2.8K Views
•
15:00 min
•
August 18th, 2023
DOI :
August 18th, 2023
•0:03
Introduction
2:02
Daily Transfers of LTEE Populations
6:04
Competitive Fitness Assays
6:44
Prepare Supplies
8:24
Day -2: Revive Competitors
9:09
Day -1: Precondition Competitors
9:47
Day 0: Begin Competition
11:16
Alternative:Continue Three-Day Competition
11:43
Day 1 or 3: Finish Competition
12:41
Calculate and Plot Fitness
12:52
Representative Results Appearance and turbidity of LTEE Cultures
13:22
Representative Results Co-culture Competition Results
14:39
Conclusion
Transcript
I 1988 begyndte Richard Lenski et evolutionseksperiment. Han fyldte 12 Erlenmeyerkolber med et glukosebegrænset defineret vækstmedium kendt som DM25. Han podede seks af disse kolber med en E. coli-stamme kendt som REL606, som ikke er i stand til at udnytte sukkerarabinose som næringsstof.
Disse populationer blev betegnet A-1 til A-6. Han podede de andre seks med en næsten identisk stamme kendt som REL607, som er i stand til at udnytte arabinose. Disse forfædres stammer, E. coli, der udviklede sig fra dem, kan skelnes, når de er belagt på tetrazolium eller arabinose agar.
Ara-stammerne danner røde kolonier, og Ara + stammerne danner hvide kolonier. Lenski placerede disse kolber i en rystende inkubator ved 37 grader Celsius, så de kunne vokse til mætning og udtømme glukosen i mediet. På dette tidspunkt overførte han 1% af kulturen fra hver af kolberne til et nyt sæt på 12 kolber indeholdende frisk medium.
Disse daglige cyklusser af overførsel og genvækst er blevet fortsat i årtier, hvilket skaber en lang evolutionshistorie, der kan studeres af forskere. I vores protokol beskriver vi, hvordan det langsigtede evolutionseksperiment, eller LTEE, populationer overføres og dyrkes hver dag. Derefter beskriver vi, hvordan populationerne regelmæssigt kontrolleres for mulige tegn på forurening og arkiveres for at give en permanent frossen rekord til senere undersøgelse.
Vi henviser ofte til dette som LTEE's fossile optegnelser. En vigtig måde, hvorpå det overordnede tempo og karakteren af evolutionære ændringer overvåges i LTEE, er ved at måle populationernes relative egnethed og stammer fra eksperimentet. Vi beskriver, hvordan man gennemfører disse co-kultur konkurrence assays og analyserer de resulterende data for at beregne relative fitness værdier.
Vi viser den første og den sidste af disse procedurer i denne video. Først vil vi demonstrere en daglig overførsel af det langsigtede evolutionseksperiment. Desinficer overfladen, hvorpå LTEE-overførslerne skal udføres, ved at tørre den af med enten 70 % ethanol eller en 10 % blegemiddelopløsning.
Tænd en bunsenbrænder for at skabe et lokalt træk og muliggøre flammende glasvarer. Forbered 13 50 ml Pyrex Erlenmeyer-kolber dækket med 20 ml Pyrex- eller polypropylenbægerglas, der er blevet vasket og steriliseret ved autoklavering. Kontroller kolberne for synligt snavs, og udskift dem, der ikke er helt rene.
Seks kolber mærkes A-1 til A-6 med en rød markør og de øvrige seks kolber A+1 til A+6 med en sort markør. Mærk den sidste resterende kolbe, som vil være tom, med datoen, i måned-dag-format og ugedagen. Hver af de 13 kolber fyldes med 9,9 ml DM25-substrat ved hjælp af en steril 10 ml serologisk pipette.
Der tændes ild til mundingen af hver kolbe, efter at bægerglasset, der tjener som låg, er fjernet, og efter at bægerglasset er udskiftet. Tænd pipettens spids mellem påfyldning af hver kolbe. Den foregående dags LTEE-kolber fjernes fra rystekuvøsen.
