Name: Author Spotlight: Balancing Speed, Cost, and Accuracy in Neutrophil Function Assessment with NeutroFun Screen Protocol
Uploaded: 2024-02-09T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Balancing Speed, Cost, and Accuracy in Neutrophil Function Assessment with NeutroFun Screen Protocol at JoVE.com

Forfatterne anerkender følgende finansieringsorganer: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP og FINATEC.

Alle eksperimenter fulgte nøje de etiske retningslinjer, der blev fastsat af det institutionelle gennemgangsudvalg ved University of Brasilia (proces 13364819.0.0000.5558), og prøver blev identificeret med koder for at sikre donoranonymitet. Cellerne blev opnået fra normale raske mandlige donorer i alderen 18-35 år, som underskrev det informerede samtykke og opfyldte følgende kvalifikationskriterier: ikke-rygere / dampere, ingen kroniske helbredstilstande og ingen historie med inflammatoriske tilstande i de sidste 1...

Neutrophil Functional Assays for Screening Different Signaling Pathways

Neutrofiler er meget dynamiske og lydhøre celler, der er kortvarige og endnu ikke kan kryopræserveres19, hvilket gør undersøgelser af deres biologi udfordrende. Derfor er det vigtigt at følge omhyggelige trin for at opnå levedygtige, berigede og hvilende neutrofiler 11,20. Denne undersøgelse anvendte en tæthedsbaseret isolationsteknik, der understreger blid og minimal manipulation samt brugen af lave temperaturer indtil aktiverings...

Neutrofiler er de mest rigelige medfødte immunceller i humant blod og er kendt for at spille en vigtig rolle i infektion og betændelse, idet de er de første respondenter, der ankommer til stedet for vævsskade1. I de senere år har der været en voksende anerkendelse af den afgørende rolle, som neutrofiler spiller i en række sygdomme og i at støtte homeostase2. Neutrofiler har ikke kun stramt reguleret signalering selv, men deltager også i reguleringen af andre komponenter i immunsystemet 3,4,5. Derfor er det bydende nødvendigt at undersøge neutrofiler og deres mange usædvanlige cellulære funktioner, såsom kemotaxis, omvendt migration6, fagocytose7, respiratorisk burst8 og frigivelse af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs)7, i adskillige forskningssammenhænge, hvor det er nødvendigt at vurdere de potentielle neutrofile funktionelle, morfologiske eller molekylære ændringer udløst af specifikke forhold under analyse.
Frisk isolerede neutrofiler er terminalt differentierede, kortvarige, meget dynamiske og let aktiverede9. Imidlertid er der endnu ikke opnået en effektiv lagringsmetode, der ikke påvirker neutrofilresponserne, hvilket gør det udfordrende at udføre flere assays, der skal være uafbrudte. Desuden er tidligere beskrevne funktionelle analyser 10,11, baseret på assays, der kræver cytometri og / eller fluorescerende farvning, muligvis ikke et levedygtigt valg, når en bred og indledende evaluering af neutrofilen er nødvendig.
For at løse disse problemer beskriver denne protokol et sæt tests, der kan udføres efter en enkelt isolationsproces, herunder evaluering af cellelevedygtighed, produktion af reaktive iltarter (ROS), migration i realtid og fagocytose af Saccharomyces cerevisiae, hvis resultater kan bruges til at begrunde dybdegående opfølgningsundersøgelser. Denne procedure, kaldet NeutroFun Screen, blev designet til at omfatte de førende effektoraktiviteter, undtagen degranulering, og kan afsluttes i en gennemsnitlig tid på 4 timer, inklusive 1 times aktivering. Derudover kan de resterende celler bruges til mere detaljerede tilgange som omics-undersøgelser. Fordelen ved denne metode ligger i dens balance mellem hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed.
Desuden er der en måde, hvorpå man let kan observere et foreløbigt forslag om NET'er uden specifikke markører, men nok til at indikere, om yderligere bestræbelser i den retning ville være umagen værd. Mangfoldigheden af testede funktioner sigter mod at kombinere fælles punkter blandt test, hvilket reducerer analysetiden og omkostningerne. Hovedformålet med denne metode er at give en afbalanceret, funktionel analyse vedrørende hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed, der giver mulighed for et overblik over neutrofilens respons, hvilket gør det til et nyttigt indledende skridt i undersøgelsen af virkningerne af nye stimuli på neutrofiler med normal densitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CIM-Plate 16</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>5665825001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLARIOstar Plate Reader&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>US Patent Number 9,733,124 
			Product details: MARS Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Din&#226;mica</td>
			<td>1582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>DN 25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast panoptic stain</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td>620529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Exacta</td>
			<td>7102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>55037C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Blau</td>
			<td>&#160;7896014655229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow cabinet</td>
			<td>Veco</td>
			<td>VLFS-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415501-0101-002</td>
			<td>Product details: Primostar 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing Block</td>
			<td>BIOER</td>
			<td>MB-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved bright-lined</td>
			<td>New Optik</td>
			<td>1110000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium</td>
			<td>Neon</td>
			<td>CAS 298-83-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17089101</td>
			<td>separation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTOFIX 32 A</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae</td>
			<td>Fleischmann</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>50240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1313-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Vetec</td>
			<td>C.I. 23850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td>0K-0500-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a set of screening techniques for a quick overview of the neutrophil function

