Name: Author Spotlight: Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues
Uploaded: 2023-08-18T13:30:00
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इस शोध की स्थापना जर्मन रिसर्च सोसाइटी (बीओ 5534) द्वारा की गई थी। हम एंटोनिया किविट, मोरिट्ज़ लेनज़, जोहाना हेगेंस, डॉ अन्निका ह्यूर, और पीडी डॉ इंगो कोनिग्स को हमें नमूने प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। इसके अतिरिक्त, लेखक इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ समर्थन के लिए यूकेई माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा (कोर सुविधा, यूकेई मेडिकल स्कूल) की टीम को धन्यवाद देते हैं।

इस अध्ययन में हैम्बर्ग स्टेट एडमिनिस्ट्रेशन फॉर एनिमल रिसर्च द्वारा अनुमोदित प्रयोगों से प्राप्त माउस ऊतक शामिल थे, बेहोर्डे फर जस्टिज़ एंड वर्ब्राउचेर्सचुट्ज़, हैम्बर्ग, जर्मनी (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16)। इ?...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).</li><li>Abu Abed, U., Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+labelling+of+human+and+murine+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+tissue.">Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).</li><li>Kawasaki, H., Iwamuro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+roles+of+histones+in+host+defense+as+antimicrobial+agents.">Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents.</a> Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).</li><li>Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+anti-Aspergillus+defense+by+neutrophil+extracellular+traps+in+human+chronic+granulomatous+disease+after+gene+therapy+is+calprotectin-dependent.">Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+neutrophil+extracellular+trap+degradation+is+associated+with+lupus+nephritis.">Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).</li><li>Papadaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+exacerbate+Th1-mediated+autoimmune+responses+in+rheumatoid+arthritis+by+promoting+DC+maturation.">Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation.</a> European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).</li><li>Toussaint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+DNA+released+by+NETosis+promotes+rhinovirus-induced+type-2+allergic+asthma+exacerbation.">Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation.</a> Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+traps+promote+thrombosis.">Extracellular DNA traps promote thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps.">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).</li><li>Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation.+Neutrophil+extracellular+traps+license+macrophages+for+cytokine+production+in+atherosclerosis.">Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis.</a> Science. 349 (6245), 316-320 (2015).</li><li>Schauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+limit+inflammation+by+degrading+cytokines+and+chemokines.">Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines.</a> Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).</li><li>Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+neutrophil+extracellular+traps+in+human+tissue+sections.">Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections.</a> BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).</li><li>de Buhr, N., von K&#246;ckritz-Blickwede, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+paraffin-embedded+tissue.">Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+detection+and+quantification+in+paraffin+embedded+samples+using+confocal+microscopy.">NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy.</a> Micron. 114, 1-7 (2018).</li><li>Savchenko, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+form+predominantly+during+the+organizing+stage+of+human+venous+thromboembolism+development.">Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).</li><li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Barliya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+involvement+of+NETosis+in+inflammatory+processes+in+the+eye:+Evidence+from+a+small+cohort+of+patients.">Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients.</a> Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).</li><li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduced+bone+marrow+neutrophils+in+collagen-induced+arthritis+are+primed+for+NETosis:+An+ignored+pathological+cell+involving+inflammatory+arthritis.">Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis.</a> Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).</li><li>Nonokawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+neutrophil+extracellular+traps+with+the+development+of+idiopathic+osteonecrosis+of+the+femoral+head.">Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head.</a> American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).</li><li>Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+are+present+in+the+airways+of+ENaC-overexpressing+mice+with+cystic+fibrosis-like+lung+disease.">Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease.</a> BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).</li><li>Knackstedt, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+drive+inflammatory+pathogenesis+in+malaria.">Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria.</a> Science Immunology. 4 (40), (2019).</li><li>Nakazawa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histones+and+neutrophil+extracellular+traps+enhance+tubular+necrosis+and+remote+organ+injury+in+ischemic+AKI.">Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).</li><li>Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+feline+arterial+thrombi+using+immunofluorescence+microscopy.">Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).</li><li>Stehr, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+drive+epithelial-mesenchymal+transition+of+human+colon+cancer.">Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer.</a> Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval:+Mechanisms+and+application+to+histochemistry.">Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li><li>Smyth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-vascular+interactions+drive+myeloperoxidase+accumulation+in+the+brain+in+Alzheimer's+disease.">Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue.">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).</li><li>Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+autofluorescence+quenching+techniques+on+formalin-fixed+chicken+tissues.">Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues.</a> Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVIG+regulates+the+survival+of+human+but+not+mouse+neutrophils.">IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+Multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).</li></ol>

