Name: Author Spotlight: Functional Site-Directed Fluorometry in native cells to study skeletal muscle exciability
Uploaded: 2023-06-02T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability at JoVE.com

אנו מודים לד"ר ג'יי ורגרה (אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס) על שיתוף פלסמיד הבר מסוג EGFP-CaV1.1 (ארנב). אנו מודים למעבדת האלקטרוניקה של המחלקה לפיזיולוגיה של ייל ובמיוחד להנריק אבילגארד על התכנון והבנייה של הפוטודיודה עם מעגל מסילה והחזקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01-AR075726 ו- R01-NS103777

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מרילנד. הפרוטוקול הבא חולק למספר תת-סעיפים, המורכבים (1) תכנון מבנה מולקולרי ובחירת צבע מגיב ציסטאין, (2) אלקטרופורציה in vivo , (3) דיסקציה של שרירים ובידוד סיבים, (4) תיאור מערך רכישה, (5) הערכה של חלבון פלואורסצנטי יר...

פלואורומטריה תפקודית מכוונת אתר בתאי שריר שלד מקומיים

כאן מתואר פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע FSDF בסיבי שריר לחקר תנועות חיישן מתח בודדות מערוץ CaV1.1. למרות שמספר השלבים ומגוון הגישות המשולבות בטכניקה זו עשויים להיראות מורכבים, רוב הטכניקות הללו משמשות לעתים קרובות באופן שגרתי במעבדות ביופיזיקאיות / ביולוגיות של התא. לפיכך, המורכבות לכאורה...