Undersøg hver efter tur ved at holde den op mod lyset for at vurdere dens turbiditet og farve. Kontroller kolbeintegritet og se efter tilstedeværelsen af fremmedlegemer. Ved hjælp af en P200-mikropipettor med steril filterspids overføres 100 mikroliter kultur fra hver LTEE-kolbe til den tilsvarende kolbe, der indeholder frisk DM25.
Begynd med A-1, og overfør derefter A + 1. Derefter fortsætter du med at skifte mellem minus- og pluspopulationerne. For at holde styr på, hvilke kulturer der er blevet overført, skal du flytte kolber til venstre som pipettering fra eller til dem.
Overhold streng aseptisk teknik under overførsler. Brug en frisk pipettespids til hver overførsel. Kolbernes munding tændes umiddelbart efter afdækningen og inden genoptagelse, og mikropipettors cylinder og injektor tørres af med en Kimwipe fugtet med 70 % ethanol mellem hver overførsel.
De nyligt podede kolber inkuberes ved 37 grader Celsius i 24 timer med 120 omdrejninger pr. minut orbitalrystelse over en diameter på en tomme. Opbevar kulturerne fra den foregående dag ved fire grader Celsius. Bevar disse kulturer i to dage.
Kassér ældre kulturer, der blev reddet ved fire grader Celsius tre dage før på dette tidspunkt. Indtast klokkeslæt, dato, overførselsnummer, dit navn eller initialer, uanset om kulturerne var okay eller ej, og andre relevante oplysninger i overførselslogbogen. Yderligere 6 2/3 generationer er gået i historien om det langsigtede evolutionseksperiment med E. coli.
Hvis der er problemer, ulykker eller mistanke om kontaminering med den foregående dags LTEE-kulturer, må du ikke overføre fra dem. Opbevar i stedet hele sættet af 12 kulturer ved fire grader Celsius til senere undersøgelse og yderligere karakterisering. Hent de backupkolber, der blev overført fra dagen før og opbevaret ved fire grader Celsius.
Placer dem på bordpladen for at varme op til stuetemperatur. Hver kolbe hvirvles forsigtigt rundt for at ophvirvle cellerne igen. Fra hver kolbe overføres til frisk kolbe i et nyt sæt kolber, og forsøget fortsættes normalt.
Notér i overførselsloggen, at du har brugt backupkulturerne, og registrer det samme overførselsnummer som dagen før. Hvis der konstateres kontaminering i reservekolberne, der opbevares ved fire grader Celsius, skal de berørte LTEE-populationer genstartes fra frosne lagre. Dernæst demonstrerer vi et co-kulturkonkurrenceassay, der kan bruges til at måle den relative egnethed af to stammer eller populationer fra det langsigtede evolutionseksperiment.
Vi viser et konkurrenceeksperiment, der udvikler begge LTEE-forfædrene, REL606 og 607, og to udviklede populationer, befolkning A-5 på 20.000 generationer, REL8597; og befolkning A + 5 på 20.000 generationer, REL8604. Disse analyser brugte seks gange replikation for hvert par af en Ara- og Ara+konkurrent. Beslut, hvor mange LTEE-stammer og/eller populationer du vil bruge, og hvor mange replikate konkurrenceanalyser der skal udføres for hvert par konkurrenter.
Forbered de nødvendige forsyninger som følger. Til genoplivningsdagen, dag minus to, fyldes en steril 50 ml Erlenmeyerkolbe dækket med et 20 ml bægerglas med 9,9 ml enten DM1000 eller lysogeny bouillon, LB, pr. stamme eller population af E. coli, der vil blive brugt som konkurrent. Fyld endnu en kolbe med 9,9 ml af det samme medium for at tjene som et ikke-inokuleret emne.
