Name: Author Spotlight: Ex Vivo Protocol for Culturing Quiescent Muscle Stem Cells with Niche Components
Uploaded: 2023-06-02T15:00:00
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Pour la figure 2, des modèles de Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) ont été utilisés. Le laboratoire FR est soutenu par l’Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE (subventions 19507 et 22946), la Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), l’Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73), et la Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). Les bailleurs de fonds susmentionnés n’ont joué aucun rôle dans la conception, la collecte, l’analyse, l’interprétation ou la rédaction de cette étude ou dans la rédaction de ce manuscrit.

Toutes les expérimentations ont été conformes à la réglementation animale française et européenne de l’Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), notamment la directive 2010/63/UE. Les animaux ont été gardés dans un environnement contrôlé et enrichi dans les animaleries portant les numéros de certification A94 028 379 et D94-028-028 ; Ils n’ont été manipulés que par des chercheurs et des soigneurs d’animaux autorisés, et ils ont été inspectés visuellement par le personnel de l’?...

Harvesting Mouse Skeletal Muscle to Culture Stem Cells and Their Niche

<ol>
	<li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle:+A+brief+review+of+structure+and+function.">Skeletal muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li><li>Forcina, L., Cosentino, M., Musar&#242;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+muscle+regeneration:+Insights+into+the+interrelated+and+time-dependent+phases+of+tissue+healing.">Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing.</a> Cells. 9 (5), 1297 (2020).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li><li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration.">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li><li>McCarthy, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+fiber+hypertrophy+in+satellite+cell-depleted+skeletal+muscle.">Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle.</a> Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).</li><li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration.">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li><li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration.">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li><li>Hicks, M. R., Pyle, A. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+regulatory+T+cells+in+skeletal+muscle+regeneration:+A+systematic+review.">Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review.</a> Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).</li><li>Loreti, M., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+jam+session+between+muscle+stem+cells+and+the+extracellular+matrix+in+the+tissue+microenvironment.">The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).</li><li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regulatory+cascades+govern+extraocular+and+pharyngeal+arch+muscle+progenitor+cell+fates.">Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates.</a> Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).</li><li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity+analysis.">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li><li>Bismuth, K., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+skeletal+muscle+development.">Genetic regulation of skeletal muscle development.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).</li><li>Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. 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E., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells:+Background+and+methods+for+isolation+and+analysis+in+a+primary+culture+system.">Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system.</a> Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).</li><li>Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+macrophage+conditioned-medium+on+murine+and+human+muscle+cells:+analysis+of+proliferation,+differentiation,+and+fusion.">Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).</li><li>Giordani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+single-cell+cartography+reveals+novel+skeletal+muscle-resident+cell+populations.">High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations.</a> Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).</li><li>Tabula Muris Consortium et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopattern+surface+improves+cultured+human+myotube+maturation.">Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).</li><li>Denes, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+C2C12+myotubes+on+micromolded+gelatin+hydrogels+accelerates+myotube+maturation.">Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).</li><li>LaFramboise, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+muscle+origin+and+phenotype+on+satellite+cell+muscle-specific+gene+expression.">Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).</li><li>Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+potential+of+Pax3/Pax7+on+skeletal+muscle+injury.">The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury.</a> Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).</li><li>Hardy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+injury+models+for+studying+muscle+regeneration+in+mice.">Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).</li></ol>

La fonction des muscles squelettiques adultes est sous-tendue par un ensemble finement orchestré d’interactions cellulaires et de signaux moléculaires. Ici, une méthode est présentée qui permet d’étudier ces paramètres dans un cadre ex vivo qui ressemble beaucoup au microenvironnement physiologique.
Plusieurs groupes ont rapporté des méthodes in vitro pour la culture de cellules myogéniques. Ces méthodes visaient à isoler des cellules satellites afin d’étud...