היכולת לעקוב אחר סידורים קונפורמטיביים של תעלות יונים בתגובה לגירוי חשמלי ידוע בתא חי היא מקור למידע רב ערך עבור פיזיולוגיה מולקולרית1. תעלות יונים מגודרות מתח הן חלבוני ממברנה החשים שינויים במתח הטרנסממברנלי, ותפקידם מושפע גם משינויי מתח2. התפתחות טכניקות מהדק מתח במאה הקודמת אפשרה לפיזיולוגים לחקור, בזמן אמת, זרמים יוניים הנישאים על ידי תעלות יונים מגודרות מתח בתגובה לדפולריזציה של הממברנה3. השימוש בטכנולוגיית מהדק מתח היה חיוני להבנת התכונות החשמליות של תאים מעוררים כגון נוירונים ושרירים. בשנות ה-70 של המאה ה-20, עידון מהדק המתח איפשר זיהוי זרמי גאטינג (או תנועת מטען) בתעלות סידן מגודרות מתח (Ca V) ונתרן (NaV) 4,5. זרמי גאטינג הם זרמים קיבוליים לא ליניאריים הנובעים מתנועת חיישני מתח בתגובה לשינויים בשדה החשמלי על פני קרום התא6. זרמי גאטינג נחשבים לביטוי חשמלי של סידורים מולקולריים המקדימים או מלווים את פתיחת תעלת היונים7. בעוד מדידות זרם אלה מספקות מידע רב ערך לגבי תפקוד הערוץ, הן זרמים יוניים והן זרמי גטינג הם קריאות עקיפות של סידורים קונפורמטיביים בין-מולקולריים ותוך-מולקולריים של תעלות מגודרות מתח7.
פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר (FSDF; מכונה גם פלואורומטריית מהדק מתח, VCF) פותחה בתחילת שנות התשעים8 וסיפקה לראשונה את היכולת לצפות ישירות בשינויים קונפורמטיביים מקומיים ואת תפקודו של חלבון ערוץ בזמן אמת. באמצעות שילוב של מוטגנזה של תעלות, אלקטרופיזיולוגיה ומערכות ביטוי הטרולוגיות, ניתן לתייג ולעקוב באופן פלואורסצנטי אחר החלקים הנעים של ערוצים או קולטנים ספציפיים בתגובה לגירוי המפעיל 9,10. גישה זו שימשה באופן נרחב לחקר מנגנוני חישת המתח בתעלות יונים מגודרות מתח 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. לקבלת סקירות סמכותיות, ראה 10,20,21,22,23.
תעלות Ca V ו-NaV, הקריטיות להפעלה והתפשטות של אותות חשמליים, מורכבות מתת-יחידה ראשית α1, בעלת נקבובית מרכזית וארבעה תחומי חישת מתח לא זהים2. בנוסף למבנה הראשוני הייחודי שלהם, ערוצי Ca V ו- NaV מבוטאים כקומפלקסים מרובי יחידות עם יחידות משנה עזר24. תעלות אשלגן תלויות מתח (K V) מורכבות מארבע תת-יחידות שנראות כמו תחום אחד של Na V או CaV25. תת-היחידה α1 יוצרת נקבוביות וחישת מתח של תעלות Ca V ו-NaV נוצרת על ידי קידוד פוליפפטיד יחיד עבור ארבעה תחומים נפרדים של שישה מקטעים טרנסממברנליים ייחודיים (S1-S6; איור 1A) 24,26. האזור המורכב ממקטעי טרנסממברנה S1 עד S4 יוצרים את תחום חישת המתח (VSD) ומקטעי טרנסממברנה S5 ו-S6 יוצרים את תחום הנקבוביות26. בכל VSD, סליל α S4 מכיל ארגינין או ליזין בעלי מטען חיובי (איור 1A,B) שנעים בתגובה לדפולריזציה של הממברנה7. כמה עשורים של מחקר ותוצאות מגישות ניסיוניות מגוונות ביותר תומכות בהנחה שמקטעי S4 נעים החוצה ויוצרים זרמי גטינג, בתגובה לדפולריזציה של הממברנה6.
FSDF מודד את השינויים הפלואורסצנטיים של צבע תגובתי תיול המצומד לשאריות ציסטאין ספציפיות (כלומר, סליל α S4) על תעלת יונים או חלבון אחר, שהונדסו באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר, כאשר התעלה מתפקדת בתגובה לדפולריזציה של הממברנה או גירויים אחרים10. למעשה, FSDF פותח במקור כדי לחקור אם מקטע S4 בערוצי KV, שהוצע להיות חיישן המתח העיקרי של הערוץ, נע כאשר מטעני הגאטינג נעים בתגובה לשינויים בפוטנציאל הממברנה 8,10. במקרה של תעלות יונים מגודרות מתח, FSDF יכול לפתור סידורים קונפורמטיביים עצמאיים של ארבעת ה-VSD (מעקב אחר VSD אחד בכל זמן נתון), במקביל למדידות של פונקציית הערוץ. ואכן, באמצעות גישה זו, הוכח כי VSDs בודדים נראים מעורבים באופן דיפרנציאלי בהיבטים ספציפיים של הפעלת ערוץ והשבתה 12,27,28,29,30. זיהוי התרומה של כל VSD לתפקוד הערוצים הוא בעל רלוונטיות גבוהה וניתן להשתמש בו כדי להבהיר עוד יותר את פעולת הערוץ ואולי לזהות מטרות חדשות לפיתוח תרופות.
השימוש ב-FSDF במערכות ביטוי הטרולוגיות סייע רבות בקידום הבנתנו את תפקוד הערוץ מנקודת מבט רדוקציוניסטית10,23. כמו גישות רדוקציוניסטיות רבות, היא מציגה יתרונות אך יש לה גם מגבלות. לדוגמה, מגבלה עיקרית אחת היא בנייה מחדש חלקית של סביבת ננו התעלה במערכת ההטרולוגית. לעתים קרובות, תעלות יונים מתקשרות עם תת-יחידות עזר רבות וחלבונים רבים אחרים המשנים את תפקידם31. באופן עקרוני, תעלות שונות ותת-היחידות הנלוות שלהן יכולות לבוא לידי ביטוי במערכות הטרולוגיות תוך שימוש במבני קידוד חלבונים מרובים או פלסמידים פוליציסטרוניים, אך לא ניתן לשחזר את סביבתם הטבעית במלואה30,32.
הקבוצה שלנו פרסמה לאחרונה גרסה של FSDF בסיבי שריר שלד מנותקים טבעיים לחקר השלבים המוקדמים של צימוד עירור-כיווץ (ECC)33,34, התהליך שבו דפולריזציה חשמלית של סיבי שריר קשורה להפעלת כיווץ שריר 35,36. בפעם הראשונה, גישה זו אפשרה מעקב תנועה של חיישני מתח S4 בודדים מערוץ Ca2+ מגודר מתח מסוג L (CaV1.1, הידוע גם בשם DHPR) בסביבה הטבעית של סיב שריר מובחןבוגר 37. מטרה זו הושגה על ידי התחשבות במאפיינים רבים של סוג תא זה, כולל הפעילות החשמלית של התא המאפשרת דפולריזציה מהירה המושרה על ידי גירוי עצמי, היכולת לבטא פלסמיד cDNA באמצעות אלקטרופורציה in vivo, הביטוי הגבוה הטבעי והארגון המידור של התעלות בתוך התא, והתאמתו למכשירי הדמיה והקלטה אלקטרופיזיולוגית במהירות גבוהה. בעבר, השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת קווים במהירות גבוהה כמכשיר גילוי37. כעת, וריאציה של הטכניקה מוצגת באמצעות פוטודיודה לקליטת אותות. מערכת זיהוי מבוססת פוטודיודות זו יכולה להקל על יישום טכניקה זו במעבדות אחרות.
