Name: تسليط الضوء على المؤلف: الكشف عن الحمض النووي Leptospira في المياه للتحليل البيئي ومراقبة الأمراض
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

نحن مدينون لمجموعة Leptospira التابعة لقسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة ، كلية الطب البيطري وعلم ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك. نحن ممتنون للتبرع السخي من سلالات Leptospira المرجعية. سلالة Leptospira fainei serovar Hurstbridge BUT6 و Leptospira biflexa serovar Patoc سلالة باتوك الأول للدكتور أليخاندرو دي لا بينيا موكتيزوما. نشكر الدكتور خوسيه أنطونيو أوكامبو سرفانتس ، منسق CIBAC ، والموظفين على دعمهم اللوجستي. كانت EDT في إطار برنامج مشروع المحطة الطرفية للطلاب الجامعيين في جامعة متروبوليتان المستقلة - الحرم الجامعي كواجيمالبا. ونقر بالبرنامج Biorender.com لإنشاء الأشكال 1 ومن 3 إلى 9.

1. إعداد العينة
<ol><li>تركيز كل عينة ماء في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل عن طريق الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة ، عدة مرات حسب الحاجة ، لتركيز العينة في حجم 250 ميكرولتر.</li>
	<li>استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المص?...

مقايسة اللطخة النقطية للكشف عن الحمض النووي لليبتوسبيرا في عينات المياه

تشمل الخطوات الحاسمة لتقنية اللطخة النقطية (1) تجميد الحمض النووي ، (2) حجب مواقع الارتباط الحرة على الغشاء بالحمض النووي غير المتماثل ، (3) التكامل بين المسبار والجزء المستهدف في ظل ظروف التلدين ، (4) إزالة المسبار غير المهجن ، و (5) الكشف عن جزيء المراسل41.
يحتوي PCR-Dot...

