Dagelijkse overdrachten, archivering van populaties en het meten van fitness in het langetermijnevolutie-experiment met Escherichia coli

In 1988 begon Richard Lenski met een evolutie-experiment. Hij vulde 12 Erlenmeyers met een glucosebeperkt gedefinieerd groeimedium dat bekend staat als DM25. Hij inoculeerde zes van deze kolven met een E.coli-stam die bekend staat als REL606 en die niet in staat is om de suiker arabinose als voedingsstof te gebruiken.

Deze populaties werden aangeduid als A-1 tot en met A-6. Hij inoculeerde de andere zes met een bijna identieke stam die bekend staat als REL607 en die arabinose kan gebruiken. Deze voorouderlijke stammen, de E.coli die daaruit is geëvolueerd, kunnen worden onderscheiden wanneer ze op tetrazolium of arabinose-agar worden geplateerd.

De Ara-stammen vormen rode kolonies en de Ara+-stammen vormen witte kolonies. Lenski plaatste deze kolven in een schudincubator bij 37 graden Celsius, waardoor ze tot verzadiging konden groeien en de glucose in het medium konden uitputten. Op dit punt bracht hij 1% van de cultuur van elk van de kolven over in een nieuwe set van 12 kolven met vers medium.

Deze dagelijkse cycli van overdracht en hergroei zijn tientallen jaren voortgezet, waardoor een lange geschiedenis van evolutie is ontstaan die door onderzoekers kan worden bestudeerd. In ons protocol beschrijven we hoe het langetermijnevolutie-experiment, of LTEE, elke dag wordt overgedragen en gekweekt. Vervolgens beschrijven we hoe de populaties regelmatig worden gecontroleerd op mogelijke tekenen van besmetting en worden gearchiveerd om een permanent bevroren record te bieden voor later onderzoek.

We noemen dit vaak het, citaat, fossielenbestand van de LTEE. Een belangrijke manier waarop het algemene tempo en het karakter van evolutionaire veranderingen in de LTEE wordt gevolgd, is door de relatieve fitheid van populaties en stammen uit het experiment te meten. We beschrijven hoe deze co-cultuur competitietests moeten worden uitgevoerd en analyseren de resulterende gegevens om relatieve fitnesswaarden te berekenen.

We laten de eerste en de laatste van deze procedures zien in deze video. Eerst zullen we een dagelijkse overdracht van het langetermijnevolutie-experiment demonstreren. Desinfecteer het oppervlak waarop de LTEE-overdrachten worden uitgevoerd door het af te vegen met 70% ethanol of een 10% bleekoplossing.

Steek een Bunsen-brander aan om een lokale updraft te creëren en het vlammen van glaswerk mogelijk te maken. Bereid 13 Pyrex Erlenmeyers van 50 milliliter met daarop 20 milliliter Pyrex- of polypropyleenbekers die door autoclaveren zijn gewassen en gesteriliseerd. Controleer de kolven op zichtbaar vuil en vervang alle kolven die niet perfect schoon zijn.

Etiketteer zes kolven A-1 tot en met A-6 met een rode stift en de andere zes kolven A+1 tot en met A+6 met een zwarte stift. Label de laatst overgebleven kolf, die de lege kolf zal zijn, met de datum, in maand-dagnotatie, en de dag van de week. Vul elk van de 13 kolven met 9,9 milliliter DM25-medium met behulp van een steriele serologische pipet van 10 milliliter.

Vlam de mond van elke kolf na het verwijderen van het bekerglas dat als deksel dient en voordat u het bekerglas vervangt. Vlam de punt van de pipet tussen het vullen van elke kolf. Verwijder de LTEE-kolven van de vorige dag uit de broedmachine.

Onderzoek ze om de beurt door ze tegen het licht te houden om de troebelheid en kleur ervan te beoordelen. Controleer de integriteit van de kolf en zoek naar de aanwezigheid van vreemde stoffen. Breng met behulp van een P200-micropipettor met een steriele filterpunt 100 microliter cultuur van elke LTEE-kolf over in de overeenkomstige kolf met verse DM25.