כאן מתואר פרוטוקול שלב אחר שלב לניצול FSDF בתאים מקוריים לחקר תנועת חיישן מתח בודד מ- CaV1.1. בעוד ערוץ CaV1.1 שימש כדוגמה לאורך כל כתב היד הזה, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על תחומים נגישים מחוץ לתא של תעלות יונים אחרות, קולטנים, או חלבונים פני השטח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>H3884-50mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EP022363719-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z683531-100EA</td>
			<td>tuberculine slip tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2&#8221; long 29-gauge sterile insulin needle and syringe</td>
			<td>Becton Dikinson</td>
			<td>324702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm non coated plastic plate</td>
			<td>Falcon, Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm non coated plastic plate</td>
			<td>Falcon, Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcoholic whip</td>
			<td>PDI</td>
			<td>B60307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-533 cube LP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49907</td>
			<td>Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arc lamp</td>
			<td>Sutter Instrumets</td>
			<td>LB-LS 672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears cream</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>203895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type I</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>C0130-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-76048-960-BG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double electrode array&#160; (for electroporation)</td>
			<td>BTX harvard apparatus</td>
			<td>45-0120</td>
			<td>10mm 2 needle array tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39002AT</td>
			<td>Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation apparatus device</td>
			<td>BTX harvard apparatus</td>
			<td>ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC10</td>
			<td>HEKA Elektronik GmbH&#160; (Harvard Bioscience)</td>
			<td>895000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biotechne,&#160; R&#38;D Systems</td>
			<td>RND-S11150H</td>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass coverslip 35 mm dish</td>
			<td>MatTek Life Science</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation</td>
			<td>502017-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal heating pad</td>
			<td>Braintree scientific inc</td>
			<td>39DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>INV-23017015</td>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 530 nm</td>
			<td>Sutter Instrumets</td>
			<td>5A-530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding protein 0.2 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Pall</td>
			<td>FG4579</td>
			<td>acrodisk&#160; syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>INV-11380037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS-5-TAMRA</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>89410-784</td>
			<td>MTS-5-TAMRA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro Analysis Software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>OriginPro 2022 (64-bit) SR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo 60x oil&#160; 1.4 N.A/&#8734;/0.17</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BFPC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>267228-1G</td>
			<td>To manufacyte field stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Pulsemaster A300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter drive controller</td>
			<td>Uniblitz</td>
			<td>100-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttter</td>
			<td>Uniblitz</td>
			<td>VS2582T0-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>INV-11380037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>DSI-B1623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1419447-1198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer for Anesthesia</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>V3000PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional site-directed fluorometry in native cells to study skeletal muscle excitability

