therefore, customized retriever step is required to expose these antigens for antibody binding. Additionally, tissue inherent autofluorescence can cause difficulties through to a high background staining.However, the use of different approaches in the protocols in the literature hinders a standardized comparison between the images. Our study aims to address the demand for standardized procedures and assist the researcher in overcoming challenges during the imaging process. We established a versatile imaging protocol applicable to different tissues by comparing various different protocols.So our work provides guiding and troubleshooting tips from antibody usage to sample mounting, highlighting the potential pitfalls. Our findings advance research by introducing a new primary antibody for citrullinated hisone three, and an autofluorescent reducing agent to minimize background staining. Furthermore, for successful imaging, we emphasize the careful handling of samples and the importance of maintaining a constant high temperature for antigen retrieval.

Bevor wir mit unserer Protokolloptimierung begannen, identifizierten wir die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Färbung, indem wir in PubMed nach Studien suchten, die FFPE-Gewebe für die Immunfärbung von NETs verwendeten, und ihre Protokolle verglichen. Die erfolgversprechendsten Protokollunterschiede wurden als Schlüsselschritte für die Protokolloptimierung identifiziert, während Schritte, die größtenteils miteinander korrespondierten, nicht verändert wurden (Tabelle 1).
<p class="...

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Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

Bei der Auswahl von Antikörpern für die Gewebebildgebung stellt der Fixationsprozess eine Herausforderung durch Epitopmaskierung dar. Daher ist ein maßgeschneiderter Retriever-Schritt erforderlich, um diese Antigene für die Antikörperbindung freizulegen. Darüber hinaus kann die gewebeinhärente Autofluoreszenz Schwierigkeiten bis hin zu einer hohen Hintergrundfärbung verursachen.Die Verwendung unterschiedlicher Ansätze in den Protokollen in der Literatur erschwert jedoch einen standardisierten Vergleich zwischen den Bildern. Unsere Studie zielt darauf ab, die Nachfrage nach standardisierten Verfahren zu befriedigen und den Forscher bei der Bewältigung von Herausforderungen während des Bildgebungsprozesses zu unterstützen. Wir haben ein vielseitiges Bildgebungsprotokoll entwickelt, das auf verschiedene Gewebe anwendbar ist, indem wir verschiedene Protokolle verglichen haben.Daher bietet unsere Arbeit Tipps zur Fehlerbehebung von der Verwendung von Antikörpern bis zur Probenmontage und zeigt die potenziellen Fallstricke auf. Unsere Ergebnisse bringen die Forschung voran, indem sie einen neuen primären Antikörper für citrullinierte Hison-drei und ein autofluoreszierendes Reduktionsmittel zur Minimierung der Hintergrundfärbung einführen. Darüber hinaus legen wir für eine erfolgreiche Bildgebung Wert auf den sorgfältigen Umgang mit den Proben und die Wichtigkeit, eine konstant hohe Temperatur für die Antigengewinnung aufrechtzuerhalten.

immunofluorescence-imaging-neutrophil-extracellular-traps-human-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

4.1K Views.  University of Hamburg. Among antibody selection for tissue imaging, the fixation process poses a challenge by epitope masking. Therefore, customized retriever step is required to expose these antigens for antibody binding. Additionally, tissue inherent autofluorescence can cause difficulties through to a high background staining.However, the use of different approaches in the protocols in the literature hinders a standardized comparison between the images. Our study aims to address the demand for standardize...

Video: Author Spotlight: Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Forschung

Immunologie und Infektion

﻿Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples

Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples  

To begin, prepare 10 times concentrated citrate, target retrieval solution or TRS of pH six, according to the manufacturer's instructions. Dilute it to a ratio of 1:10 with deionized water. Then heat the solution in a plastic staining jar to 96 degrees Celsius.Remove the slides from the slide rack and place them into a wet chamber. Next, pipette one or two drops of the autofluorescence-reducing agent onto each tissue sample and incubate the samples for five minutes. Stack the slides back into the slide rack, and rinse for one minute in 60%ethanol using upward and downward motions to remove the unused autofluorescence-reducing reagent.Submerge the slide rack in deionized water for five minutes. Transfer the slides into a staining jar with preheated TRS Buffer for Antigen Retrieval. Incubate the slides for 10 minutes at 96 degrees Celsius in a water bath.Remove the staining jar and let it cool to room temperature for approximately 60 to 90 minutes. Next, remove the TRS while keeping the slides in the jar. Rinse the slides twice with TRIS Buffered Saline containing 0.05%Tween at pH 7.4 for three minutes each to remove any remaining TRS residues.Place the slides in a wet chamber. Gently wipe excess water from the slides using paper tissues, then encircle each sample using a hydrophobic barrier pen to prevent the antibody solution from running off.

Autofluoreszenzblockierung und Antigengewinnung in Gewebeproben

Immunofluorescence Staining of Neutrophil Extracellular Traps in Tissue Samples

Begin by pipetting one drop of ready-to-use blocking solution with donkey serum onto the tissue samples. Then incubate the samples for 30 minutes at room temperature. Remove the excess blocking solution from the slides by tapping the edge against a hard surface.Dilute the primary antibodies in the antibody dilution buffer to prepare 100 microliters of the final solution for each sample. Set up the antibodies, one tube for each primary antibody and one for each isocontrol antibody. Evenly spread 100 microliters of isocontrol antibodies to one sample, and 100 microliters of myeloperoxidase and citrullinated histone H3, or myeloperoxidase and neutrophil elastase antibody dilution to the other sample.Place the slides in a wet chamber and store them overnight at four degrees Celsius. The following day, tap off excess primary antibody solution from the slides and stack them in a cuvette. Rinse the slides three times for five minutes each using Tris buffered saline with tween To remove the remaining primary antibody solution.Prepare two distinctly fluorescent secondary antibodies, donkey anti-goat for myeloperoxidase and donkey anti-rabbit for citrullinated histone H3 staining. Dilute each antibody to 7.5 micrograms per milliliter concentration in the antibody dilution buffer. Place the slides in a wet chamber and dispense 100 microliters of the secondary antibody solution onto each sample.Incubate them for 30 minutes at room temperature protected from light. Remove excess secondary antibody solution by tapping the slides. Put the slides in a slide rack.Submerge the slides three times for five minutes each in a staining jar filled with PBS to wash off unbound antibodies. Prepare the dappy solution and dilute it to a concentration of one microgram per milliliter with deionized water. Submerge the slide rack in a staining jar containing the dappy solution and incubate for five minutes at room temperature in the dark.Next, submerge the slide rack in a staining jar with PBS for five minutes to wash off any excess dappy solution. Finally, mount the samples using cover slips and mounting medium. The citrullinated histone H3 antibody only bound to the extracellular histones and showed no staining of intracellular histones.The human or mouse specific myeloperoxidase antibody showed no specific staining. While the universal human and mouse antibodies showed consistent good staining for myeloperoxidase. When no blocking agent was used, some mouse samples showed more non-specific and partial positive staining.When blocked, the five minutes blocking time showed good results compared to the 10 minutes blocking time. The higher temperatures in the microwave and water bath showed consistently moderate to good antigen retrieval. Whereas in a 60 degrees Celsius water bath there was only partially positive to no staining.For double staining, more favorable results were obtained for the samples incubated at 96 degrees Celsius water bath. However, exceeding the incubation time of 40 minutes at 96 degrees Celsius resulted in less intense antibody staining.