داء البريميات في البشر ينشأ أساسا من مصادر بيئية1،2. يعد وجود Leptospira في البحيرات والأنهار والجداول مؤشرا على انتقال داء البريميات بين الحياة البرية الأليفة والمنتجة التي قد تتلامس في النهاية مع هذه المسطحات المائية1،3،4. علاوة على ذلك ، تم تحديد Leptospira في مصادر غير طبيعية ، بما في ذلك مياه الصرف الصحي والراكدة ومياهالصنبور 5,6.
Leptospira هي بكتيريا موزعة في جميع أنحاء العالم 7,8 ، وقد تم التعرف على دور البيئة في الحفاظ عليها ونقلها بشكل جيد. يمكن أن تعيش Leptospira في مياه الشرب تحت درجة الحموضة والمعادنالمتغيرة 9 ، وفي المسطحات المائيةالطبيعية 1. يمكنه أيضا البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة في الماء المقطر10 ، وتحت درجة حموضة ثابتة (7.8) ، قد يعيش حتى 152 يوما11. علاوة على ذلك ، قد تتفاعل Leptospira في اتحادات بكتيرية للبقاء على قيد الحياة في الظروف القاسية12,13. قد يكون جزءا من الأغشية الحيوية في المياه العذبة مع Azospirillum و Sphingomonas ، بل إنه قادر على النمو وتحمل درجات حرارة تتجاوز 49 درجة مئوية14,15. يمكن أن تتكاثر أيضا في التربة المشبعة بالمياه وتظل قابلة للحياة لمدة تصل إلى 379 يوما16 ، مما يحافظ على قدرتها على التسبب في المرض لمدة تصل إلى عام17,18. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن البيئة داخل المسطحات المائية وكيف يتم توزيعها داخلها.
منذ اكتشافها ، استندت دراسة جنس Leptospira إلى الاختبارات المصلية. لم يكن حتى القرن الحالي أن التقنيات الجزيئية أصبحت أكثر انتشارا في دراسة هذا spirochaete. نادرا ما تم استخدام اللطخة النقطية لتحديدها باستخدام (1) مسبار نظيري يعتمد على 16S rRNA وعلى تكرار تسلسل بسيط (ISSR) 19،20 ، (2) كاختبار مناعي قائم على الذهب النانوي لداء البريميات البشري المطبق على البول21 ، أو (3) كمقايسة قائمة على الأجسام المضادة لعينات بول الأبقار22. سقطت هذه التقنية في حالة إهمال لأنها كانت تستند في الأصل إلى تحقيقات نظيرية. ومع ذلك ، فهي تقنية معروفة جيدا ، إلى جانب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تسفر عن نتائج محسنة ، وتعتبر آمنة بسبب استخدام المجسات غير النظيرية. يلعب تفاعل البوليميراز المتسلسل دورا حاسما في إثراء الحمض النووي Leptospira عن طريق تضخيم جزء معين من الحمض النووي يمكن العثور عليه بكميات ضئيلة في العينة. خلال كل دورة PCR ، تتضاعف كمية جزء الحمض النووي المستهدف في التفاعل. في نهاية التفاعل ، تم ضرب amplicon بعامل أكثر منمليون 23. يصبح المنتج الذي يتم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والذي غالبا ما يكون غير مرئي في رحلان الأغاروز الكهربائي ، مرئيا من خلال تهجين محدد باستخدام مسبار يحمل علامة DIG في البقعةالنقطية 24،25،26.
تقنية dot-blot بسيطة وقوية ومناسبة للعديد من العينات ، مما يجعلها في متناول المختبرات ذات الموارد المحدودة. تم استخدامه في مجموعة متنوعة من دراسات البكتيريا ، بما في ذلك (1) البكتيريا الفموية27 ، (2) أنواع العينات الأخرى مثل الطعام والبراز28 ، و (3) تحديد البكتيريا غير القابلة للزراعة29 ، غالبا بالاتفاق مع التقنيات الجزيئية الأخرى. من بين المزايا التي توفرها تقنية dot-blot ما يلي: (1) يتمتع الغشاء بقدرة ربط عالية ، قادرة على ربط أكثر من 200 ميكروغرام / سم2 من الأحماض النووية وما يصل إلى 400 ميكروغرام / سم2 ؛ (2) يمكن تفسير نتائج البقع النقطية بصريا دون الحاجة إلى معدات خاصة ، و (3) يمكن تخزينها بسهولة لسنوات في درجة حرارة الغرفة (RT).
تم تصنيف جنس Leptospira إلى مجموعات مسببة للأمراض ومتوسطة ورمية30,31. يمكن تحقيق التمييز بين هذه الفصائل بناء على جينات محددة مثل lipL41 و lipL32 و 16S rRNA. LipL32 موجود في الكتل المسببة للأمراض ويظهر حساسية عالية في مختلف الأدوات المصلية والجزيئية ، في حين أنه غائب في الأنواع الرمية21. يعرف جين التدبير المنزلي lipL41 بتعبيره المستقر ويستخدم في التقنيات الجزيئية32 ، بينما يستخدم جين 16S rRNA لتصنيفها.
يمكن تطبيق هذه المنهجية على كميات كبيرة من المياه بمجرد تركيزها بواسطة الطرد المركزي. يسمح بتقييم النقاط والأعماق المختلفة داخل الجسم المائي للكشف عن وجود الحمض النووي البريمي والمجموعة التي ينتمي إليها. هذه الأداة ذات قيمة لكل من أغراض الفحص البيئي والعام ويمكن استخدامها أيضا للكشف عن البكتيريا الأخرى غير القابلة للزراعة التي قد تكون موجودة في الماء.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل واللطخة النقطية ميسورة التكلفة تقنيا واقتصاديا لمجموعة واسعة من المختبرات ، حتى تلك التي تفتقر إلى معدات متطورة أو باهظة الثمن. تهدف هذه الدراسة إلى تطبيق اللطخة النقطية القائمة على الديغوكسيجينين لتحديد مجموعات Leptospira الثلاثة في عينات المياه التي تم جمعها من المسطحات المائية الطبيعية.
السلالات البكتيرية تم تضمين اثني عشر Leptospira serovars (Autumnalis ، Bataviae ، Bratislava ، Canicola ، Celledoni ، Grippothyphosa ، Hardjoprajitno ، Icterohaemorrhagiae ، Pomona ، Pyrogenes ، Tarassovi ، و Wolffi) في هذه الدراسة. هذه المصل هي جزء من المجموعة في قسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة ، كلية الطب البيطري وعلم ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك ، وتستخدم حاليا في اختبار التراص الدقيق (MAT).
تم استزراع جميع Leptospira serovars في EMJH ، وتم استخراج الحمض النووي الخاص بهم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية (انظر جدول المواد). تم استخدام مزيج الحمض النووي الجينومي من المصل الاثني عشر كعنصر تحكم إيجابي للزمرة المسببة للأمراض Leptospira . كعنصر تحكم إيجابي في مجموعة Leptospira الوسيطة ، تم تضمين الحمض النووي الجينومي من سلالة Leptospira fainei serovar Hurstbridge BUT6 ، وكعنصر تحكم إيجابي في مجموعة Leptospira saprophyte ، تم أيضا تضمين الحمض النووي الجينومي لسلالة Leptospira biflexa serovar Patoc Patoc I.