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר הייתה הטכניקה הנבחרת לחקור את יחסי מבנה-פונקציה של חלבוני ממברנה רבים, כולל תעלות יונים מגודרות מתח. גישה זו שימשה בעיקר במערכות ביטוי הטרולוגיות כדי למדוד בו זמנית זרמי ממברנה, את הביטוי החשמלי של פעילות התעלות, ומדידות פלואורסצנטיות, המדווחות על סידורים מחדש של תחומים מקומיים. פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר משלבת אלקטרופיזיולוגיה, ביולוגיה מולקולרית, כימיה ופלואורסצנטיות לטכניקה רחבה אחת המאפשרת לחקור סידורים מבניים בזמן אמת ותפקוד באמצעות פלואורסצנטיות ואלקטרופיזיולוגיה, בהתאמה. בדרך כלל, גישה זו דורשת תעלת ממברנה מגודרת מתח מהונדסת המכילה ציסטאין שניתן לבדוק על ידי צבע פלואורסצנטי תגובתי תיול. עד לאחרונה, הכימיה הריאקטיבית של תיול המשמשת לתיוג פלואורסצנטי מכוון אתר של חלבונים בוצעה אך ורק בביציות ובקווי תאים של קסנופוס , מה שהגביל את היקף הגישה לתאים ראשוניים שאינם מעוררים. דו"ח זה מתאר את היישום של פלואורומטריה תפקודית מכוונת אתר בתאי שרירי שלד בוגרים כדי לחקור את השלבים המוקדמים של צימוד עירור-כיווץ, התהליך שבו דפולריזציה חשמלית של סיבי שריר קשורה להפעלת התכווצות שרירים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המתודולוגיות לתכנון והעברה של תעלות Ca2+ מגודרות מתח מהונדסות ציסטאין (CaV1.1) לסיבי שריר של flexor digitorum brevis של עכברים בוגרים באמצעות אלקטרופורציה in vivo ואת השלבים הבאים הדרושים למדידות פלואורומטריה פונקציונאליות מכוונות אתר. גישה זו יכולה להיות מותאמת לחקר תעלות יונים וחלבונים אחרים. השימוש בפלאורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר של שרירי יונקים רלוונטי במיוחד לחקר מנגנונים בסיסיים של עוררות.

