Name: 著者スポットライト:ラット腸オルガノイドの生成と操作
Uploaded: 2023-06-23T12:55:00
Duration: 1 min 58 s
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スミグレイ研究室とアミーン研究室の皆さんの思慮深い議論に感謝します。この研究は、チャールズ・H・フッド財団のチャイルドヘルス助成金と嚢胞性線維症財団の助成金(004741P222)からカンザス州に、国立衛生研究所の国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所からNAに助成金番号2R01DK077065-12で支援されました。

ラット腸陰窩の分離と腸オルガノイドの生成

ラット腸オルガノイドモデルの開発は、 in vivo の臓器に見られる重要な機能的特徴を保持し、前臨床試験、薬物スクリーニング、および機能アッセイのための有望なツールです。この in vitro モデルは、 in vivo の前臨床消化器病研究と並行して使用することができ、ラットは腸のサイズが大きく、ヒトと生理学的側面を共有し、場合によってはより優れた疾患モデルであるため、しばしば好ましいモデルである38。ここでは、ラット腸管陰窩の単離、ラット腸管オルガノイドの生成と長期培養、ならびに機能的フォルスコリン膨潤アッセイ、ホールマウント免疫蛍光法、2D単層培養、レンチウイルス遺伝子操作などのダウンストリームアプリケーションのための堅牢なステップバイステップのプロトコルについて概説します。ラット腸管オルガノイドは、マウスモデルの病態生理学が不適切である多くの疾患状況に関連している可能性が高く、マウス腸管オルガノイドと比較してヒト腸生理学のより良いモデルを提供する可能性があります。
継代および増殖可能な長寿命オルガノイド培養を確立するには、腸管上皮増殖の維持に必要な主要な成長因子を特定することが不可欠です。マウスオルガノイドは、ほとんどの場合、EGF、R-spondin、およびNogginの単純なカクテルで増殖するが、Nogginは腸管オルガノイド培養に必要ではないことが報告されている39。馴化培地は組換え成長因子を置き換えることができ、最も一般的に使用される細胞株は、Wnt3a、Rspondin-3、およびNoggin39、L-Wnt3a、およびHA-Rspondin1-Fc293T細胞を分泌するL-WRNである40。L-WRN馴化培地は、マウスの腸管オル ガノイドの増殖だけでなく、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタなど、いくつかの家畜やコンパニオンアニマルの腸オルガノイドの増殖もサポートするのに十分である12。しかし、ヒト腸オルガノイドは、増殖増殖期(すなわち、小さなスフェロイドから大きなスフェロイドへの進行)と分化期(すなわち、分化した細胞型の生成と成熟)に異なる培地製剤を必要とするため、成長因子の要件が大きく異なります10。ラット腸管オルガノイドの培地要件は、ヒト腸管オルガノイドの増殖増殖培地の培地要件とよく似ていますが、特にラットオルガノイドは、この培地環境での増殖と分化の両方が可能であり、培養要件が大幅に簡素化されています。当初の試みは、L-WRNで培養した培地でラット腸管オルガノイドの確立と増殖に焦点を当てていましたが、長期培養は希薄であり、ラット腸管オルガノイド株は頑健性の欠如に悩まされていました(データは示していません)。これは、L-WRN細胞株がR-spondin 3を分泌するように操作されているのに対し、ここで推奨されている293T-Rspo1細胞株はR-spondin 1を分泌するように操作されているためと考えられます。ラットおよびヒトオルガノイドはR-spondin 1を好む可能性があり、L-WRN馴化培地におけるラットオルガノイド株の障害の原因となる可能性があります。
in vivo環境を最もよく再現するには、幹細胞の生存、維持、増殖を可能にし、細胞のターンオーバーと個別の細胞型への同時分化イベントを維持できるオルガノイド培養条件を開発することが重要です。したがって、組換えタンパク質および/または馴化培地中のタンパク質の濃度は、この完璧なバランスをとるために厳密に滴定および制御する必要があります。特に、腸管オルガノイド培養物の損失を避けるためには、最適なWntレベルが不可欠です。馴化培地中のWntが少なすぎると、成長をサポートできず、幹細胞の喪失とその後のオルガノイド死につながります。Wntの過剰活性化は、オルガノイドを嚢胞性で未分化にします10。ここでは詳しく説明しませんが、L-Wnt3aおよび293T-Rspo1馴化培地の各バッチを、トップフラッシュ細胞株41などのWntレポータールシフェラーゼアッセイを用いて試験することを強く推奨します。以前の研究では、L-Wnt3a培地の最適なバッチは、1%のL-Wnt3aと比較して、12.5%で15倍のシグナル増加、50%で300倍のシグナル増加をもたらすはずであると説明されています10。ラットオルガノイドはマウスオルガノイドよりも培養要件、特にWnt活性化レベルに対して感受性が高いため、これらの追加の品質管理ステップは、ラットオルガノイド培養の頑健性と信頼性を促進するのに大いに役立ちます。同様のレポーターラインは、ノギン馴化培地中のBmp活性および相対ノギン濃度の試験には利用できないため、ノギンレベルを正確に制御するために、可能であれば組換えノギンを使用することが望ましい。マウス腸オルガノイドはNoggin39の非存在下で増殖および維持できますが、これはラット腸オルガノイド培養では試みられていません。