इस काम में, हमने वास्तविक धुंधला प्रक्रिया से शुरू होने वाले अधिक ऊतक प्रकारों के लिए इमेजिंग एनईटी के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल को अनुकूलित और अनुकूलित करने का लक्ष्य रखा। इस विधि के लिए पहला महत्वपूर्ण क...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated from:
Lavinia Sch&#246;enfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) को पहली बार ब्रिंकमैन एट अल द्वारा 2004 में एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस से अलग सेलुलर मृत्यु के मार्ग के रूप में देखा गयाथा। इस मार्ग में, न्यूट्रोफिल अपने डीकन्डेन्स्ड क्रोमैटिन को बाह्य अंतरिक्ष में छोड़ते हैं ताकि रोगाणुरोधी प्रोटीन में कवर की गई बड़ी वेब जैसी संरचनाएं बनाई जा सकें जो पहले कणिकाओं या साइटोसोल में संग्रहीत थीं। इन रोगाणुरोधी प्रोटीन ों में न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई), मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ), और सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 (एच 3 सीआईटी) शामिल हैं, जो आमतौर पर एनईटी2 के अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाते हैं। यह विधि न केवल इन प्रोटीनों की मात्रात्मक उपस्थिति की पहचान करती है; वास्तव में, इसमें विशेष रूप से नेट जैसी संरचनाओं का पता लगाने का लाभ है। एनईटी में, उल्लिखित प्रोटीन बाह्य डीएनए के साथ सह-स्थानीयकरण करते हैं, जिसे प्रत्येक दाग वाले प्रोटीन और बाह्य डीएनए के प्रतिदीप्ति संकेतों के ओवरलैप द्वारा पता लगाया जा सकता है। एनईटी में बाह्य डीएनए और प्रोटीन सह-स्थानीयकरण के कारण अतिव्यापी संकेतों के विपरीत, बरकरार न्यूट्रोफिल कोई सह-स्थानीयकरण नहीं दिखाते हैं। यहां, नेट घटक ों को आमतौर पर कणिकाओं, नाभिक और साइटोसोल3 में अलग से संग्रहीत किया जाता है।
उनकी पहली खोज के बाद से, यह दिखाया गया है कि एनईटी कई बीमारियों में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से सूजन से जुड़े। एनईटी रक्त और ऊतक 4,5 में बाह्य रोगजनकों को फंसाने और मारने के माध्यम से संक्रमण के दौरान रोगाणुरोधी कार्य दिखाते हैं। हालांकि, एनईटी को ऑटोइम्यून बीमारियों और हाइपरइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं से भी जोड़ा गया है, जैसे प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस, आमवाती गठिया, और एलर्जी अस्थमा 6,7,8। एनईटी एथेरोस्क्लेरोसिस, प्लेटलेट आसंजन में वासो-रोड़ा और सूजन को बढ़ावा देते हैं, और मेटास्टैटिक कैंसर 9,10,11 में भूमिका निभाने का अनुमान लगाया जाता है। फिर भी, उन्हें प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन के स्तरको कम करके विरोधी भड़काऊ गुण माना जाता है। जबकि एनईटी अनुसंधान के व्यापक क्षेत्र में अधिक रुचि प्राप्त कर रहे हैं, भविष्य के अनुसंधान के लिए एक मजबूत नेट डिटेक्शन विधि मौलिक है।
भले ही इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके विभिन्न ऊतकों में एनईटी का विज़ुअलाइज़ेशन जटिल है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के अलावा अनुकूलन की आवश्यकता होती है, यह वर्तमान में एनईटी और कोशिकाओं के बीच बातचीत को देखने के लिए सबसे प्रसिद्ध तरीकों में से एक है और मुख्य रूप से फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों (एफएफपीई) 13,14 में उपयोग किया जाता है।. हालांकि, नेट इमेजिंग की तुलना करना मुश्किल है, क्योंकि विभिन्न प्रयोगशालाएं अपने स्वयं के अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करती हैं। ये प्रोटोकॉल एंटीबॉडी, एंटीजन पुनर्प्राप्ति, या परमेबिलाइजेशन विधि के उनके उपयोग में भिन्न होते हैं और अक्सर एक विशिष्ट प्रकार के ऊतक 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 के लिए अनुकूलित होते हैं।, 27.
ब्रिंकमैन एट अल ने एफएफपीई ऊतक में एनईटी के इम्यूनोफ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन का उपयोग करके पहला मेथोडिक अध्ययन प्रकाशित करने के बाद, हम इस प्रोटोकॉल को ऊतकों और प्रजातियोंकी एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित करना चाहते थे। इसके अतिरिक्त, एक व्यापक रूप से लागू इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए, हमने अध्ययनों से विभिन्न संशोधित प्रोटोकॉल का परीक्षण किया, जिन्होंने एनईटी 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 का पता लगाने के लिए एफएफपीई ऊतक में इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधियों का उपयोग किया। 26,27. इसके अलावा, हमने अधिक विशिष्ट बाह्य धुंधला28 के लिए एक नए एच 3 सीआईटी एंटीबॉडी की कोशिश की। हम अनुमान लगाते हैं कि विभिन्न प्रजातियों और ऊतकों के लिए वर्तमान धुंधला प्रोटोकॉल को व्यवस्थित रूप से अनुकूलित करके, इन विट्रो इमेजिंग में सुधार किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप स्थानीय और व्यवस्थित रूप से न्यूट्रोफिल और एनईटी के बीच बातचीत का बेहतर प्रतिनिधित्व होता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 68672&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody&#160; 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 5103</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 25989</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 90810</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Microscopy Software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>&#160;GTX30972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 25 mg</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6335.1</td>
			<td>1:25000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCS antibody dilution 500 mL</td>
			<td>DCS diagnostics</td>
			<td>DCS AL120R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey ant goat Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit AF647</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide rack</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF 3667&#160;</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>MKP-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 37415</td>
			<td>1:2000 and 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml</td>
			<td>Maxvision</td>
			<td>MB-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCamHR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>HMT84M421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 negative control</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0931 Aglient</td>
			<td>1:50 and 1:5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-108-C&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Phosphate buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP staining jar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2292.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 219406</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 172730</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#160;6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Tris buffered saline (x10)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>830476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath rice cooker</td>
			<td>reishunger</td>
			<td>RCP-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet chamber</td>
			<td>Weckert Labortechnik</td>
			<td>600016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Widefield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of neutrophil extracellular traps in human and mouse tissues