The ability to track ion channel conformational rearrangements in response to a known electrical stimulus in a living cell is a source of valuable information for molecular physiology1. Voltage-gated ion channels are membrane proteins that sense changes in transmembrane voltage, and their function is also affected by voltage changes2. The development of voltage clamp techniques in the last century allowed physiologists to study, in real-time, ionic currents carried by voltage-gated ion channels in response to membrane depolarization3. The use of voltage clamp technology has been crucial in understanding the electrical properties of excitable cells such as neurons and muscle. In the 1970s, voltage clamp refinement allowed for the detection of gating currents (or charge movement) in voltage-gated calcium (CaV) and sodium (NaV) channels4,5. Gating currents are non-linear capacitive currents that arise from the movement of voltage sensors in response to changes in the electric field across the cell membrane6. Gating currents are considered an electrical manifestation of molecular rearrangements that precede or accompany ion channel opening7. While these current measurements provide valuable information regarding the channel&#39;s function, both ionic currents and gating currents are indirect readouts of inter- and intra-molecular conformational rearrangements of voltage-gated channels7.
Functional site-directed fluorometry (FSDF; also referred to as voltage clamp fluorometry, VCF) was developed in the early 1990s8 and, for the first time, provided the ability to directly view local conformational changes and the function of a channel protein in real time. Using a combination of channel mutagenesis, electrophysiology, and heterologous expression systems, it is possible to fluorescently tag and track the moving parts of specific channels or receptors in response to the activating stimulus9,10. This approach has been extensively used to study the voltage-sensing mechanisms in voltage-gated ion channels8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. For authoritative reviews, see10,20,21,22,23.
The CaV and NaV channels, critical for the initiation and propagation of electrical signals, are composed of a main &#945;1 subunit, which possesses a central pore and four non-identical voltage sensing domains2. In addition to their distinct primary structure, CaV and NaV channels are expressed as multisubunit complexes with auxiliary subunits24. Voltage-dependent potassium channels (KV) consist of four subunits that look like a single domain of NaV or CaV25. The pore-forming and voltage-sensing &#945;1 subunit of CaV and NaV channels is formed by a single polypeptide coding for four individual domains of six unique transmembrane segments (S1-S6; Figure 1A)24,26. The region comprised by S1 to S4 transmembrane segments form the voltage sensing domain (VSD) and S5 and S6 transmembrane segments form the pore domain26. In each VSD, the S4 &#945;-helix contains positively charged arginine or lysine (Figure 1A,B) that move in response to membrane depolarization7. Several decades of research and the results from highly diverse experimental approaches support the premise that S4 segments move outward, generating gating currents, in response to membrane depolarization6.
FSDF measures the fluorescence changes of a thiol-reactive dye conjugated to a specific cysteine residue (i.e., the S4 &#945;-helix) on an ion channel or other protein, engineered via site-directed mutagenesis, as the channel functions in response to membrane depolarization or other stimuli10. In fact, FSDF was originally developed to investigate whether the S4 segment in KV channels, proposed to be the main voltage sensor of the channel, moves when the gating charges move in response to changes in membrane potential8,10. In case of voltage-gated ion channels, FSDF can resolve independent conformational rearrangements of the four VSDs (tracking one VSD at any given time), concurrently with channel function measurements. Indeed, using this approach, it has been shown that individual VSDs appear to be differentially involved in specific aspects of channel activation and inactivation12,27,28,29,30. Identifying the contribution of each VSD to the channels&#39; function is of high relevance and can be used to further elucidate channel operation and potentially identify new targets for drug development.
The use of FSDF in heterologous expression systems has been extremely helpful in furthering our understanding of channel function from a reductionist perspective10,23. Like many reductionist approaches, it presents advantages but also has limitations. For instance, one major limitation is the partial reconstitution of the channel nano environment in the heterologous system. Often, ion channels interact with numerous accessory subunits and numerous other proteins that modify their function31. In principle, different channels and their accessory subunits can be expressed in heterologous systems with the use of multiple protein coding constructs or polycistronic plasmids, but their native environment cannot be fully reconstituted30,32.
Our group recently published a variant of FSDF in native dissociated skeletal muscle fibers for the study of early steps of excitation-contraction coupling (ECC)33,34, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction35,36. For the first time, this approach allowed the motion tracking of individual S4 voltage-sensors from the voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.1, also known as DHPR) in the native environment of an adult differentiated muscle fiber37. This was accomplished by considering multiple characteristics of this cell type, including the electrical activity of the cell allowing fast stimulation-induced self-propagated depolarization, the ability to express cDNA plasmid through in vivo electroporation, the natural high expression and compartmental organization of the channels within the cell, and its compatibility with high-speed imaging and electrophysiological recording devices. Previously, we used a high-speed line scanning confocal microscope as a detecting device37. Now, a variation of the technique is presented using a photodiode for signal acquisition. This photodiode-based detection system could facilitate the implementation of this technique in other laboratories.
Here, a step-by-step protocol to utilize FSDF in native cells for the study of individual voltage-sensor movement from CaV1.1 is described. While the CaV1.1 channel has been used as an example throughout this manuscript, this technique could be applied to extracellularly accessible domains of other ion channels, receptors, or surface proteins.