細胞培養の要件を超えて、ラットオルガノイド株の初期確立の成功は、陰窩単離中の分化絨毛の効率的な枯渇に大きく依存します。高レベルのヴィラール汚染は陰窩死を引き起こしますが、これはおそらく死にゆく細胞からの信号または必須因子の隔離によるものです。これらの分化した絨毛を上皮製剤から正確かつ一貫して枯渇させるためには、実体鏡の助けを借りて上皮分離を行うことが推奨される。放出される上皮を目視で確認することで、PBSを廃棄して交換するタイミングを明確に判断できます(図1)。絨毛が十分に枯渇するまで、陰窩は収集しないでください。Villar細胞は終末分化しており、培養中にオルガノイドを生成することはできません。さらに、ラット腸管オルガノイドのその後の継代や、下流用途への使用には、繊細な注意が必要です。解離試薬中で長時間(10分)インキュベーションすると、有意な細胞死とオルガノイド株の喪失が生じます。
ここでは、ラットオルガノイドから腸管単分子膜を生成するための簡便で迅速なプロトコルについて説明します。EMEとコラーゲンI基質は上皮に異なる効果があり、研究の目的に応じて活用できます。EMEは、単一細胞の迅速かつ効率的な接着と細胞突起の形成を可能にします。対照的に、表面をコラーゲンIでコーティングすると、これらのプロセスが遅れます。単分子膜が約80%のコンフルエントに達すると、EMEで増殖した細胞は再び3Dオルガノイド構造を生成し始めます。しかし、継続的な成長のための十分な物理的および化学的サポートが不足しています。このオルガノイド状態への逆戻りは、EMEの単分子層を50%〜80%のコンフルエントに維持することで防ぐことができます。単分子膜の頂端表面に希釈EMEを添加すると、de novoオルガノイドの迅速な回収と形成が促進され、収束領域がより迅速かつ容易に生成されます。コラーゲンI表面では、細胞は均一な単層を形成し、小さなクラスターを生成することができます。しかし、単層の上にコラーゲンIを付加するだけでは、オルガノイド形成を誘導するには不十分です。EMEは、単分子膜表面に添加する際には、新生オルガノイドが克服するためのより強い機械的抵抗があるため、希釈する必要があります。しかし、この希釈されたEMEでは、大きなオルガノイドの堅牢な形成はできません。de novoで生成されたラットオルガノイドが表面から自然に剥離した場合は、直ちに除去し、原液EMEに移して、構造的支持と増殖を回復させる必要があります。このステップではオルガノイドのサイズが小さいため、オルガノイドの継代は、堅牢な増殖が確立されるまで推奨されません。EMEがオルガノイドの改形成をサポートできる理由の根本的な生物学的意義は、コラーゲンIがこれを行うことができるかどうかは明らかではありません。しかし、3Dコラーゲンで増殖した細胞は、出芽オルガノイドを形成することができず、長期的な維持をサポートできないことが報告されています42,43。市販のEME製品は、細胞外タンパク質、主にラミニンとコラーゲンIVの不均一な混合物です44。したがって、タンパク質の異なる組成と、異なる細胞複合体を使用して細胞外マトリックスに関与する上皮細胞の能力は、EMEのリモデリングを可能にしますが、コラーゲンIのリモデリングは可能にしません。コラーゲンI由来の単分子膜をEMEに入れてオルガノイドの形成と成長をサポートできるかどうかはテストされていません。
ここでは、ラット腸管オルガノイドモデルの遺伝子操作について説明し、3Dオルガノイドのレンチウイルス形質導入および2D単層の一過性トランスフェクションのプロトコルを概説します。レンチウイルスオルガノイド形質導入の効率の低さを克服するために、2D単分子膜の一過性トランスフェクション用のプロトコルが開発されました。単層の平坦な形態と露出した頂端ドメインは、ウイルスやDNA含有複合体へのアクセスを容易にします。pLJM1-EGFPベクターを用いたEGFPレポーターの発現を、この手法のバリデーションに用いた。GFPレポーターの発現は24時間後に観察され、単層で5〜6日間維持されました。単分子膜のレンチウイルス形質導入に焦点を当てた今後の研究は、3Dオルガノイド形質導入よりも高い効率を持つ可能性があります。上記のプロトコルを用いることで、感染した2D単分子膜から3Dオルガノイドを改質し、安定した系統の作製を容易にすることができます。注意を払えば、ラット腸管オルガノイド株は1年以上にわたって正常に維持され、多くの継代にわたって安定を維持し、凍結保存され、融解に成功し、レンチウイルス形質導入を使用して遺伝子改変されるため、ヒトとの生理学的関連性を保持し、アクセス可能で扱いやすい in vitro 腸オルガノイドモデルの必要性に対処できます。