न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) बैक्टीरिया के संक्रमण या दर्दनाक ऊतक क्षति की प्रतिक्रिया के रूप में न्यूट्रोफिल द्वारा जारी किए जाते हैं, लेकिन ऑटोइम्यून बीमारियों और बाँझ सूजन में भी भूमिका निभाते हैं। वे डबल-फंसे हुए डीएनए फिलामेंट्स, हिस्टोन और रोगाणुरोधी प्रोटीन से बने वेब जैसी संरचनाएं हैं। एक बार जारी होने के बाद, एनईटी रक्त और ऊतक में बाह्य रोगजनकों को फंसा और मार सकता है। इसके अलावा, एनईटी प्लेटलेट आसंजन और जमावट को उत्तेजित करके होमियोस्टैटिक विनियमन में भाग लेते हैं। हालांकि, एनईटी का अनियमित उत्पादन सेप्सिस या ऑटोइम्यून विकारों सहित विभिन्न बीमारियों से भी जुड़ा हुआ है, जो उन्हें चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक आशाजनक लक्ष्य बनाता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके एनईटी की कल्पना करना वर्तमान में ऊतक में नेट इंटरैक्शन को प्रदर्शित करने के लिए एकमात्र ज्ञात तरीकों में से एक है। इसलिए, एनईटी की कल्पना करने के लिए विभिन्न धुंधला तरीकों का उपयोग किया गया है। साहित्य में, विभिन्न धुंधला प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, और हमने प्रोटोकॉल के बीच उच्च परिवर्तनशीलता दिखाने वाले चार प्रमुख घटकों की पहचान की: (1) उपयोग किए गए एंटीबॉडी के प्रकार, (2) ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंटों का उपयोग, (3) एंटीजन पुनर्प्राप्ति विधियां, और (4) परमेबिलाइजेशन। इसलिए, इन विट्रो इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रजातियों (माउस, मानव) और ऊतकों (त्वचा, आंत, फेफड़े, यकृत, हृदय, रीढ़ की हड्डी की डिस्क) के लिए लागू करने के लिए इस काम में व्यवस्थित रूप से अनुकूलित और सुधार किया गया था। निर्धारण और पैराफिन-एम्बेडिंग के बाद, 3 μm मोटे वर्गों को स्लाइड पर लगाया गया था। इन नमूनों को एक संशोधित धुंधला प्रोटोकॉल के अनुसार मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ), सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 (एच 3 सिट), और न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी से दाग दिया गया था। स्लाइड्स को द्वितीयक एंटीबॉडी से दाग दिया गया था और वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जांच की गई थी। परिणामों का विश्लेषण एक मूल्यांकन शीट के अनुसार किया गया था, और अंतर अर्ध-मात्रात्मक रूप से दर्ज किए गए थे।
यहां, हम विभिन्न ऊतकों के लिए उपयुक्त एक अनुकूलित नेट स्टेनिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हमने एच 3 सीआईटी के लिए दाग लगाने के लिए एक नए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया और ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट के साथ गैर-विशिष्ट धुंधलापन कम कर दिया। इसके अलावा, हमने दिखाया कि नेट धुंधला होने के लिए निरंतर उच्च तापमान और नमूनों की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है।