Author Spotlight: Functional Site-Directed Fluorometry in native cells to study skeletal muscle exciability  

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

CaV1.1, a member of the voltage-gated ion channels, has four distinct voltage sensors. Evidence suggests that some voltage sensors contribute more to ryanodine receptor activation or calcium current. We aim to be able to identify the precise role of each voltage sensor in excitation-contraction coupling and calcium channel activation.Excitation-contraction coupling has been studied since the early 50s, yet the molecular detail of how this process occur are still unknown. Recent advance in cyro-electron microscopic structure of the channel, the characterization of novel CaV1.1 accessory protein, the discovery of channel alternative splicing variant, and the identification of disease-causing mutation have reignited the interest in this field. Many techniques are used in our field, from classical electrophysiology and molecular biology to more novel techniques such as cryo-electron microscopy, molecular dynamic simulation, targeted protein degradation, and functional site-directed fluorometry as well as engineered cells or animal models.Currently, the fuel faces several experimental challenges. In a skeletal muscle, proper trafficking and communication between CaV1.1 and RyR1, along with many regulatory proteins, is crucial to support excitation-contraction coupling. The methods to directly study these protein-protein interactions between CaV1.1 and RyR1 are missing or incomplete.The laboratory of Dr.Martin Schneider has been working on excitation-contraction coupling for decades, characterizing voltage-sensing mechanisms in CaV1.1, calcium release, and localized calcium-release events, known as calcium sparks. Recently, our laboratory has been implementing new optical techniques to investigate various steps of excitation-contraction coupling and voltage sensor motion in functioning adult muscle cells. While this has been done previously in a heterologous expression system, our protocol now allows tracking conformational changes in CaV1.1 voltage sensors during a propagated action potential in his native environment.Our new technique will allow us to investigate the precise movement of the voltage sensor needed for excitation-contraction coupling. We want to know which charge residue in each S4 are critical for its function, or exactly each S4 translocate, and all that's translocation is linked to CaV1.1 opening or ryanodine receptor activation.

כאשר פוטנציאלי פעולה מתפשטים מופעלים בתגובה לגירוי שדה חוזר, ניתן לעקוב אחר תנועת חיישן מתח ספציפי בתגובה לתדר מסוים של דפולריזציה. כפי שניתן לראות באיור 6A, ניתן לעקוב אחר התנועה של סלילים מתויגים VSD-II בתגובה לכל אחד משני דה-פולריזמים עוקבים המופעלים ב-10 הרץ (כלומר, ברווח של...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability at JoVE.com

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר היא שיטה לחקר תנועות תחום החלבונים בזמן אמת. שינוי טכניקה זו ליישומה בתאים מקומיים מאפשר כעת זיהוי ומעקב אחר תנועות חיישן מתח יחיד מתעלות Ca2+ מגודרות מתח בסיבי שריר שלד מבודדים.

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

CaV1.1, חבר בתעלות היונים מגודרות המתח, כולל ארבעה חיישני מתח נפרדים. ראיות מצביעות על כך שחיישני מתח מסוימים תורמים יותר להפעלת קולטן ריאנודין או לזרם סידן. אנו שואפים להיות מסוגלים לזהות את התפקיד המדויק של כל חיישן מתח בצימוד עירור-התכווצות והפעלת תעלת סידן.צימוד עירור-התכווצות נחקר מאז תחילת שנות ה-50, אך הפרטים המולקולריים של האופן שבו תהליך זה מתרחש עדיין אינם ידועים. ההתקדמות האחרונה במבנה המיקרוסקופי של הצירו-אלקטרונים של התעלה, אפיון חלבון העזר CaV1.1 החדש, גילוי גרסת השחבור החלופית של התעלה וזיהוי מוטציות גורמות למחלות הציתו מחדש את העניין בתחום זה. טכניקות רבות משמשות בתחום שלנו, החל מאלקטרופיזיולוגיה קלאסית וביולוגיה מולקולרית ועד טכניקות חדשניות יותר כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים, סימולציה דינמית מולקולרית, פירוק חלבונים ממוקד ופלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר, כמו גם תאים מהונדסים או מודלים של בעלי חיים.נכון לעכשיו, הדלק עומד בפני מספר אתגרים ניסיוניים. בשרירי שלד, תנועה נכונה ותקשורת בין CaV1.1 ו-RyR1, יחד עם חלבונים רגולטוריים רבים, חיוניים לתמיכה בצימוד עירור-כיווץ. השיטות לחקור ישירות אינטראקציות חלבון-חלבון אלה בין CaV1.1 ו- RyR1 חסרות או חלקיות.מעבדתו של ד"ר מרטין שניידר עובדת על צימוד עירור-התכווצות מזה עשרות שנים, ומאפיינת מנגנוני חישת מתח ב- CaV1.1, שחרור סידן ואירועי שחרור סידן מקומיים, המכונים ניצוצות סידן. לאחרונה, המעבדה שלנו מיישמת טכניקות אופטיות חדשות כדי לחקור שלבים שונים של צימוד עירור-כיווץ ותנועת חיישן מתח בתאי שריר בוגרים מתפקדים. בעוד שזה נעשה בעבר במערכת ביטוי הטרולוגית, הפרוטוקול שלנו מאפשר כעת לעקוב אחר שינויים קונפורמטיביים בחיישני מתח CaV1.1 במהלך פוטנציאל פעולה מופץ בסביבה הטבעית שלו.הטכניקה החדשה שלנו תאפשר לנו לחקור את התנועה המדויקת של חיישן המתח הדרוש לצימוד עירור-כיווץ. אנו רוצים לדעת אילו שאריות מטען בכל S4 הן קריטיות לתפקודו, או בדיוק כל טרנסלוקציה של S4, וכל הטרנסלוקציה קשורה לפתיחת CaV1.1 או להפעלת קולטן ריאנודין.