ヒトの小腸上皮構造と細胞組成は複雑であり、その生理学的機能を反映しています。小腸の主な役割は、その内腔を通過する食物から栄養素を吸収することです1。この機能を最大限に引き出すために、腸表面は、吸収表面積を増やす絨毛と呼ばれる指のような突起と、幹細胞を収容して絶縁する陰窩と呼ばれるカップ状の陥入に編成されています。上皮内では、異なる機能を果たすために、さまざまな特殊な吸収性細胞および分泌細胞タイプが生成されます1。この複雑さのため、高継代形質転換不死化細胞株の腸などの組織をモデル化することは困難でした。しかし、幹細胞、特に成体幹細胞とその分化メカニズムの研究により、3D腸管オルガノイド培養の開発が可能になりました。オルガノイドモデルの使用は、無傷の腸に見られるいくつかの構造成分と細胞タイプの不均一性を再現していることもあって、この分野を変革しました。腸管オルガノイドは、活性幹細胞集団の維持により、 in vitro で長期培養することができます2。
腸オルガノイドは、幹細胞生物学、細胞生理学、遺伝病、栄養学を研究するための適応可能なモデル3,4、また新しい薬物送達方法を開発するためのツール5として急速に普及しています。さらに、患者由来オルガノイドは、疾患モデリング、創薬、個別化治療スクリーニングなどに利用されています6,7,8,9。しかし、ヒト腸オルガノイドにはまだ課題があります。組織の入手可能性、治験審査委員会の承認要件、および倫理的問題により、ヒトサンプルの広範な使用が制限されています。さらに、腸陰窩から産生されるヒト腸オルガノイドは、未分化幹細胞の維持、または成熟細胞型の分化誘導のために、2つの異なる培養条件を必要とする10。これは、幹細胞と成熟分化細胞タイプが同時に存在し、継続的に生成/維持されるin vivoとは対照的です1。一方、マウス腸オルガノイドは、成長因子のそれほど複雑でないカクテルで増殖するため、培地組成のこの切り替えを必要とせず、幹細胞と分化細胞を同じ培地コンテキストに維持することができます2,11。しかし、ヒトと比較した場合のマウスの腸管の大きな違いにより、マウスオルガノイドは多くの場合、最適ではないモデルになる可能性があります。全体として、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコなどの大型哺乳類由来の多くの腸管オルガノイドは、ヒト腸オルガノイドの培養条件よりもマウス腸オルガノイドに近い培養条件で正常に生成されています12。マウスオルガノイドとヒトオルガノイドの成長因子条件の違いは、幹細胞のニッチ組成の違いと、幹細胞の生存、増殖、維持に対する要件の違いを反映している可能性があります。そのため、1)ヒト腸細胞組成によく似ており、2)ヒト腸管オルガノイドのような成長因子を必要とする幹細胞を含み、3)未分化および分化コンパートメントを連続的に維持できる、容易に入手できるモデルオルガノイド系が求められています。理想的には、システムは、in vivo実験とin vitro実験を相関させ、連携して使用できるように、一般的に使用される前臨床動物モデルからのものです。
ラットは、腸の生理学と生化学がヒトと非常によく似ているため、腸の生理学や薬理学の研究に一般的に使用される前臨床モデルであり13、特に腸の透過性に関して14。マウスに比べて比較的大きいため、外科的処置に適しています。ブタを含む大型動物モデルが使用されることもあるが、ラットはより手頃な価格のモデルであり、飼育に必要なスペースが少なく、市販の標準系統が容易に入手できる15。ラットモデルを使用することの欠点は、in vivo研究のための遺伝的ツールキットがマウスと比較して十分に開発されておらず、ノックアウト、ノックイン、トランスジェニックなどの新しいラット系統の作製には法外なコストがかかることが多いことです。頑健なラット腸オルガノイドモデルの開発と最適化により、遺伝子操作、薬理学的治療、およびヒトへの重要な生理学的関連性を保持するアクセス可能なモデルでのハイスループット研究が可能になります。しかし、あるげっ歯類オルガノイドモデルと別のオルガノイドモデルの利点は、研究対象の特定のプロセスや遺伝子に大きく依存します。ヒトに見られる特定の遺伝子は、マウスでは偽遺伝子であるが、ラットでは偽遺伝子ではない可能性がある16,17。さらに、種特異的な細胞サブタイプは、シングルセルRNAseq18,19,20によってますます明らかにされています。最後に、ラットとマウスの腸疾患モデルは、表現型にかなりのばらつきを示すことが多いため21,22、ヒトに見られる症状と疾患プロセスをより厳密に再現するモデルをダウンストリーム作業用に選択する必要があります。ラット腸オルガノイドモデルの作製は、研究者が状況に最も適したモデルシステムを選択する際の柔軟性と選択肢を提供します。ここでは、ラット腸オルガノイドの生成のために既存のプロトコル23,24を拡張し、十二指腸または空腸からのラット腸オルガノイドの生成と維持のためのプロトコルを概説する。さらに、レンチウイルス感染、ホールマウント染色、フォルスコリン膨潤アッセイなど、いくつかのダウンストリームアプリケーションについても説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-D Culture Matrix Rat Collagen I</td>
			<td>Cultrex/R&#38;D Systems</td>
			<td>3447-020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>100-1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes/Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>16-000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Beantown Chemical</td>
			<td>144255-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt3a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLJM1-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>19319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine hydrochloride (PEI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>764965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine&#160;</td>
			<td>Acros Organics/Thermo Fisher</td>
			<td>417481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J593-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF2 protein</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-250ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IGF-1 protein</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>B356441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Noggin protein</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>6057-NG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse EGF protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rat</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and manipulation of rat intestinal organoids