تألفت الضوابط السلبية من بلازميد فارغ ، وحمض نووي من بكتيريا غير ذات صلة (Ureaplasma urealyticum ، والمكورات العنقودية الذهبية ، والبروسيلا المجهضة ، والسالمونيلا التيفية ، والشيغيلة البوجيدية ، والكلبسيلة الرئوية ، والراكدة البوماني ، والإشريكية القولونية) ، والمياه من درجة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والتي كانت بمثابة تحكم غير قالب.
عينات المياه تم جمع اثنتي عشرة عينة تجريبية باستخدام طريقة أخذ العينات الطبقية العشوائية من مركز بحوث Cuemanco البيولوجي وتربية الأحياء المائية (CIBAC) (19 ° 16' 54" شمالا 99 ° 6' 11" غربا). تم الحصول على هذه العينات على ثلاثة أعماق: سطحية ، 10 ، و 30 سم (الشكل 1 أ ، ب). لم تؤثر إجراءات جمع المياه على أي أنواع مهددة بالانقراض أو محمية. تم جمع كل عينة في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. لجمع العينة ، تم غمر كل أنبوب برفق في الماء ، وملئه بالعمق المحدد ، ثم إغلاقه. تم الاحتفاظ بالعينات عند 22 درجة مئوية ونقلها على الفور إلى المختبر لمعالجتها.
تم تركيز كل عينة عن طريق الطرد المركزي في أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 1.5 مل عند 8000 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تكررت هذه الخطوة حتى تم تركيز جميع العينات في أنبوب واحد ، والذي تم استخدامه بعد ذلك لاستخراج الحمض النووي (الشكل 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> الشكل 1: تركيز عينات المياه بالطرد المركزي. أ: أحواض أخذ عينات المياه، ب: الجداول الطبيعية. (ج) معالجة عينات المياه القائمة على الطرد المركزي في خطوات متكررة عدة مرات حسب الحاجة (ن). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
استخراج الحمض النووي تم عزل إجمالي الحمض النووي باستخدام مجموعة الحمض النووي الجينومي التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). تم استخلاص استخلاص الحمض النووي في 20 ميكرولتر من محلول الشطف ، وتم تحديد تركيز الحمض النووي بواسطة مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية عند 260-280 نانومتر ، وتخزينه عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
تضخيم PCR كانت أهداف تفاعل البوليميراز المتسلسل هي جينات 16S rRNA و lipL41 و lipL32 ، والتي تحدد الحمض النووي من جنس Leptospira وتسمح بالتمييز بين المجموعات الثلاث: المسببة للأمراض ، والرمية ، والمتوسطة. استندت كل من البادئات وتصميمات المسبار إلى الأعمال السابقة لأحمد وآخرون ، وأزالي وآخرون ، وبورهي وآخرون ، وفايس وآخرون ، وبرانجر وآخرون 33،34،35،36،37. يتم وصف تسلسل كل مسبار وتمهيد وجزء مضخم في الجدول 1 ، ويتم توفير مواءمتها مع التسلسلات المرجعية في الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3 والملف التكميلي 4 والملف التكميلي 5. يتم وصف كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل وظروف التدوير الحراري في قسم البروتوكول.
تم تصور منتجات التضخيم عن طريق الفصل الكهربائي على هلام أغاروز 1٪ في TAE (قاعدة 40 mM Tris ، و 20 mM حمض الخليك ، و 1 mM EDTA ؛ درجة الحموضة 8.3) ، عند 60 فولت لمدة 45 دقيقة مع الكشف عن بروميد الإيثيديوم ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 1. تم استخدام الحمض النووي الجينومي الذي تم الحصول عليه من كل مصل بتركيزات تتراوح من 6 × 106 إلى 1 × 104 نسخ مكافئة جينومية (GEq) في كل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بناء على حجم جينوم L. interrogans (4 ، 691 ، 184 bp)38 ل Leptospira الممرضة ، حجم الجينوم ل L. biflexa (3 ، 956 ، 088 bp)39 ل Leptospira الرمية ، وحجم الجينوم لسلالة L. fainei serovar Hurstbridge BUT6 (4،267،324 bp) مع رقم الانضمام AKWZ00000000.2.
تم تقييم حساسية المجسات باستخدام الحمض النووي من كل مصل ممرض ، سلالة L. biflexa serovar Patoc Patoc I ، وسلالة L. fainei serovar Hurstbridge BUT6 في كل تجربة. لتقييم خصوصية اختبار PCR وتهجين البقع النقطية ، تم تضمين الحمض النووي من البكتيريا غير ذات الصلة.
الجدول 1: بادئات ومجسات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم المنتجات لتحديد الكتل المسببة للأمراض ، والخلايا الرمية ، والوسيطة من Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
مقايسة تهجين البقعة النقطية تسمى هذه التقنية اللطخة النقطية لأن الثقوب التي توضع فيها عينة الحمض النووي لها شكل نقطة ، وعندما يتم امتصاصها لتثبيتها في مكانها عن طريق الشفط الفراغي ، فإنها تكتسب هذا الشكل. تم تطوير هذه التقنية بواسطة Kafatos et al.40. تسمح هذه التقنية بالقياس شبه الكمي لليبتوسبيرا في كل عينة إيجابية لتفاعل البوليميراز المتسلسل. يتكون البروتوكول من تمسخ مع NaOH 0.4 M في درجة حرارة الغرفة ، والعينات التي تحتوي على Leptospira DNA من 30 نانوغرام إلى 0.05 نانوغرام ، المقابلة ل 6 × 106 إلى 1 × 104 leptospires ، يتم مسحها على غشاء نايلون بجهاز نقطية 96 بئرا. بعد التثبيت ، يرتبط الحمض النووي بالغشاء عن طريق التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية 120 مللي جول. يتم اقتران كل مسبار DNA مع digoxigenin-11 dUTP بواسطة خطوة تحفيز ترانسفيراز طرفية في نهاية 3 '(Digoxigenin هو ستيرويد نباتي تم الحصول عليه من Digitalis purpurea ، يستخدم كمراسل41). بعد التهجين الصارم لمسبار الحمض النووي المسمى (50 pmol) عند درجة حرارة محددة على الحمض النووي المستهدف ، يتم تصور هجين الحمض النووي من خلال تفاعل التلألؤ الكيميائي مع الجسم المضاد للفوسفاتيز القلوي المضاد للديجوكسيجينين المترافق تساهميا مع الركيزة CSPD. يتم التقاط التلألؤ عن طريق التعرض لفيلم الأشعة السينية (الشكل 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> الشكل 2: خطوات إجراء فحص PCR-dot-blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