Neutrofiler er kendt som en af de første forsvarslinjer i det medfødte immunrespons og kan udføre mange særlige cellulære funktioner, såsom kemotaxis, omvendt migration, fagocytose, degranulering af cytotoksiske enzymer og metabolitter og frigivelse af DNA som neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er). Neutrofiler har ikke kun stramt reguleret signalering selv, men deltager også i reguleringen af andre komponenter i immunsystemet. Da friske neutrofiler er terminalt differentierede, kortvarige og meget variable blandt individer, er det vigtigt at få mest muligt ud af de indsamlede prøver. Forskere har ofte brug for at udføre screeningsanalyser for at vurdere et overblik over de mange neutrofile funktioner, der kan påvirkes af specifikke forhold under evaluering. Et sæt tests efter en enkelt isolationsproces af neutrofiler med normal densitet blev udviklet for at imødekomme dette behov og søge en balance mellem hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed. Resultaterne kan bruges til at ræsonnere og vejlede dybdegående opfølgningsundersøgelser. Denne procedure kan udføres i en gennemsnitlig tid på 4 timer og inkluderer evaluering af cellelevedygtighed, produktion af reaktive iltarter (ROS), migration i realtid og fagocytose af gær på glasglas, hvilket efterlader nok celler til mere detaljerede tilgange som omics-undersøgelser. Desuden omfatter proceduren en måde til let at observere et foreløbigt forslag til NET'er efter hurtig panoptisk farvning observeret ved lysmikroskopi med mangel på specifikke markører, omend nok til at indikere, om yderligere bestræbelser på denne måde ville være umagen værd. Mangfoldigheden af testede funktioner kombinerer fælles punkter blandt test, hvilket reducerer analysetiden og udgifterne. Proceduren blev navngivet NeutroFun Screen, og selvom den har begrænsninger, balancerer den de førnævnte faktorer. Desuden er formålet med dette arbejde ikke et bestemt testsæt, men snarere en retningslinje, der let kan tilpasses det enkelte laboratoriums ressourcer og krav.