オルガノイドを使用して生理機能や細胞の運命決定を評価する場合、 in vivo の状況を厳密に再現するモデルを使用することが重要です。したがって、患者由来オルガノイドは、疾患モデリング、創薬、個別化治療スクリーニングに使用されます。マウス腸オルガノイドは、腸の機能/生理機能と幹細胞の動態/運命決定の両方の側面を理解するために一般的に利用されています。しかし、多くの疾患の文脈では、ラットは疾患の病態生理学の点でヒトとの生理学的類似性が高いため、モデルとしてマウスよりも好まれることがよくあります。ラットモデルは、 in vivoで利用可能な遺伝的ツールが不足しているため限界があり、ラット腸オルガノイドは脆弱で長期培養が困難であることが証明されています。ここでは、十二指腸と空腸からラット腸オルガノイドを確実に生成するために、以前に発表されたプロトコルに基づいて構築します。ラット腸管オルガノイドを利用した機能的膨潤アッセイ、ホールマウント染色、2Dエンテロイド単分子膜の作製、レンチウイルス形質導入など、いくつかのダウンストリームアプリケーションの概要を説明します。ラットオルガノイドモデルは、ヒトとの生理学的関連性を保持し、迅速に遺伝子操作が可能で、ヒト腸オルガノイドの調達に伴う障壁なしに容易に入手できる in vitro モデルに対するフィールドのニーズに対する実用的なソリューションを提供します。

The human small intestinal epithelial architecture and cellular composition are complex, reflecting their physiological functions. The primary role of the small intestine is to absorb nutrients from food passing through its lumen1. To maximize this function, the intestinal surface is organized into finger-like protrusions called villi, which increase the absorptive surface area, and cup-like invaginations called crypts, which house and insulate the stem cells. Within the epithelium, various specialized absorptive and secretory cell types are generated to perform distinct functions1. Because of this complexity, it has been difficult to model tissues like the intestine in high passage-transformed immortalized cell lines. However, the study of stem cells, especially adult stem cells and their differentiation mechanisms, has allowed for the development of 3D intestinal organoid cultures. The use of organoid models has transformed the field, in part due to their recapitulation of some architectural components and cell type heterogeneity found in the intact intestine. Intestinal organoids can be cultured long-term in vitro due to the maintenance of the active stem cell population2.
Intestinal organoids have rapidly become an adaptable model to study stem cell biology, cell physiology, genetic disease, and nutrition3,4, as well as a tool to develop novel drug delivery methods5. In addition, patient-derived organoids are being utilized for disease modeling, drug discovery, and personalized treatment screening, among others6,7,8,9. However, human intestinal organoids still present challenges. Tissue availability, requirements for Institutional Review Board approval, and ethical issues limit the widespread use of human samples. Additionally, human intestinal organoids generated from intestinal crypts require two distinct culture conditions for the maintenance of undifferentiated stem cells or to induce the differentiation of mature cell types10. This contrasts with in vivo, where stem cells and mature differentiated cell types are simultaneously present and continuously generated/maintained1. On the other hand, mouse intestinal organoids, which are grown in a less complex cocktail of growth factors, do not require this switch in media composition and can maintain stem cells and differentiated cells in the same media context2,11. However, key differences in mouse intestine when compared to humans can make mouse organoids a suboptimal model in many instances. Overall, many intestinal organoids from larger mammals, including horses, pigs, sheep, cows, dogs, and cats, have been successfully generated in culture conditions more closely aligned with mouse intestinal organoids than the culture conditions of human intestinal organoids12. The differences in growth factor conditions between mouse and human organoids likely reflect differences in stem cell niche composition and differing requirements for stem cell survival, proliferation, and maintenance. Therefore, there is a need for an easily accessible model organoid system that 1) closely resembles human intestinal cell composition, 2) contains stem cells with growth factor requirements like those of human intestinal organoids, and 3) is capable of continuously maintaining undifferentiated and differentiated compartments. Ideally, the system would be from a commonly used preclinical animal model, such that in vivo and in vitro experiments can be correlated and used in tandem.
Rats are a commonly used preclinical model for intestinal physiology and pharmacology studies due to their very similar intestinal physiology and biochemistry to humans13, particularly with regards to intestinal permeability14. Their relatively larger size compared to mice makes them more amenable to surgical procedures. While large animal models, including pigs, are sometimes used, rats are a more affordable model, require less space for husbandry, and have readily commercially available standard strains15. A drawback of using rat models is that the genetic toolkit for in vivo studies is not well developed compared to mice, and the generation of novel rat lines, including knockouts, knock-ins, and transgenics, is often cost-prohibitive. The development and optimization of a robust rat intestinal organoid model would allow for genetic manipulation, pharmacological treatments, and higher throughput studies in an accessible model that retains key physiological relevance to humans. However, the advantages of one rodent organoid model versus another is highly dependent on the particular process or gene being studied; certain genes found in humans may be pseudogenes in mice but not rats16,17. Additionally, species-specific cell subtypes are increasingly being unveiled by single-cell RNAseq18,19,20. Finally, rat and mouse intestinal disease models often display considerable variations in phenotypes21,22 such that the model that more closely recapitulates the symptoms and disease process seen in humans must be selected for downstream work. The generation of a rat intestinal organoid model provides additional flexibility and choice for researchers in selecting a model system most appropriate for their circumstances. Here, existing protocols23,24 are expanded upon for the generation of rat intestinal organoids and a protocol is outlined for the generation and maintenance of rat intestinal organoids from the duodenum or jejunum. In addition, several downstream applications, including lentiviral infection, whole mount staining, and forskolin swelling assays, are described.