اللطخة النقطية هي تقنية بسيطة وسريعة وحساسة ومتعددة الاستخدامات تتيح تحديد كميات قليلة من الحمض النووي المستهدف على وجه التحديد عن طريق تهجين المسبار في وجود الحمض النووي الناقل. يعتمد على نقل كمية معروفة من الحمض النووي إلى دعامة صلبة خاملة ، مثل غشاء النايلون ، باستخدام جهاز البقعة النقطية وبدون فصل كهربائي. تتميز أغشية النايلون بقدرة ربط الحمض النووي العالية (400 ميكروغرام / سم2) ، والقوة العالية ، وهي مشحونة بشكل إيجابي أو محايد. المسبار المستخدم عبارة عن جزء من ssDNA محدد للغاية من 18 إلى 20 قاعدة موسومة بالديجوكسيجينين (DIG). سوف يترافق المسبار مع الحمض النووي Leptospira . بمجرد تهجين المسبار مع الحمض النووي المستهدف ، يتم اكتشافه بواسطة جسم مضاد مضاد للديجوكسيجينين ، مما يسمح باكتشافه بسهولة من خلال انبعاثاته التي تم الكشف عنها في فيلم الأشعة السينية. سوف تتوافق النقاط ذات الانبعاث مع شظايا الحمض النووي ذات الأهمية. تستخدم هذه الطريقة وضع العلامات غير النظيرية للمسبار ، والتي قد يكون لها عمر نصف طويل جدا. عيب هذا الملصق المناعي القياسي هو حساسية أقل من تحقيقات النظائر. ومع ذلك ، يتم تخفيفه عن طريق اقتران تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ومقايسات البقع النقطية. يتيح هذا النهج إثراء التسلسل المستهدف واكتشافه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه كتطبيق كمي عند مقارنته بالتخفيف التسلسلي لمعيار معروف. يتم تقديم تطبيق لطخة نقطية للكشف عن Leptospira من الكتل الرئيسية الثلاثة في عينات المياه هنا. يمكن تطبيق هذه المنهجية على كميات كبيرة من المياه بمجرد تركيزها عن طريق الطرد المركزي لتقديم دليل على وجود الحمض النووي Leptospiral. هذه أداة قيمة ومرضية لأغراض الفحص العام ، ويمكن استخدامها للبكتيريا الأخرى غير القابلة للزراعة التي قد تكون موجودة في الماء ، مما يعزز فهم النظام البيئي.