Begin met A-1 en breng vervolgens A + 1 over. Ga daarna verder met het afwisselen tussen de min- en pluspopulaties. Om bij te houden welke culturen zijn overgedragen, verschuift u kolven naar links als pipetteerend van of naar hen.

Neem strikte aseptische techniek in acht tijdens overdrachten. Gebruik een verse pipetpunt voor elke overdracht. Vlam de monden van kolven onmiddellijk na het losmaken en voor het opnieuw aanbrengen en veeg het vat en de injector van de micropipettor af met een Kimwipe bevochtigd met 70% ethanol tussen elke overdracht.

Incubeer de nieuw geënte kolven bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur met 120 omwentelingen per minuut orbitaal schudden over een diameter van één inch. Bewaar de culturen van de vorige dag bij vier graden Celsius. Bewaar deze culturen gedurende twee dagen.

Gooi oudere culturen weg die drie dagen eerder op dit tijdstip bij vier graden Celsius waren gered. Voer de tijd, datum, overdrachtsnummer, uw naam of initialen, of de culturen al dan niet in orde waren en alle andere relevante informatie in het overdrachtslogboeknotitieblok in. Nog eens 6 2/3 generaties zijn verstreken in de geschiedenis van het langetermijnevolutie-experiment met E.coli.

Als er problemen, ongelukken of vermoedens van besmetting zijn met de LTEE-culturen van de vorige dag, draag ze dan niet over. Bewaar in plaats daarvan de hele set van 12 culturen bij vier graden Celsius voor later onderzoek en verdere karakterisering. Haal de reservekolven op die van de dag ervoor zijn overgebracht en bij vier graden Celsius zijn bewaard.

Leg ze op het bankje om op te warmen tot kamertemperatuur. Draai elke kolf voorzichtig rond om de cellen te resuspenderen. Breng van elke kolf over op vers medium in een nieuwe kolf en zet het experiment normaal voort.

Noteer in het overdrachtslogboek dat u de back-upculturen hebt gebruikt en noteer hetzelfde overdrachtsnummer als de dag ervoor. Als besmetting wordt vastgesteld in de reservekolven die bij vier graden Celsius zijn opgeslagen, moeten de getroffen LTEE-populaties opnieuw worden opgestart uit bevroren voorraden. Vervolgens zullen we een co-cultuur competitietest demonstreren die kan worden gebruikt om de relatieve fitheid van twee stammen of populaties uit het langetermijnevolutie-experiment te meten.

We zullen een competitie-experiment laten zien dat zowel de LTEE-voorouders, REL606 en 607, als twee geëvolueerde populaties evolueert, populatie A-5 op 20.000 generaties, REL8597; en populatie A + 5 op 20.000 generaties, REL8604. Deze testen gebruikten zesvoudige replicatie voor elk paar van een Ara- en Ara+-concurrent. Bepaal hoeveel LTEE-stammen en/of populaties van concurrenten u gaat gebruiken en hoeveel replicerende competitietests voor elk paar concurrenten zullen worden uitgevoerd.

Bereid de benodigde benodigdheden als volgt voor. Vul voor de opwekkingsdag, dag min twee, één steriele erlenmeyer van 50 milliliter afgedekt met een bekerglas van 20 milliliter met 9,9 milliliter DM1000 of lysogene bouillon, LB, per stam of populatie van E.coli die als concurrent zal worden gebruikt. Vul nog een kolf met 9,9 milliliter van hetzelfde medium om te dienen als een niet-geënte blanco.

Voor de voorconditioneringsdag, dag min één, vult u één reageerbuis met 9,9 milliliter steriel zoutoplossing van 0,85% gewicht per volume, twee kolven met 9,9 milliliter DM25 per replicatietest tussen een paar concurrenten en nog een kolf met 9,9 milliliter DM25 voor een blanco. Voor de dag dat de wedstrijd begint, dag nul, vul één kolf met 9,9 milliliter DM25, vul één reageerbuis met 9,9 milliliter steriele zoutoplossing en bereid één tetrazolium of arabinose, of TA-plaat, per wedstrijdtestreplicatie. Vul nog een kolf met 9,9 milliliter DM25 om als blanco te dienen.