著者スポットライト:ラット腸オルガノイドの生成と操作  

ラット腸管オルガノイドの作製と操作

In this study we established a rat intestinal organoid model that is robust in long-term cell culture. We also demonstrate the first successful genetic manipulations using both lentiviral infection and transient transfection. This model is an excellent tool for manipulating intestinal biology in the rat where the genetic tools available in vivo are limited.Rat intestinal organoids have previously been difficult to culture long-term. By generating a robust, genetically-manipulatable rat organoid model, we are providing researchers additional flexibility and choice to select an organoid model best suited for their particular circumstances. Mouse intestinal organoids are used to study stem cell behavior, cell fate and physiology, but they can be a suboptimal model.Since there are key differences between mouse and human biology. On the other hand, human intestinal organoids can be difficult to obtain, and have complex cell culture requirements. The rat organoid model we describe here retains key physiological relevance to human biology, while being considerably easier to access and care for than human intestinal organoids.Developing and optimizing the rat intestinal organoid model allows for genetic manipulation, pharmacological treatments, and higher throughput studies of intestinal biology and accessible model with key physiological relevance to humans. Additionally, these rat organoids will allow for the study of species-specific physiology, cell fates, and phenotypic variations and disease models in the intestine.

ラット十二指腸オルガノイドおよび空腸オルガノイドは、セクション2で概説したプロトコルを用いて作製した。陰窩の分離段階では、絨毛がPBSから効率的に枯渇することが非常に重要です。EMEに陰窩で埋め込まれた絨毛が多すぎると、培養全体が死に、オルガノイド系統の確立に失敗する可能性があります。このため、解剖スコープで陰窩を分離することは有用であり、ヴィラールの枯渇を視覚的に確認することができます。 図1 は、代表的なヴィラールの破片と陰窩を示しています(図1A)。絨毛と比較して陰窩のサイズが大幅に小さいことに注意してください(図1B)。メッキ後、陰窩は今後数日間で回転楕円体に拡大し、4〜7日目までに発芽して分化し始めます(図2)。オルガノイドが広範囲に発芽した段階に達したら、継代する必要があります。継代中は、オルガノイド数を拡大できるように、陰窩芽を分裂させるのに十分なほどオルガノイドを破壊することが重要です(図3B)。
凍結後のオルガノイドの回収が成功するかどうかは、オルガノイドが凍結された状態に大きく依存します。高度に増殖する未分化状態のオルガノイドは、最高の効率で回収します。したがって、出芽して分化するのではなく、球状で嚢胞性になるように誘導することをお勧めします。これを達成するために、培地中のWntリガンドR-スポンジンの量を増やし、培地にニコチンアミドを含めることによって、Wntを過剰に活性化することができ、これはいくつかの培養系においてオルガノイド形成と細胞生存をサポートすることが示されている30,31。図3Aは、融解後わずか2日後の健康なオルガノイド培養を示しています。また、BSAを融解中に培地に含ませることは、マウスの腸管オルガノイドよりもデリケートであることが証明されているラットの腸管オルガノイド培養の生存にも役立ちました。
3Dオルガノイド培養は、正常な腸管構造の一部を再現するため好まれることが多いですが、ライブイメージング、トランスフェクション、レンチウイルス形質導入など、他のアプローチは技術的に困難になります。3Dオルガノイド32 (図4)から生成された2D単分子膜の使用により、プラスミドの導入効率を高めることができます。3D腸オルガノイドは従来、一過性のトランスフェクションに耐性がありますが、EGFPをコードするプラスミドは、脂質ベースのトランスフェクション法を用いて導入することができます。PEIを使用した最も費用対効果の高いアプローチは、ステップ6.1(図5)に概説されていますが、エレクトロポレーションおよび市販のトランスフェクション試薬でも同等の結果が得られています(データは示していません)。今後の研究では、これらのアプローチがCRISPRコンストラクトを単層に導入するために使用できるかどうかに焦点が当てられます。
トランスフェクション後に2D単層から3Dオルガノイドを改質し、陰窩の3D構造コンポーネントとの通過可能なラインとして維持できることが重要でした。興味深いことに、EMEに播種された2次元単分子膜は、EMEを細胞の上部に戻すと容易に小さなスフェロイドに再形成されましたが、コラーゲンI基質は3次元構造の再形成には不十分でした(図6)。
一過性トランスフェクションは多くの研究に有用ですが、レンチウイルスを細胞に導入する必要があるため、安定な系統の形成がより有用であることがよくあります。ラット腸オルガノイドは、以前に発表されたプロトコルを変更することによりレンチウイルスに感染しました(図7)。プロトコルの重要なステップは、オルガノイドを小さな凝集体または細胞クラスターに破壊することです。培養物が効率的に破壊されず、オルガノイドが無傷のままであれば、レンチウイルス粒子は細胞内に侵入しません。感染後、オルガノイドは回復し、再増殖しなければなりません。ここで概説されているプロトコルでは、選択前に細胞の10%〜48%(平均:19.4%±6.5%)によるウイルス粒子の通風管が可能です。
オルガノイドのホールマウント染色は、EME残基の除去が不完全であったり、抗体の浸透度が不完全であったりすると、困難になることがあります。ここで概説したプロトコールでは、オルガノイドの堅牢な染色が可能です。また、共焦点顕微鏡でのオルガノイドの可視化は、カバーガラスから離れすぎていると困難になることがあります。VALAPを使用することで、オルガノイドがカバーガラスによって押しつぶされるのではなく、イメージングを容易にするためにカバーガラスの近くに沈殿するように、ある程度の高さのウェルが作成されます。アピカルアニオンチャネル嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)およびファロイジンに対する標識F-アクチンに対する代表的な染色を 図8に示します。