Le mouvement, la respiration, le métabolisme, la posture corporelle et le maintien de la température corporelle dépendent tous du muscle squelettique, et des dysfonctionnements du muscle squelettique peuvent ainsi provoquer des pathologies débilitantes (c’est-à-dire des myopathies, des dystrophies musculaires, etc.) 1. Compte tenu de ses fonctions essentielles et de son abondance, le muscle squelettique a attiré l’attention des laboratoires de recherche du monde entier qui s’efforcent de comprendre les aspects clés qui soutiennent une fonction musculaire normale et peuvent servir de cibles thérapeutiques. De plus, le muscle squelettique est un modèle largement utilisé pour étudier la régénération et la fonction des cellules souches, car un muscle sain peut s’autoréparer complètement après une blessure et une dégénérescence complètes, principalement en raison de ses cellules souches résidentes2 ; Celles-ci sont également appelées cellules satellites et sont localisées sous la lame basale à la périphérie des fibres musculaires3.
Les cellules centrales du muscle squelettique adulte sont les myofibres (longues cellules multinucléées syncytiales) et les cellules satellites (cellules souches à potentiel myogénique qui sont au repos jusqu’à ce qu’une blessure les active). Ces dernières cellules sont les cellules centrales de la régénération musculaire, et ce processus ne peut pas se produire en leur absence 4,5,6,7. Dans leur microenvironnement immédiat, il existe de multiples types de cellules et de facteurs moléculaires qui leur signalent. Ce créneau s’établit progressivement tout au long du développement et jusqu’à l’âge adulte8. Le muscle adulte contient plusieurs types de cellules (cellules endothéliales, péricytes, macrophages, progéniteurs fibro-adipogènes-FAP, lymphocytes T régulateurs, etc.) 9,10 et composants de la matrice extracellulaire (laminines, collagènes, fibronectine, fibrillines, périostine, etc.) 11 qui interagissent entre elles et avec les cellules satellites dans le contexte de la santé, de la maladie et de la régénération.
La préservation de ce créneau complexe dans des contextes expérimentaux est fondamentale, mais difficile. Il est tout aussi difficile de maintenir ou de revenir à la quiescence, un état cellulaire critique pour les cellules satellites9. Plusieurs méthodes ont été introduites pour relever partiellement ces défis, chacune ayant ses avantages et ses inconvénients (détaillés dans la section de discussion). Nous présentons ici une méthode qui permet de surmonter partiellement ces deux barrières. Les muscles sont d’abord prélevés, puis décomposés mécaniquement et enzymatiquement avant que le mélange de cellules hétérogènes ne soit mis en culture. Au cours de la culture, de nombreux types de cellules de la niche sont détectés et des cellules satellites qui sont revenues à la quiescence sont observées. Comme dernière étape du protocole, les étapes d’immunofluorescence qui permettent la détection de chaque type de cellule grâce à l’utilisation de marqueurs universellement acceptés, sont présentées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-CD31</td>
			<td>BD</td>
			<td>550274</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FOSB</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-7203</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16667</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MyHC</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF20-c</td>
			<td>dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYOD</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39991</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYOG</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-576</td>
			<td>dilution 1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Pax7</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81648</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PDGFR&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-16571</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-FGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-33</td>
			<td>concentration 4 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA) &#8211; used for digestion&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-1006</td>
			<td>concentration 0.2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA IgG-free, protease-free &#8211; used for staining</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td>concentration 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer 40 um</td>
			<td>Dominique Dutscher</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer 70 um</td>
			<td>Dominique Dutscher</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer 100 um</td>
			<td>Dominique Dutscher</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
			<td>concentration 0.5 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>UD8050-05-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>concentration 3 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps size 5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps size 55</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors (big, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>9146-11</td>
			<td>ideal for chopping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors (small, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors (small, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU Click-iT kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum &#8211; option 1</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVF00-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum &#8211; option 2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>354234</td>
			<td>coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Dominique Dutscher</td>
			<td>090261</td>
			<td>flexible film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde &#8211; option 1</td>
			<td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td>
			<td>211511.1209</td>
			<td>concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldeyde &#8211; option 2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28908</td>
			<td>concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>TSSWB27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8532-500 ML</td>
			<td>concentration 0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type mice</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>C57BL/6NRj</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unfractionated bulk culture of mouse skeletal muscle to recapitulate niche and stem cell quiescence

Le muscle squelettique est le plus grand tissu du corps et remplit de multiples fonctions, de la locomotion au contrôle de la température corporelle. Sa fonctionnalité et sa récupération après des blessures dépendent d’une multitude de types de cellules et de signaux moléculaires entre les cellules musculaires centrales (myofibres, cellules souches musculaires) et leur niche. La plupart des contextes expérimentaux ne préservent pas ce microenvironnement physiologique complexe, et ne permettent pas non plus l’étude ex vivo des cellules souches musculaires en quiescence, un état cellulaire crucial pour elles. Ici, un protocole est décrit pour la culture ex vivo de cellules souches musculaires avec des composants cellulaires de leur niche. Grâce à la dégradation mécanique et enzymatique des muscles, on obtient un mélange de types cellulaires, qui est mis en culture 2D. L’immunomarquage montre qu’en l’espace d’une semaine, plusieurs cellules de niche sont présentes en culture aux côtés de myofibres et, surtout, de cellules Pax7-positives qui présentent les caractéristiques des cellules souches musculaires au repos. Ces propriétés uniques font de ce protocole un outil puissant pour l’amplification cellulaire et la génération de cellules souches de type quiescent qui peuvent être utilisées pour répondre à des questions fondamentales et translationnelles.