Als je een driedaagse wedstrijd uitvoert, vul dan twee extra sets wedstrijdkolven. Vul voor de laatste dag van de wedstrijd twee reageerbuizen met 9,9 milliliter steriele zoutoplossing en bereid één TA-plaat per wedstrijdreplicatie voor. Op dag min twee van een competitie-experiment blaas je de concurrenten apart van de vriesvoorraad weer tot leven.

Haal de cryovialen met daarin de diepvriesvoorraden van de concurrerende stammen uit de vriezer van 80 graden Celsius. Bewaar de injectieflacons gekoeld in een mooie emmer tijdens het gebruik. Nadat elke bevroren voorraad ontdooit, vortex het grondig om de E.coli-cellen te resuspenderen.

Als u een kloon nieuw leven inblaast, ent u de kolf met vers medium met 12 microliter van de bevroren bouillon. Als u een populatie nieuw leven inblaast, ent u met 120 microliter van de bevroren voorraad. Incubeer de opwekkingskolven in de blanco bij 37 graden Celsius 's nachts met 120 omwentelingen per minuut orbitaal schudden over een diameter van één inch.

Op dag min één van een competitie-experiment, conditioneer je de concurrenten afzonderlijk in DM25. Haal de kolven met daarin de culturen van herleefde concurrenten uit de couveuse. Breng 100 microliter van elke kolf over in de reageerbuis met zoutoplossing voor die concurrent.

Vortex elke verdunningsbuis grondig vlak voordat 100 microliter uit de verdunde cultuur in een kolf met verse DM25 wordt overgebracht. Ent twee van deze voorconditioneringskolven voor elke replicaattest, één voor elk van de concurrenten. Incubeer de voorconditioneringskolven in de blanco bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur.

Op dag nul van een competitie-experiment begin je de competitie door de concurrenten en het bord te mengen voor de eerste tellingen. Haal de voorconditioneringskolven uit de couveuse. Breng 50 microliter van de Ara-concurrent over in de eerste nagebouwde wedstrijdkolf gevuld met verse DM25.

Breng onmiddellijk 50 microliter van de Ara+concurrent over in dezelfde wedstrijdkolf. Meng de kolf door zachtjes te draaien. Herhaal deze stappen om alle replica's te combineren van alle paren concurrenten die u hebt getest.

Breng 100 microliter van elke nieuw geënte wedstrijdkolf over in de reageerbuis van een zoutoplossing die is geëtiketteerd voor die wedstrijdtestreplicatie. Plaats de nieuwe wedstrijdkolven en blanco in de schudincubator. Ondertussen, op dezelfde dag, vortex elke reageerbuis grondig en plaat 80 microliter van deze 10.000-voudige verdunningen op TA-platen.

Label de zijkant van de onderkant van elke plaat met het paar soorten dat werd gemengd, het replicatienummer en dag nul om aan te geven dat het zal worden gebruikt om de initiële vertegenwoordiging van elke concurrent te bepalen. Incubeer de TA-platen ondersteboven in een zwaartekrachtconvectie-incubator bij 37 graden Celsius totdat kolonies van zowel de Ara- als Ara+-concurrenten zichtbaar en te onderscheiden zijn. Over het algemeen gebeurt dit binnen 16 tot 24 uur, maar het kan langer duren voor sommige geëvolueerde stammen.

Tel de aantallen Ara-rode en Ara+witte kolonies op elke plaat en noteer de resultaten. Als u een driedaagse wedstrijd uitvoert, breng dan 100 microliter van elke wedstrijd over naar 9,9 milliliter vers DM25-medium in een nieuwe kolf na groei. Incubeer deze dagkolven gedurende 24 uur.