Neutrophil extracellular traps (NETs) were first visualized by Brinkmann et al. as a pathway of cellular death different from apoptosis and necrosis in 20041. In this pathway, neutrophils release their decondensed chromatin into the extracellular space to form large web-like structures covered in antimicrobial proteins that were formerly stored in the granules or cytosol. These antimicrobial proteins include neutrophil elastase (NE), myeloperoxidase (MPO), and citrullinated histone H3 (H3cit), which are commonly used for indirect immunofluorescence detection of NETs2. This method not only identifies the quantitative presence of these proteins; indeed, it has the advantage of specifically detecting NET-like structures. In the NETs, the mentioned proteins co-localize with extracellular DNA, which can be detected by an overlap of the fluorescence signals of each stained protein and the extracellular DNA. In contrast to the overlapping signals due to extracellular DNA and protein co-localization in NETs, intact neutrophils show no co-localization. Here, the NET components are usually stored separately in the granules, nuclei, and cytosol3.
Since their first discovery, it has been shown that NETs play a central role in numerous diseases, particularly those involving inflammation. NETs show antimicrobial functions during infection through trapping and killing extracellular pathogens in blood and tissue4,5. However, NETs have also been connected to autoimmune diseases and hyperinflammatory responses, like systemic lupus erythematosus, rheumatic arthritis, and allergic asthma6,7,8. NETs promote vaso-occlusion and inflammation in atherosclerosis, platelet adhesion, and are speculated to play a role in metastatic cancer9,10,11. Nevertheless, they are thought to have anti-inflammatory properties by reducing proinflammatory cytokine levels12. While NETs are gaining more interest in a broader field of research, a robust NET detection method is fundamental for future research.
Even though the visualization of NETs in different tissue using immunofluorescence imaging is complex and requires customization, apart from electron microscopy, it is currently one of the most renowned methods for visualizing the interactions between NETs and cells and is predominantly used in formalin-fixed paraffin-embedded tissues (FFPE)13,14. However, comparing NET imaging is difficult, as different laboratories use their own customized protocols. These protocols differ in their use of antibodies, antigen retrieval, or permeabilization method and are often optimized for a specific type of tissue3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.
After Brinkmann et al. published the first methodic study using immunofluorescent visualization of NETs in FFPE tissue, we wanted to optimize this protocol for a wider variety of tissues and species15. Additionally, to establish a broadly applicable immunofluorescence protocol, we tested different modified protocols from studies that used immunofluorescence methods in FFPE tissue to detect NETs3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Furthermore, we tried a new H3cit antibody for more specific extracellular staining28. We hypothesize that by systematically adapting current staining protocols to different species and tissue, in vitro imaging can be improved, resulting in a better representation of the interaction between neutrophils and NETs both locally and systemically.