Movement, breathing, metabolism, body posture, and body temperature maintenance all depend on skeletal muscle, and malfunctions in the skeletal muscle can, thus, cause debilitating pathologies (i.e., myopathies, muscular dystrophies, etc.)1. Given its essential functions and abundance, skeletal muscle has drawn the attention of research labs worldwide that strive to understand the key aspects that support normal muscle function and can serve as therapeutic targets. In addition, skeletal muscle is a widely used model to study regeneration and stem cell function, as healthy muscle can fully self-repair after complete injury and degeneration, mostly due to its resident stem cells2; these are also called satellite cells and are localized under the basal lamina in the periphery of the muscle fibers3.
The core cells of adult skeletal muscle are the myofibers (long syncytial multinuclear cells) and the satellite cells (stem cells with myogenic potential that are quiescent until an injury activates them). The latter cells are the central cells of muscle regeneration, and this process cannot occur in their absence4,5,6,7. In their immediate microenvironment, there are multiple cell types and molecular factors that signal to them. This niche is gradually established throughout development and until adulthood8. Adult muscle contains multiple cell types (endothelial cells, pericytes, macrophages, fibro-adipogenic progenitors-FAPs, regulatory T cells, etc.)9,10 and extracellular matrix components (laminins, collagens, fibronectin, fibrillins, periostin, etc.)11 that interact with each other and with the satellite cells in the context of health, disease, and regeneration.
Preserving this complex niche in experimental settings is fundamental but challenging. Equally difficult is to maintain or return to quiescence, a cell state that is critical for satellite cells9. Several methods have been introduced to partially tackle these challenges, each with its advantages and disadvantages (detailed in the discussion section). Here, a method is presented that can partially overcome these two barriers. Muscles are initially harvested and then broken down mechanically and enzymatically before the heterogenous cell mixture is put into culture. Over the course of the culture, many cell types of the niche are detected, and satellite cells that have returned to quiescence are observed. As a last step of the protocol, the immunofluorescence steps that allow for the detection of each cell type through the use of universally accepted markers, are presented.

Author Spotlight: Ex Vivo Protocol for Culturing Quiescent Muscle Stem Cells with Niche Components 

Culture en vrac non fractionnée de muscles squelettiques de souris pour récapituler la niche et la quiescence des cellules souches

Our research involves the study of healthy and diseased skeletal muscle with special emphasis on the satellite cells. One of the fundamental aspects we are exploring is the identification of transcriptional enhancers that coordinate cell specific gene expression. This protocol permits us to conduct rapid tests for determining specificity.In the field of skeletal muscle research, single cell and single nucleus RNA sequencing approaches are frequently used to study different cell populations in homeostasis, regeneration, and disease. Also, satellite cells could be isolated by fluorescence activated cell sorting, or FACS, and cultured for hypothesis testing and sequencing result validation. Studying satellite cells in vitro poses a significant challenge.Recent studies highlighted the role of satellite cells niche in its physiology. While it's common to culture FACS isolated satellite cells, replicating the satellite cells niche in vitro is yet to be achieved. Our protocol provides an efficient and practical way of culturing whole muscle tissue, including non myogenic cells, such as endothelial cells and fibro edoprogenetic progenitors.We showed that quiescent-like cells appear within one week of culture. This protocol could also be used to study the influence that other cells have on reestablishing this quiescent-like pool.

Ce protocole permet la culture de cellules musculaires tout en préservant les cellules satellites et la plupart des cellules de leur niche endogène. La figure 2 résume les principales étapes du protocole, tandis que les parties essentielles de la dissection et de la digestion sont présentées à la figure 1. La dissection de la musculature des membres postérieurs est recommandée (Figure 1A-C)...

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Le muscle squelettique comprend plusieurs types de cellules, y compris les cellules souches résidentes, chacune ayant une contribution particulière à l’homéostasie et à la régénération musculaires. Ici, la culture 2D de cellules souches musculaires et la niche des cellules musculaires dans un environnement ex vivo qui préserve de nombreuses caractéristiques physiologiques, in vivo et environnementales sont décrites.

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

Nos recherches portent sur l’étude des muscles squelettiques sains et malades, avec un accent particulier sur les cellules satellites. L’un des aspects fondamentaux que nous explorons est l’identification d’activateurs transcriptionnels qui coordonnent l’expression des gènes spécifiques aux cellules. Ce protocole nous permet d’effectuer des tests rapides pour déterminer la spécificité.Dans le domaine de la recherche sur les muscles squelettiques, les approches de séquençage de l’ARN unicellulaire et mononoyau sont fréquemment utilisées pour étudier différentes populations cellulaires en homéostasie, en régénération et en maladie. De plus, les cellules satellites pourraient être isolées par tri cellulaire activé par fluorescence, ou FACS, et cultivées pour tester des hypothèses et valider les résultats du séquençage. L’étude in vitro des cellules satellites représente un défi de taille.Des études récentes ont mis en évidence le rôle de la niche des cellules satellites dans sa physiologie. Bien qu’il soit courant de cultiver des cellules satellites isolées de FACS, la réplication de la niche des cellules satellites in vitro n’a pas encore été réalisée. Notre protocole fournit un moyen efficace et pratique de cultiver des tissus musculaires entiers, y compris des cellules non myogéniques, telles que les cellules endothéliales et les progéniteurs fibro-édoprogénétiques.Nous avons montré que les cellules de type quiescent apparaissent dans la semaine qui suit la culture. Ce protocole pourrait également être utilisé pour étudier l’influence d’autres cellules sur le rétablissement de ce pool de type quiescent.