Voer een andere overdracht op dezelfde manier uit en incuber de dag-twee kolven gedurende 24 uur om drie volledige co-cultuur groeicycli van de concurrenten onder LTEE-omstandigheden te voltooien. Op de laatste dag van de wedstrijd, dag één of dag drie, afhankelijk van de lengte van je experiment, ga je voor de laatste tellingen. Haal de wedstrijdkolven uit de couveuse.

Breng 100 microliter van elke wedstrijdkolf over in de eerste reageerbuis met zoutoplossing voor die replicatie. Vortex elke 100-voudige verdunningsbuis om het grondig te mengen en breng 100 microliter over naar de tweede buis zoutoplossing voor die replicatie. De resulterende buizen bevatten 10.000-voudige verdunningen van de DM25-culturen.

Vortex elke reageerbuis met een 10, 000-voudige verdunning grondig en plaat 80 microliter ervan op een TA-plaat. Label de zijkant van de onderkant van elke plaat met het paar soorten dat werd gemengd, het replicatienummer en dag één voor een eendaagse wedstrijd of dag drie voor een driedaagse wedstrijd om aan te geven dat deze zal worden gebruikt om de uiteindelijke vertegenwoordiging van elke deelnemer te bepalen. Incubeer TA-platen bij 37 graden Celsius en tel de Ara-en Ara+-kolonies na groei.

Gebruik de Excel-spreadsheet die bij dit protocol wordt geleverd, of het Fitness RR-pakket, om de relatieve fitheid van de soorten in uw competitie te berekenen en de resultaten te plotten. Tijdens de dagelijkse overdrachten van het langetermijnevolutie-experiment is de dichtheid van de culturen na de groei zeer laag en moet deze vaak worden beoordeeld door een cultuur vlak naast een blanco te houden. De uitzondering is populatie A-3 die is geëvolueerd om citraat in het medium te gebruiken als een extra voedingsbron en groeit tot ongeveer het tienvoudige van de celdichtheid van de andere populaties.

Metingen van de optische dichtheid in de LTEE-culturen kunnen ook worden gebruikt om de verwachte groei te controleren. Voor de voorbeeldcompetitietests verwachten we dat een meer fitte concurrent zijn vertegenwoordiging in de loop van de tijd zal vergroten, ten opzichte van een minder fitte concurrent. Onderzoek van de TA-platen met kolonies gekweekt uit verdunningen van slechts één replicatie van de concurrentie tussen de twee voorouderstammen laat zien dat de verhouding relatief constant blijft in de loop van een driedaags competitie-experiment.

Daarentegen overtreft de A +5-populatie snel de REL606-voorouder. En de A-5-populatie overtreft snel de REL607-voorouder. De twee geëvolueerde populaties zijn bijna aan elkaar gewaagd.

De voorstellingen van rood-witte kolonies blijven over de drie dagen van de wedstrijd vrijwel hetzelfde. Met behulp van de kolonietellingen na één dag co-cultuur, vinden we dat de fitheid van de geëvolueerde populaties met 60% is toegenomen tijdens de LTEE ten opzichte van de voorouderlijke stammen van E.coli. Door de wedstrijden over meerdere dagen te blijven overdragen, kunnen we de precisie van relatieve fitheidsmetingen voor concurrenten die nauw op elkaar aansluiten verbeteren.

Maar wanneer twee concurrenten zeer verschillende fitheden hebben, is er na een meerdaagse wedstrijd geen adequate weergave meer van beide kolonies om de relatieve fitheid te berekenen. De methoden die we hier demonstreren zijn van cruciaal belang voor het bestuderen van het unieke historische record van de LTEE en voor het voortzetten van dit open evolutie-experiment. Ze kunnen ook een startpunt bieden voor anderen die nieuwe evolutie-experimenten overwegen die nieuwe vragen beantwoorden, nieuwe omgevingen gebruiken en verschillende micro-organismen bestuderen.