最後に、オルガノイドは機能アッセイにおいて有用です。嚢胞性線維症患者由来の患者由来オルガノイドは、cAMPアゴニストのフォルスコリンによる治療が強力なCFTR媒介性体液分泌を誘発し、オルガノイドの腫脹を引き起こすため、CFTR機能のスクリーニングに使用されています29,33-37。この研究の目標の1つは、in vivoの前臨床試験と並行して使用できるオルガノイドモデルを特定して開発することでした。そこで、ラットの腸管オルガノイドがフォルスコリン誘発性腫脹を起こすかどうかを調べることを目指しました。実際、フォルスコリン処理の30分以内にラットオルガノイドは膨潤し、120分で最大の効果が観察されました(図9)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig01.jpg"> 図1:上皮単離中のVillar断片と 陰窩。 (A)陰窩分離プロトコル中のEDTA溶液中のビラール断片の代表的な画像。黄色の矢印はヴィラールの破片を示しています。赤い矢印は、ヴィラールの破片に取り付けられた地下室を描いています。相対的なサイズの違いに注意してください。(B)形態を可視化するための単一陰窩(赤矢印)の高倍率画像。スケールバー:100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig02.jpg"> 図2:ラットの腸管オルガノイドの進行。 ラット空腸陰窩は、単離直後にEMEでメッキされました(A、B)。2日以内に、地下室は回転楕円体(C、D)になりました。5日目までに、彼らは陰窩の芽(E、F)を開始し始め、それは7日目(G)までに精緻化され、成長しました。スケールバー:100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig03.jpg"> 図3:融解および継代後のオルガノイド。 (A)ラット空腸オルガノイドは、凍結保存後に概説されたプロトコルに従って融解した。融解後わずか2日でスフェロイドと出芽オルガノイドの両方が存在することに注意してください。(B)概説されたプロトコルに従った継代直後のAに示されているのと同じオルガノイド株。AとBの構造の相対的なサイズの違いと、Bの単一のクリプト様ドメインの存在に注目してください。スケールバー:100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig04.jpg"> 図4:3Dオルガノイドからの2D単分子膜形成。 (A-C) EMEにおける2D単分子膜の進行。(D-F)コラーゲンIの2D単分子膜の進行。5日目までに、各条件は~80%のコンフルエントさをもたらしました。スケールバー:100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig05.jpg"> 図5:2D単分子膜の一過性トランスフェクション。 PEIを用いてpLJM1-EGFPプラスミドを一過性にトランスフェクションしたEME上に成長した2D単分子膜の代表的な画像。(A)明視野、(B)蛍光(GFP)、(C)オーバーレイ。赤い点線は単層の境界を示しています。スケールバー:100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig06.jpg"> 図6:EME上の2D単分子膜からの3Dオルガノイドの再形成 。 (A)EMEで成長した2D単分子膜からの3Dオルガノイドの形成。オルガノイドは、単分子膜の頂端表面にEMEを添加してから5日後に効率的に形成されます。小さな3Dスフェロイドを取り囲む死細胞の豊富さに注目してください。(B)コラーゲンI上に成長した2D単分子膜の頂端表面にコラーゲンIを添加してから5日後の2D単分子膜の持続性。 スケールバー:100μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig07.jpg"> 図7:3Dオルガノイドのレンチウイルス感染。 ラット空腸オルガノイドは、概説されたプロトコルを使用して核GFPレンチウイルス粒子に感染しました。5日間の回収と増殖の後、オルガノイドを固定し、DAPIで対比染色しました。(A)DAPI:グレー;nuclearGFP:緑。(B)原子力GFP:緑。赤い点線はオルガノイド境界を示す。スケールバー:50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig08.jpg"> 図8:ラット腸管オルガノイドの全マウント免疫 蛍光法。 (A)CFTR、(B)ファロイジン、および(C)ラット空腸オルガノイドの融合したホールマウント免疫蛍光法。オルガノイドにおけるCFTR染色の頂端濃縮( Aはグレー、 Cはマゼンタ)に注目してください。ファロイジンはF-アクチンをマークし、頂端のブラシ境界( Bでは灰色、 Cではシアン)を目立つように標識します。スケールバー:25 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig09.jpg"> 図9:ラットの腸管オルガノイドはフォルスコリン刺激で膨潤する。 cAMPアゴニストforskolin添加後のラット腸管内オルガノイド腫脹の代表的な経時変化。0分時間は、10μMフォルスコリンを添加する直前の時点を表す。画像は、同じオルガノイドを30分間隔で示しています。フォルスコリン添加後120分で最大の腫脹が観察された。赤い点線はオルガノイド境界の輪郭を描いています。オルガノイド内腔の真ん中にある暗い物質は、死んだ細胞で構成されています。スケールバー:100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
表1:AdDMEM+レシピ 標準AdDMEM+培地(ここで紹介する方法のベースとなる培地)を作るための材料です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table1_Re.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:ラット腸管オルガノイド培地(rIOM)レシピ。 組換えタンパク質の溶媒および保存条件を含む、標準的なラット腸オルガノイド培地の詳細なレシピ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table2_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表 3: ソリューション。 プロトコル全体で使用される他のソリューションを作るためのレシピと手順。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table3_resub2_Re.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表 4.2D単層培養用ラット腸管オルガノイド培地(rIOM2D)。 単層の2D成長に最適化されたオルガノイド培養培地の修正レシピ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table4_resub2_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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ここでは、ラット腸管オルガノイドを作製し、いくつかのダウンストリームアプリケーションで使用するためのプロトコルを紹介します。ラットはしばしば好ましい前臨床モデルであり、堅牢な腸オルガノイド系は、in vivo研究に付随するin vitroシステムの必要性を満たします。