Til prækonditioneringsdagen, dag minus en, fyldes et reagensglas med 9,9 ml sterilt saltvand på 0,85 % vægt pr. volumen pr. konkurrent, to kolber med 9,9 ml DM25 pr. replikat assay mellem et par konkurrenter og endnu en kolbe med 9,9 ml DM25 til et emne. For den dag, konkurrencen begynder, dag nul, skal du fylde en kolbe med 9,9 ml DM25, fylde et reagensglas med 9,9 ml sterilt saltvand og forberede en tetrazolium eller arabinose eller TA-plade pr. Konkurrenceassayreplikat. Fyld endnu en kolbe med 9,9 ml DM25 for at tjene som et emne.
Hvis du udfører en tre-dages konkurrence, skal du fylde to ekstra sæt konkurrencekolber. Til konkurrencens sidste dag skal du fylde to reagensglas med 9,9 ml sterilt saltvand og forberede en TA-plade pr. Konkurrencereplikate. På dag minus to af et konkurrenceeksperiment genopliver du konkurrenterne separat fra fryselagre.
Tag kryoialerne indeholdende de frosne lagre af konkurrentstammerne ud af fryseren med 80 grader Celsius. Opbevar hætteglassene afkølet i en dejlig spand, mens du bruger dem. Efter hver frossen bestand tøer, hvirvel det grundigt for at resuspendere E. coli-cellerne.
Hvis du genopliver en klon, podes kolben indeholdende frisk medium med 12 mikroliter af den frosne bestand. Hvis du genopliver en befolkning, podes med 120 mikroliter af den frosne bestand. Inkuber genoplivningskolberne i emnet ved 37 grader Celsius natten over med 120 omdrejninger pr. Minut orbital, der ryster over en diameter på en tomme.
På dag minus et af et konkurrenceeksperiment klargør du konkurrenterne separat i DM25. Tag kolberne indeholdende kulturerne fra genoplivede konkurrenter ud af inkubatoren. Der overføres 100 mikroliter fra hver kolbe til reagensglasset med saltvand til den pågældende konkurrent.
Hvert fortyndingsrør hvirvles grundigt, lige inden der overføres 100 mikroliter fra den fortyndede kultur til en kolbe med frisk DM25. To af disse forkonditioneringskolber podes for hvert replikat assay, en for hver af konkurrenterne. Forkonditioneringskolberne inkuberes i blindprøven ved 37 grader Celsius i 24 timer.
På dag nul i et konkurrenceeksperiment begynder du konkurrencen ved at blande konkurrenterne og pladen til indledende tællinger. Tag forkonditioneringskolberne ud af inkubatoren. Overfør 50 mikroliter af Ara-konkurrenten til den første replikate konkurrencekolbe fyldt med frisk DM25.
Overfør straks 50 mikroliter af Ara + konkurrenten til den samme konkurrencekolbe. Bland kolben ved forsigtigt at dreje. Gentag disse trin for at kombinere alle replikater af alle par konkurrenter, du testede.
Der overføres 100 mikroliter fra hver nyinokuleret konkurrencekolbe til reagensglasset af saltvand, der er mærket til den konkurrenceanalysereplikate. Placer de nye konkurrencekolber og emnet i rysteinkubatoren. I mellemtiden hvirvler hver testrør grundigt samme dag og plader 80 mikroliter af disse 10.000 gange fortyndinger på TA-plader.
Mærk siden af bunden af hver plade med det par stammer, der blev blandet, replikationsnummeret og dag nul for at angive, at det vil blive brugt til at bestemme den oprindelige repræsentation af hver konkurrent. TA-pladerne inkuberes på hovedet i en tyngdekraftskonvektionsinkubator ved 37 grader Celsius, indtil kolonier af både Ara- og Ara+-konkurrenterne er synlige og skelnelige. Generelt sker dette inden for 16 til 24 timer, men det kan tage længere tid for nogle udviklede stammer.
Tæl antallet af Ara-røde og Ara+hvide kolonier på hver plade og registrer resultaterne. Hvis du udfører en tre-dages konkurrence, skal du overføre 100 mikroliter af hver konkurrence replikere til 9,9 ml frisk DM25-medium i en ny kolbe efter vækst. Inkuber disse dag-et kolber i 24 timer.