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

تسليط الضوء على المؤلف: الكشف عن الحمض النووي Leptospira في المياه للتحليل البيئي ومراقبة الأمراض

تفاعل البلمرة المتسلسل وتهجين اللطخة النقطية للكشف عن Leptospira في عينات المياه

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

لتقييم فعالية هذه التقنية ، تم استخدام الحمض النووي الجينومي من الثقافات النقية لكل Leptospira serovar ، جنبا إلى جنب مع المسبار الخاص بالكليد. تم تحضير الأغشية ب 100 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي لكل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل مصل ، تليها ثمانية حمض نووي جينومي للبكتيريا ?...

في هذه الدراسة ، تم تصميم تطبيق نقطي للكشف عن Leptospira من الفصائل الرئيسية الثلاثة في عينات المياه. تسمح هذه الطريقة بتحديد الحد الأدنى من كميات الحمض النووي المستهدفة على وجه التحديد بواسطة مسبار يحمل علامة ديجوكسيجينين ، ويمكن اكتشافه بسهولة بواسطة جسم مضاد للديجوكسيجينين. هذا النهج هو أداة قيمة ومرضية لأغراض الفرز.

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد وجود الحمض النووي Leptospira في عينات المياه. يتم استخدام تقنية dot-blot لهذا الغرض ، والتي تتيح الكشف الدقيق عن الحمض النووي وتحليله. اللطخة النقطية هي تقنية غير نظيرية سهلة ومتعددة الاستخدامات وقد تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التوزيع البيئي لليبتوسبيرا.هذه الطريقة لديها القدرة على تقييم المسطحات المائية الضخمة والمساعدة في مراقبة الأمراض.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.