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

本研究では、長期細胞培養に頑健なラット腸管オルガノイドモデルを確立しました。また、レンチウイルス感染と一過性トランスフェクションの両方を用いた遺伝子操作に初めて成功したことを実証しています。このモデルは、in vivoで利用できる遺伝的ツールが限られているラットの腸内生物学を操作するための優れたツールです。ラット腸管オルガノイドは、これまで長期培養が困難でした。頑健で遺伝子操作可能なラットオルガノイドモデルを作成することで、研究者が特定の状況に最適なオルガノイドモデルを選択するための柔軟性と選択肢を提供します。マウス腸オルガノイドは、幹細胞の挙動、細胞の運命、生理学の研究に用いられますが、最適とは言えないモデルとなる可能性があります。マウスと人間の生物学の間には重要な違いがあるためです。一方、ヒト腸オルガノイドは入手が困難であり、複雑な細胞培養要件があります。ここで説明するラットオルガノイドモデルは、ヒトの腸オルガノイドよりもアクセスとケアがはるかに容易であると同時に、ヒトの生物学にとって重要な生理学的関連性を保持しています。ラット腸管オルガノイドモデルの開発と最適化により、遺伝子操作、薬理学的治療、腸内生物学のハイスループット研究が可能になり、ヒトに重要な生理学的関連性を持つアクセス可能なモデルが可能になります。さらに、これらのラットオルガノイドは、種特異的な生理学、細胞運命、および腸内の表現型変異と疾患モデルの研究を可能にします。

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Research

JoVE Journal

Biology

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. Accordingly, patient-derived organoids are used for disease modeling, drug discovery, and personalized treatment screening. Mouse intestinal organoids are commonly utilized to understand aspects of both intestinal function/physiology and stem cell dynamics/fate decisions. However, in many disease contexts, rats are often preferred over mice as a model due to their greater physiological similarity to humans in terms of disease pathophysiology. The rat model has been limited by a lack of genetic tools available in vivo, and rat intestinal organoids have proven fragile and difficult to culture long-term. Here, we build upon previously published protocols to robustly generate rat intestinal organoids from the duodenum and jejunum. We provide an overview of several downstream applications utilizing rat intestinal organoids, including functional swelling assays, whole mount staining, the generation of 2D enteroid monolayers, and lentiviral transduction. The rat organoid model provides a practical solution to the need of the field for an in vitro model which retains physiological relevance to humans, can be quickly genetically manipulated, and is easily obtained without the barriers involved in procuring human intestinal organoids.

Here, we present a protocol to generate rat intestinal organoids and use them in several downstream applications. Rats are often a preferred preclinical model, and the robust intestinal organoid system fills the need for an in vitro system to accompany in vivo studies.