Neutrophils are the most abundant innate immune cells in human blood and are known to play a major part in infection and inflammation, being the first responders to arrive at the site of tissue damage1. In recent years, there has been a growing recognition of the crucial role that neutrophils play in a variety of diseases and in supporting homeostasis2. Neutrophils not only have tightly regulated signaling themselves, but also participate in the regulation of other components of the immune system3,4,5. Therefore, investigating neutrophils and their many unusual cellular functions, such as chemotaxis, reverse migration6, phagocytosis7, respiratory burst8, and the release of neutrophil extracellular traps (NETs)7, is imperative in numerous research contexts where it is necessary to assess the potential neutrophil functional, morphological, or molecular changes triggered by specific conditions under analysis.
Freshly isolated neutrophils are terminally differentiated, short-lived, highly dynamic, and easily activated9. However, an efficient storage method that does not affect the neutrophil responses has not yet been achieved, making it challenging to perform multiple assays that must be uninterrupted. Furthermore, previously described functional analyses10,11, based on assays that require cytometry and/or fluorescent staining, may not be a viable choice when a broad and initial evaluation of the neutrophil is needed.
To address these issues, this protocol describes a set of tests that can be carried out following a single isolation process, including the evaluation of cell viability, reactive oxygen species (ROS) production, real-time migration, and phagocytosis of Saccharomyces cerevisiae, whose results can be used to reason in-depth follow-up studies. This procedure, named NeutroFun Screen, was designed to encompass the leading effector activities, except degranulation, and can be completed in an average time of 4 h, including 1 h of activation. Additionally, the remaining cells can be used for more detailed approaches like omics studies. The advantage of this method lies in its balance between speed, comprehensiveness, cost, and accuracy.
Furthermore, there is a way to easily observe a preliminary suggestion of NETs, without specific markers, but enough to indicate if further efforts in that direction would be worthwhile. The diversity of functions tested aims to combine common points among tests, reducing the analysis time and expenses. The main goal of this method is to provide a balanced, functional analysis regarding speed, comprehensiveness, cost, and accuracy that allows for an overview of the neutrophil&#39;s response, making it a useful initial step in investigating the effects of novel stimuli on normal density neutrophils.

Author Spotlight: Balancing Speed, Cost, and Accuracy in Neutrophil Function Assessment with NeutroFun Screen Protocol 

Et sæt screeningsteknikker til et hurtigt overblik over neutrofilfunktionen

Den tæthedsbaserede isolationsmetode, der blev anvendt i denne undersøgelse (figur 1), opfyldte kriterierne for de foreslåede eksperimenter. Neutrofile parametre opnået fra denne metode omfattede levedygtighed ≥98%, renhed ≥94% og celleudbytte ≥1,5 x 107, uden aktivering detekterbar ved screeningstestene. To relevante trin i isoleringen af PMN'er er antikoagulation og fjernelse af RBC. At holde det antikoagulerede blodrør eller sprøjte ved en blid rocking, før lagdeli...

Watch this Scientific Journal Video about Balancing Speed, Cost, and Accuracy in Neutrophil Function Assessment with NeutroFun Screen Protocol at JoVE.com

Denne protokol indeholder et sæt neutrofile funktionelle assays, der skal bruges som screeningsmetode til at dække funktioner fra forskellige signalveje. Protokollen indeholder en indledende og enkel evaluering af cellelevedygtighed, renhed, produktion af reaktive iltarter, realtidsmigration, fagocytose og et foreløbigt forslag til neutrofile ekstracellulære fælder.

Neutrophils are known as one of the first lines of defense in the innate immune response and can perform many particular cellular functions, such as ...

NeutroFun Screen Protocol giver en gruppe funktionelle tests, der bruger billige kemikalier og kan udføres i et enkelt eksperiment fra friske neutrofiler. Dette muliggør en foreløbig evaluering af nogle større neutrofile funktioner til at guide mere besværlige og dyre opfølgningsundersøgelser. Neutrofil forskning anvender forskellige modulationsbetingelser.Såsom cytokiner, peptider, mikrobielle produkter og fysiske stimuli. Derudover analyserer flowcytometri, multiomics, mikrofluidiske enheder og immuncytokemi. Det omfattende mærke af betingelser og analyser, der anvendes i kombination, gør arbejdsgangen for neutrofilforskning lang, besværlig og dyr.Typisk i disse reduktioner, antallet af testede betingelser eller antallet af udførte tests, kræver de nuværende avancerede metoder omfattende konfigurerbare, mange celler og langvarige forberedelsesprocedurer. Vores protokol NeutroFun Screen tilbyder en hurtigere og mere omkostningseffektiv tilgang til evaluering af cellefunktionalitet sammenlignet med andre metoder. Dette opnås ved at kombinere forskellige analyser inden for protokollen, samtidig med at nøjagtigheden og fuldstændigheden i resultaterne opretholdes.To forskere udførte denne arbejdsgang samtidigt for et hurtigt overblik over neutrofilfunktionen. Forsker et isolerer PMN'erne, justerer koncentrationen og inkuberer aktiveringssystemerne, mens forsker to forbereder materialer til de efterfølgende tilfælde. Derefter udfører forsker en fagocytose og kolorimetriske NBT-assays, mens forsker to udfører realtidsmigration og NBT-diastest.