Author Spotlight: Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues 

मानव और माउस ऊतकों में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

हमारे प्रोटोकॉल अनुकूलन शुरू करने से पहले, हमने एनईटी के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एफएफपीई ऊतक का उपयोग करने वाले अध्ययनों के लिए पबमेड की खोज करके सफल धुंधला होने के लिए महत्वपूर्ण चरणों की पहचान की और ?...

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न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) विभिन्न बीमारियों से जुड़े होते हैं, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग अक्सर उनके विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया जाता है। हालांकि, विभिन्न धुंधला प्रोटोकॉल हैं, और, कई मामलों में, केवल एक प्रकार के ऊतक की जांच की जाती है। यहां, हम माउस और मानव ऊतक में एनईटी को धुंधला करने के लिए आम तौर पर लागू प्रोटोकॉल स्थापित करते हैं।

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

ऊतक इमेजिंग के लिए एंटीबॉडी चयन के बीच, निर्धारण प्रक्रिया एपिटोप मास्किंग द्वारा एक चुनौती है। इसलिए, एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए इन एंटीजन को उजागर करने के लिए अनुकूलित रिट्रीवर चरण की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, ऊतक अंतर्निहित ऑटोफ्लोरेसेंस एक उच्च पृष्ठभूमि धुंधला होने के माध्यम से कठिनाइयों का कारण बन सकता है।हालांकि, साहित्य में प्रोटोकॉल में विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग छवियों के बीच एक मानकीकृत तुलना में बाधा डालता है। हमारे अध्ययन का उद्देश्य मानकीकृत प्रक्रियाओं की मांग को संबोधित करना और इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान चुनौतियों पर काबू पाने में शोधकर्ता की सहायता करना है। हमने विभिन्न अलग-अलग प्रोटोकॉल की तुलना करके विभिन्न ऊतकों पर लागू एक बहुमुखी इमेजिंग प्रोटोकॉल स्थापित किया।इसलिए हमारा काम एंटीबॉडी उपयोग से लेकर नमूना माउंटिंग तक मार्गदर्शन और समस्या निवारण युक्तियां प्रदान करता है, संभावित नुकसान को उजागर करता है। हमारे निष्कर्ष सिट्रूलिनेटेड हिसोन थ्री के लिए एक नया प्राथमिक एंटीबॉडी पेश करके अनुसंधान को आगे बढ़ाते हैं, और पृष्ठभूमि धुंधला पन को कम करने के लिए एक ऑटोफ्लोरोसेंट कम करने वाला एजेंट है। इसके अलावा, सफल इमेजिंग के लिए, हम नमूनों की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग और एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए निरंतर उच्च तापमान बनाए रखने के महत्व पर जोर देते हैं।