生物学

Establishment and Passaging of Small Intestine Organoids

To begin, place the euthanized rat onto the dissection surface with the ventral side up. Pinch the skin layer with sterile forceps and make cuts at the surface level, avoiding damage to internal organs. Using large sharp dissection scissors, make a longitudinal surface level cut in the center of the abdomen.Then stemming from that cut, make two shorter horizontal cuts one on each side. Using forceps, peel the skin away to expose the abdominal cavity. Cut through the peritoneal membrane to fully expose the internal organs in the abdominal cavity with ready access to the intestine.Using scissors and forceps, locate the stomach and identify the duodenum, approximately two to three centimeters distal to it which appears as a yellowish segment. The proximal jejunum is located approximately four to five centimeters distal to the ligament of Treitz. A landmark between the duodenum and jejunum.Place the isolated intestinal fragment into a 10 centimeter Petri dish. Flush the desired intestinal segment of mesentery with 10 milliliters of ice cold PBS until cleared of luminal contents. On a paper towel, cut the intestinal segment into two centimeter long pieces.Then open each intestinal piece longitudinally to expose the epithelium. Scrape the exposed luminal surface using a glass microscope slide to remove villi. Place the intestinal pieces into the EDTA solution on ice and rotate it four degrees Celsius for 30 minutes on a tube revolver set to 10 RPM.At the dissecting microscope, pour the contents of the tube into a 10 centimeter Petri dish. Add in an additional five milliliters of ice cold PBS. Using fine forceps, hold an intestinal segment and shake vigorously to observe the epithelium release into the PBS.Initially, the PBS will contain mostly villi. Shake the intestinal fragments continuously, periodically discard the PBS containing villi, and add 10 milliliters of fresh PBS to the intestinal fragments. Continue to shake the fragments and repeat the PBS washing step until villi are no longer released into the PBS.But instead, the PBS primarily contains crypts. Discard the remaining intestinal fragments and enrich the remaining PBS in the Petri dish for intestinal crypts. In a tissue culture hood, collect the PBS containing crypts and filter through a 70 micron cells drainer.Centrifuge the filtrate at 250 x g for five minutes. Then remove their supernatant and resuspend the pellet in five millimeters of advanced DMEM plus. Centrifuge again at 250 x g for five minutes.And remove the supernatant, leaving 50 microliters of media with the pellet. Resuspend the pellet in the remaining media and add it to the aliquot of the extracellular matrix extract or EME on ice. Gently pipet up and down to suspend the crypts evenly throughout the EME avoiding making bubbles.Place 50 microliters of the EME domes into a 35 millimeter tissue culture dish. An incubated 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 20 minutes. After incubation, add a two milliliters of rat intestinal organoid media, or RIOM, containing 10 micromolar each of Y27632 and CHIR99021.Next, to passage rat intestinal organoids, aspirate the medium from a plate containing organoids and add one milliliter of dissociation reagent to release the organoids from the EME domes. Transfer the dissociation reagent with fragmented organoids to a 15 milliliter conical tube. Wash the culture plate with two milliliters of advanced DMEM plus and add it to the 15 milliliter conical tube containing the fragmented organoids.Using a glass pasture pipette, gently pipette up and down 15 to 20 times to fragment the organoids. Centrifuge the organoids at 350 x g for two minutes and add 50 microliters of solution from the bottom of the tube into the EME. After mixing the solution, plate 50 microliters of the EME domes into a 35 millimeter tissue culture dish and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 20 minutes.After incubation, add two milliliters of RIOM containing 10 micromolar each of Y27632 and CHIR99021. Representative images of villi fragments and crypts are shown. Crypts are smaller in size compared to villi.Plated crypts expand over the next few days and begin to bud and differentiate by days four to seven. After two days of thawing, a healthy organoid culture showed the presence of both spheroids and budded organoids. The same organoid line after passaging showed the presence of single crypt-like domains.

小腸オルガノイドの確立と継代

Generation of Rat Intestinal 2D Monolayers from 3D Organoids

To coat the plate with EME, dilute EME 1 to 20 in cold Advanced DMEM+For coating with collagen, dilute five milligrams per milliliter of collagen I in Advanced DMEM+to 100 micrograms per milliliter. Coat with the plate with 200 microliters of diluted EME or collagen to cover the well surface entirely and incubate for one to two hours at 37 degrees Celsius. To generate monolayers, aspirate the media from a 35 millimeter plate containing organoids.Add one milliliter of PBS and disrupt the EME in the wells with a P1000 tip, pipetting up and down approximately 20 times to loosen all the EME. Transfer the contents to a 15 milliliter conical tube. Add one milliliter of PBS to the plate to collect additional organoids and transfer them to the same conical tube.Centrifuge the sample at 350 G for two minutes and remove the supernatant, including any EME residue. Then, add one milliliter of trypsin solution to the organoid pellet and incubate at 37 degrees Celsius for two minutes. Pipette up and down 10 times using a P1000 tip and add two milliliters of Advanced DMEM+to neutralize trypsin.Centrifuge at 350 G for five minutes and aspirate the supernant before resuspending the pellet in 4.8 milliliters of rIOM2D. Remove excess EME or collagen in Advanced DMEM+from the wells. Then, add 200 microliters of organoids in rIOM2D and 10 micromolar Y27632 to each pre-coated well.After 4 to 16 hours, collect the media and centrifuge at 1, 000 G for one minute. Transfer the supernatant into a new 15 milliliter conical tube and discard the pellet. Wash each well with 300 microliters of PBS before adding 200 microliters of the centrifuged rIOM2D to each well.Change the rIOM2D every two to three days, suspending the use of Y27632.2D monolayers plated on the EME readily reformed into small spheroids when EME was added back to the top of the cells. In contrast, a collagen I substrate was insufficient to reform 3D structures.