Udfør en anden overførsel på samme måde, og inkuber dag to-kolberne i 24 timer for at fuldføre tre fulde co-kulturvækstcyklusser for konkurrenterne under LTEE-betingelser. På konkurrencens sidste dag, dag et eller dag tre, afhængigt af længden af dit eksperiment, vil du lægge op til endelige tællinger. Tag konkurrencekolberne ud af inkubatoren.
Der overføres 100 mikroliter fra hver konkurrencekolbe til det første reagensglas med saltvand til den pågældende replikat. Vortex hvert 100 gange fortyndingsrør for at blande det grundigt og overføre 100 mikroliter til det andet rør saltvand for at replikere. De resulterende rør indeholder 10.000 gange fortyndinger af DM25-kulturerne.
Vortex hvert reagensglas indeholder en 10.000 gange fortynding grundigt og plade 80 mikroliter af det på en TA-plade. Mærk siden af bunden af hver plade med det par stammer, der blev blandet, replikationsnummeret og dag et for en en-dags konkurrence eller dag tre for en tre-dages konkurrence for at angive, at det vil blive brugt til at bestemme den endelige repræsentation af hver konkurrent. Inkuber TA-plader ved 37 grader Celsius og tæl Ara- og Ara+-kolonierne efter vækst.
Brug Excel-regnearket, der følger med denne protokol, eller Fitness RR-pakken, til at beregne den relative egnethed af stammerne i din konkurrence og plotte resultaterne. Under de daglige overførsler af det langsigtede evolutionseksperiment er tætheden af kulturerne efter vækst meget lav og skal ofte bedømmes ved at holde en kultur op lige ved siden af et tomt. Undtagelsen er population A-3, der har udviklet sig til at bruge citrat i mediet som en ekstra næringskilde og vokser til omkring ti gange celletætheden af de andre populationer.
Målinger af den optiske tæthed i LTEE-kulturerne kan også bruges til at overvåge for forventet vækst. For eksempelkonkurrenceanalyserne forventer vi, at en mere fit konkurrent øger sin repræsentation over tid i forhold til en mindre fit konkurrent. Undersøgelse af TA-pladerne med kolonier dyrket fra fortyndinger af kun en replikat af konkurrencen mellem de to forfædrestammer viser, at forholdet forbliver relativt konstant i løbet af et tre-dages konkurrenceeksperiment.
I modsætning hertil udkonkurrerer A+5-befolkningen hurtigt REL606-forfaderen. Og A-5-befolkningen udkonkurrerer hurtigt REL607-forfaderen. De to udviklede populationer er næsten jævnt matchet.
Repræsentationerne af røde og hvide kolonier forbliver næsten de samme i løbet af konkurrencens tre dage. Ved hjælp af kolonitællingerne efter en dags samkultur finder vi, at fitnesses hos de udviklede populationer er steget med 60% under LTEE i forhold til de forfædres stammer af E. coli. Ved at fortsætte med at overføre konkurrencerne over flere dage kan vi forbedre præcisionen af relative konditionsmålinger for konkurrenter, der er tæt matchede.
Men når to konkurrenter har meget forskellige fitnesser, er der ikke længere en tilstrækkelig repræsentation af begge kolonier efter en flerdages konkurrence til at beregne den relative kondition. De metoder, vi demonstrerer her, er afgørende for at studere LTEE's unikke historiske optegnelser og for at fortsætte dette åbne evolutionseksperiment. De kan også give et udgangspunkt for andre, der overvejer nye evolutionseksperimenter, der adresserer nye spørgsmål, bruger nye miljøer og studerer forskellige mikroorganismer.
Denne protokol beskriver, hvordan man opretholder Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) ved at udføre sine daglige overførsler og periodiske frysninger, og hvordan man udfører konkurrenceanalyser for at måle fitnessforbedringer i udviklede bakterier. Disse procedurer kan tjene som en skabelon for forskere, der starter deres egne mikrobielle evolutionseksperimenter.
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved