Dagliga överföringar, arkivering av populationer och mätning av kondition i det långsiktiga evolutionsexperimentet med Escherichia coli

1988 började Richard Lenski ett evolutionsexperiment. Han fyllde 12 Erlenmeyer-kolvar med ett glukosbegränsat definierat tillväxtmedium som kallas DM25. Han inokulerade sex av dessa kolvar med en E. coli-stam som kallas REL606 som inte kan använda sockerarabinos som näringsämne.

Dessa populationer betecknades A-1 till A-6. Han inokulerade de andra sex med en nästan identisk stam som kallas REL607 som kan använda arabinos. Dessa förfäderstammar, E. coli som utvecklats från dem, kan särskiljas när de pläteras på tetrazolium eller arabinosagar.

Ara-stammarna bildar röda kolonier, och Ara+-stammarna bildar vita kolonier. Lenski placerade dessa kolvar i en skakande inkubator vid 37 grader Celsius, så att de kunde växa till mättnad och tömma glukosen i mediet. Vid denna tidpunkt överförde han 1% av kulturen från var och en av kolvarna till en ny uppsättning av 12 kolvar innehållande färskt medium.

Dessa dagliga cykler av överföring och återväxt har fortsatt i årtionden, vilket skapar en lång historia av evolution som kan studeras av forskare. I vårt protokoll beskriver vi hur det långsiktiga evolutionsexperimentet, eller LTEE, populationer överförs och odlas varje dag. Sedan beskriver vi hur populationerna regelbundet kontrolleras för möjliga tecken på kontaminering och arkiveras för att ge en permanent frusen post för senare studier.

Vi hänvisar ofta till detta som, citat, fossila register över LTEE. Ett viktigt sätt att övervaka det övergripande tempot och karaktären av evolutionära förändringar i LTEE är genom att mäta de relativa konditionerna hos populationer och stammar från experimentet. Vi beskriver hur man genomför dessa samkulturtävlingsanalyser och analyserar resulterande data för att beräkna relativa konditionsvärden.

Vi visar den första och den sista av dessa procedurer i den här videon. Först demonstrerar vi en daglig överföring av det långsiktiga evolutionsexperimentet. Desinficera ytan på vilken LTEE-överföringarna ska utföras genom att torka av den med antingen 70 % etanol eller en 10 % blekmedelslösning.

Tänd en Bunsen-brännare för att skapa en lokal updraft och möjliggöra flammande glas. Bered 13 50-milliliter Pyrex Erlenmeyer-kolvar täckta med 20-ml Pyrex- eller polypropenbägare som har tvättats och steriliserats i autoklavering. Kontrollera kolvarna för synligt skräp och byt ut alla som inte är helt rena.

Märk sex flaskor A-1 till A-6 med en röd markör och de övriga sex kolvarna A+1 till A+6 med en svart markör. Märk den sista återstående kolven, som kommer att vara tom, med datum, i månad-dag-format och veckodag. Fyll var och en av de 13 kolvarna med 9,9 ml DM25-medium med en steril 10-milliliter serologisk pipett.

Flamma mynningen på varje kolv efter att ha tagit bort bägaren som fungerar som lock och innan du sätter tillbaka bägaren. Flamma pipettens spets mellan fyllningen av varje kolv. Ta bort föregående dags LTEE-kolvar från skakinkubatorn.

Undersök var och en i tur och ordning genom att hålla upp den mot ljuset för att bedöma dess grumlighet och färg. Kontrollera kolvens integritet och leta efter förekomsten av främmande ämnen. Överför med hjälp av en P200-mikropipettor med steril filterspets 100 mikroliter kultur från varje LTEE-kolv till motsvarande kolv som innehåller färsk DM25.

Börja med A-1 och överför sedan A+1. Därefter fortsätter du att växla mellan minus- och pluspopulationerna. För att hålla reda på vilka kulturer som har överförts, skift kolvarna till vänster som pipettering från eller till dem.

Observera strikt aseptisk teknik under överföringar. Använd en ny pipettspets för varje överföring. Flamma upp mynningarna på kolvarna omedelbart efter att locket har lossats och innan det återvinns och torka av mikropipettorns pipettor med en Kimwipe fuktad med 70 % etanol mellan varje överföring.

Inkubera de nyligen inokulerade kolvarna vid 37 grader Celsius i 24 timmar med 120 varv per minut orbital skakning över en tum diameter. Förvara kulturerna från föregående dag vid fyra grader Celsius. Behåll dessa kulturer i två dagar.

Kassera äldre kulturer som räddades vid fyra grader Celsius tre dagar tidigare vid denna tidpunkt. Ange tid, datum, överföringsnummer, ditt namn eller initialer, om kulturerna var okej eller inte, och annan relevant information i överföringslogganteckningsboken. Ytterligare 6 2/3 generationer har gått i historien om det långsiktiga evolutionsexperimentet med E. coli.

Om det finns några problem, olyckor eller misstankar om kontaminering med föregående dags LTEE-kulturer, överför inte från dem. Lagra istället hela uppsättningen av 12 kulturer vid fyra grader Celsius för senare undersökning och ytterligare karakterisering. Hämta reservkolvarna som överfördes från dagen innan och förvarades vid fyra grader Celsius.

Placera dem på bänkskivan för att värma till rumstemperatur. Snurra försiktigt varje kolv för att återsuspendera cellerna. Överför från varje kolv till nytt medium i en ny uppsättning kolvar och fortsätt försöket normalt.

Anteckna i överföringsloggen att du använde säkerhetskopieringskulturerna och registrera samma överföringsnummer som dagen innan. Om kontaminering konstateras i reservkolvar som lagras vid fyra grader Celsius måste de berörda LTEE-populationerna återstartas från frysta bestånd. Därefter demonstrerar vi en samkulturtävlingsanalys som kan användas för att mäta den relativa konditionen hos två stammar eller populationer från det långsiktiga evolutionsexperimentet.

Vi kommer att visa ett tävlingsexperiment som utvecklar båda LTEE-förfäderna, REL606 och 607, och två utvecklade populationer, befolkning A-5 vid 20 000 generationer, REL8597; och befolkning A+5 vid 20 000 generationer, REL8604. Dessa analyser använde sexfaldig replikering för varje par av en Ara- och Ara+-konkurrent. Bestäm hur många konkurrerande LTEE-stammar och/eller populationer du ska använda och hur många replikerade tävlingsanalyser som ska utföras för varje par av konkurrenter.

Förbered nödvändiga förnödenheter enligt följande. För väckelsedagen, dag minus två, fyll en steril 50-milliliter Erlenmeyerkolv täckt med en 20-milliliters bägare med 9,9 ml av antingen DM1000 eller lysogenbuljong, LB, per stam eller population av E. coli som kommer att användas som konkurrent. Fyll ytterligare en kolv med 9,9 ml av samma medium för att fungera som ett oinokulerat ämne.

För förkonditioneringsdagen, dag minus en, fyll ett provrör med 9,9 ml 0,85% vikt per volym steril saltlösning per konkurrent, två kolvar med 9,9 ml DM25 per replikatanalys mellan ett par konkurrenter och ytterligare en kolv med 9,9 ml DM25 för ett ämne. För den dag tävlingen börjar, dag noll, fyll en kolv med 9,9 ml DM25, fyll ett provrör med 9,9 ml steril saltlösning och förbered en tetrazolium eller arabinos eller TA-platta per tävlingsanalysreplikat. Fyll ytterligare en kolv med 9,9 ml DM25 för att fungera som ett ämne.

Om du utför en tredagars tävling, fyll ytterligare två uppsättningar tävlingskolvar. För tävlingens sista dag, fyll två provrör med 9,9 ml steril saltlösning och förbered en TA-platta per tävlingsreplikat. På dag minus två av ett tävlingsexperiment återupplivar du konkurrenterna separat från fryslager.

Ta ut kryovialerna som innehåller de frysta lagren av konkurrentstammarna ur frysen på 80 grader Celsius. Håll injektionsflaskorna kylda i en fin hink medan du använder dem. Efter varje fryst lager tinar, virvla det noggrant för att återsuspendera E. coli-cellerna.

Om en klon återupplivas, inokulera kolven innehållande färskt medium med 12 mikroliter av det frysta materialet. Om du återupplivar en befolkning, inokulera med 120 mikroliter av det frysta beståndet. Inkubera väckelsekolvarna i ämnet vid 37 grader Celsius över natten med 120 varv per minut orbital som skakar över en tum diameter.

På dag minus ett av ett tävlingsexperiment förkonditionerar du konkurrenterna separat i DM25. Ta kolvarna som innehåller kulturerna av återupplivade konkurrenter ur inkubatorn. Överför 100 mikroliter från varje kolv till provröret med saltlösning för den konkurrenten.

Vrid varje utspädningsrör noggrant precis innan du överför 100 mikroliter från den utspädda kulturen till en kolv med färsk DM25. Inokulera två av dessa förkonditioneringskolvar för varje replikattest, en för var och en av de tävlande. Inkubera förkonditioneringskolvarna i blindprovet vid 37 grader Celsius i 24 timmar.

På dag noll av ett tävlingsexperiment börjar du tävlingen genom att blanda konkurrenterna och plattan för första räkningen. Ta ut förkonditioneringskolvarna ur inkubatorn. Överför 50 mikroliter av Ara-konkurrenten till den första replikattävlingskolven fylld med färsk DM25.

Överför omedelbart 50 mikroliter av Ara+-konkurrenten till samma tävlingskolv. Blanda kolven genom att snurra försiktigt. Upprepa dessa steg för att kombinera alla repliker av alla par av konkurrenter som du testade.

Överför 100 mikroliter från varje nyligen inokulerad tävlingskolv till provröret av saltlösning märkt för den tävlingsanalysreplikatet. Placera de nya tävlingskolvarna och ämnet i skakinkubatorn. Under tiden, samma dag, virvla varje provrör noggrant och platta 80 mikroliter av dessa 10 000-faldiga utspädningar på TA-plattor.

Märk sidan av botten av varje platta med det par stammar som blandades, replikatnumret och dag noll för att indikera att det kommer att användas för att bestämma den ursprungliga representationen av varje konkurrent. Inkubera TA-plattorna upp och ner i en gravitationskonvektionsinkubator vid 37 grader Celsius tills kolonier av både Ara- och Ara+-konkurrenterna är synliga och urskiljbara. I allmänhet sker detta inom 16 till 24 timmar, men det kan ta längre tid för vissa utvecklade stammar.

Räkna antalet Ara-röda och Ara + vita kolonier på varje platta och registrera resultaten. Om du utför en tredagars tävling, överför 100 mikroliter av varje tävling replikera till 9,9 ml färskt DM25-medium i en ny kolv efter tillväxt. Inkubera dessa dag-ett-kolvar i 24 timmar.

Utför en annan överföring på samma sätt och inkubera dag-två-kolvarna i 24 timmar för att slutföra tre fullständiga samodlingstillväxtcykler för konkurrenterna under LTEE-förhållanden. På tävlingens sista dag, dag ett eller dag tre, beroende på experimentets längd, kommer du att plåta för slutliga räkningar. Ta ut tävlingskolvarna ur inkubatorn.

Överför 100 mikroliter från varje tävlingskolv till det första provröret med saltlösning för replikatet. Vortex varje 100-faldigt utspädningsrör för att blanda det noggrant och överföra 100 mikroliter till det andra röret saltlösning för det replikatet. De resulterande rören innehåller 10 000-faldiga utspädningar av DM25-kulturerna.

Vortex varje provrör innehållande en 10 000-faldig utspädning noggrant och platta 80 mikroliter av den på en TA-platta. Märk sidan av botten av varje platta med det par stammar som blandades, replikatnumret och dag ett för en endagstävling eller dag tre för en tredagarstävling för att ange att den kommer att användas för att bestämma den slutliga representationen av varje tävlande. Inkubera TA-plattorna vid 37 grader Celsius och räkna Ara- och Ara+-kolonierna efter tillväxt.

Använd Excel-kalkylbladet som medföljer detta protokoll, eller Fitness RR-paketet, för att beräkna den relativa konditionen hos stammarna i din tävling och plotta resultaten. Under de dagliga överföringarna av det långsiktiga evolutionsexperimentet är kulturernas densitet efter tillväxt mycket låg och måste ofta bedömas genom att hålla en kultur uppe bredvid ett ämne. Undantaget är population A-3 som har utvecklats för att använda citrat i mediet som en extra näringskälla och växer till ungefär tiofaldigt celltätheten hos de andra populationerna.

Mätningar av den optiska densiteten i LTEE-kulturerna kan också användas för att övervaka förväntad tillväxt. För exempeltävlingsanalyserna förväntar vi oss att en konkurrent med bättre passform ökar sin representation över tid, i förhållande till en konkurrent med mindre passform. Att undersöka TA-plattorna med kolonier odlade från utspädningar av bara en replikat av konkurrensen mellan de två förfäderstammarna visar att förhållandet förblir relativt konstant under ett tre dagars tävlingsexperiment.

Däremot konkurrerar A+5-populationen snabbt ut REL606-förfadern. Och A-5-befolkningen konkurrerar snabbt ut REL607-förfadern. De två utvecklade populationerna är nästan jämnt matchade.

Representationerna av röda och vita kolonier förblir nästan desamma under tävlingens tre dagar. Med hjälp av koloniräkningarna efter en dag av samkultur finner vi att konditionen hos de utvecklade populationerna har ökat med 60% under LTEE i förhållande till förfädernas stammar av E. coli. Genom att fortsätta att överföra tävlingarna över flera dagar kan vi förbättra precisionen i relativa konditionsmätningar för tävlande som är nära matchade.

Men när två konkurrenter har mycket olika kondition finns det inte längre en adekvat representation av båda kolonierna efter en flerdagars tävling för att beräkna den relativa konditionen. De metoder vi demonstrerar här är avgörande för att studera LTEE: s unika historiska rekord och för att fortsätta detta öppna evolutionsexperiment. De kan också ge en utgångspunkt för andra som överväger nya evolutionsexperiment som tar upp nya frågor, använder nya miljöer och studerar olika mikroorganismer.