functional-site-directed-fluorometry-native-cells-to-study-skeletal

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, including voltage-gated ion channels. This approach has been used primarily in heterologous expression systems to simultaneously measure membrane currents, the electrical manifestation of the channels&#39; activity, and fluorescence measurements, reporting local domain rearrangements. Functional site-directed fluorometry combines electrophysiology, molecular biology, chemistry, and fluorescence into a single wide-ranging technique that permits the study of real-time structural rearrangements and function through fluorescence and electrophysiology, respectively. Typically, this approach requires an engineered voltage-gated membrane channel that contains a cysteine that can be tested by a thiol-reactive fluorescent dye. Until recently, the thiol-reactive chemistry used for the site-directed fluorescent labeling of proteins was carried out exclusively in Xenopus oocytes and cell lines, restricting the scope of the approach to primary non-excitable cells. This report describes the applicability of functional site-directed fluorometry in adult skeletal muscle cells to study the early steps of excitation-contraction coupling, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction. The present protocol describes the methodologies to design and transfect cysteine-engineered voltage-gated Ca2+ channels (CaV1.1) into muscle fibers of the flexor digitorum brevis of adult mice using in vivo electroporation and the subsequent steps required for functional site-directed fluorometry measurements. This approach can be adapted to study other ion channels and proteins. The use of functional site-directed fluorometry of mammalian muscle is particularly relevant to studying basic mechanisms of excitability.

Functional site-directed fluorometry is a method to study protein domain motions in real time. Modification of this technique for its application in native cells now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+ channels in murine isolated skeletal muscle fibers.

Construct Design for Transfecting Cysteine-Engineered Voltage-Gated Ca2+ Channels in Murine Isolated Skeletal Muscle Fibers

Construct Design for Transfecting Cysteine-Engineered Voltage-Gated Ca2+ Channels in Murine Isolated Skeletal Muscle Fibers  

To begin, generate a wild-type, fluorescently-tagged CaV1.1 CDNA construct. Here, a plasmid coating for the enhanced green fluorescent protein or EGFP-tagged alpha subunit of rabbit Cav1.1 is used. The presence of the cytomegalovirus promoter allows strong transfection efficiency in muscle fibers.Introduce cystine substitution in the channel that would be tracked with fluorometry using a commercially available, site-directed mutagenesis kit. Here the cysteines are inserted at a position corresponding to the membrane extracellular interface of one of the four S4 of the channel. With the help of GFP observation and ionic current recording, confirm that neither the inserted cysteines nor the presence thiol-reactive dye impacts the voltage dependence and the conductance of the channel.