Name: Forfatter Spotlight: Leptospira DNA-detektion i vand til miljøanalyse og sygdomsovervågning
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Vi står i gæld til Leptospira-samlingen ved Institut for Mikrobiologi og Immunologi, Det Veterinærmedicinske Fakultet og Zooteknik, Mexicos Nationale Autonome Universitet. Vi er taknemmelige for den generøse donation af referencestammerne fra Leptospira ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 og Leptospira biflexa serovar Patoc stamme Patoc I til Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Vi takker Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, CIBAC-koordinatoren, og personalet for deres logistiske støtte. EDT var under Terminal Project-programmet for bachelorstuderende på Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. Vi anerkender den Biorender.com software til oprettelse af figur 1 og 3 til 9.

1. Forberedelse af prøver
<ol><li>Hver vandprøve koncentreres i 1,5 ml mikrocentrifugeglas ved centrifugering ved 8.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Dette trin gentages så mange gange som nødvendigt for at koncentrere prøven i et volumen på 250 μl.</li>
	<li>Brug DNA-ekstraktionssættet i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel).</li>
	<li>Udfør den specifikke PCR i henhold til den dot-blot-sonde, der skal bruges (tabel 1).<ol><li>Der ...

Dot-Blot-analyse til påvisning af Leptospira-DNA i vandprøver

De kritiske trin i dot-blot-teknikken inkluderer (1) DNA-immobilisering, (2) blokering af de frie bindingssteder på membranen med ikke-homologt DNA, (3) komplementariteten mellem sonden og målfragmentet under udglødningsbetingelser, (4) fjernelse af den uhybridiserede sonde og (5) påvisning af reportermolekylet41.
PCR-Dot-blot har visse begrænsninger, såsom teknikken giver ikke information om størrelsen af det hybridiserede fragment37, det...

Leptospirose hos mennesker stammer hovedsageligt fra miljømæssige kilder 1,2. Tilstedeværelsen af Leptospira i søer, floder og vandløb er en indikator for leptospiroseoverførsel blandt dyreliv og husdyr og produktionsdyr, der i sidste ende kan komme i kontakt med disse vandområder 1,3,4. Desuden er Leptospira blevet identificeret i ikke-naturlige kilder, herunder spildevand, stillestående vand og postevand 5,6.
Leptospira er en verdensomspændende distribueret bakterie 7,8, og miljøets rolle i dets bevarelse og transmission er blevet anerkendt. Leptospira kan overleve i drikkevand under variabel pH og mineraler9 og i naturlige vandområder1. Det kan også overleve i lange perioder i destilleret vand10, og under konstant pH (7,8) kan det overleve op til 152 dage11. Desuden kan Leptospira interagere i bakteriekonsortier for at overleve barske forhold12,13. Det kan indgå i biofilm i ferskvand med Azospirillum og Sphingomonas og er endda i stand til at vokse og udholde temperaturer på over 49 °C14,15. Det kan også formere sig i vandtæt jord og forblive levedygtigt i op til 379 dage16 og bevare dets evne til at forårsage sygdommen i så længe som et år17,18. Imidlertid er der lidt kendt om økologien inden for vandlegemer og hvordan den fordeles i dem.
Siden opdagelsen var undersøgelsen af slægten Leptospira baseret på serologiske tests. Det var først i det nuværende århundrede, at molekylære teknikker blev mere udbredt i undersøgelsen af denne spirochaete. Dot-blottet er næsten ikke blevet anvendt til identifikation ved hjælp af (1) en isotopsonde baseret på 16S rRNA og på en inter-simple sekvensgentagelse (ISSR)19,20, (2) som et nanoguldbaseret immunoassay for human leptospirose anvendt på urin21 eller (3) som et antistofbaseret assay til kvægurinprøver22. Teknikken faldt i brug, fordi den oprindeligt var baseret på isotopsonder. Det er imidlertid en velkendt teknik, der kombineret med PCR giver forbedrede resultater, og det betragtes som sikkert på grund af brugen af ikke-isotopiske sonder. PCR spiller en afgørende rolle i berigelsen af Leptospira-DNA'et ved at amplificere et specifikt DNA-fragment, der kan findes i spormængder i en prøve. Under hver PCR-cyklus fordobles mængden af det målrettede DNA-fragment i reaktionen. I slutningen af reaktionen er amplikonen blevet ganget med en faktor på mere end en million23. Produktet forstærket af PCR, ofte ikke synligt i agaroseelektroforese, bliver synligt gennem specifik hybridisering med en DIG-mærket sonde i dot-blot 24,25,26.
Dot-blot-teknikken er enkel, robust og velegnet til adskillige prøver, hvilket gør den tilgængelig for laboratorier med begrænsede ressourcer. Det har været anvendt i en række bakterieundersøgelser, herunder (1) orale bakterier27, (2) andre prøvetyper såsom mad og afføring28 og (3) identifikation af udyrkelige bakterier29, ofte i overensstemmelse med andre molekylære teknikker. Blandt fordelene ved dot-blot-teknikken er: (1) Membranen har en høj bindingskapacitet, der er i stand til at binde over 200 μg/cm2 nukleinsyrer og op til 400 μg/cm2; (2) Dot-blot-resultater kan fortolkes visuelt uden behov for særligt udstyr, og (3) de kan nemt opbevares i årevis ved stuetemperatur (RT).
Slægten Leptospira er blevet klassificeret i patogene, mellemliggende og saprofytiske klader30,31. Sondringen mellem disse klader kan opnås baseret på specifikke gener såsom lipL41, lipL32 og 16S rRNA. LipL32 er til stede i de patogene klader og udviser høj følsomhed i forskellige serologiske og molekylære værktøjer, mens det er fraværende i saprofytarter21. Husholdningsgenet lipL41 er kendt for sit stabile udtryk og anvendes i molekylære teknikker32, mens 16S rRNA-genet bruges til deres klassificering.
Denne metode kan anvendes på store mængder vand, når de er blevet koncentreret ved centrifugering. Det gør det muligt at vurdere forskellige punkter og dybder i et vandlegeme for at detektere tilstedeværelsen af leptospiral-DNA og den klade, som den tilhører. Dette værktøj er værdifuldt til både økologiske og generelle screeningsformål og kan også anvendes til at detektere andre ikke-dyrkelige bakterier, der kan være til stede i vand.
Derudover er PCR- og dot-blot-assays teknisk og økonomisk overkommelige for en lang række laboratorier, selv dem, der mangler sofistikeret eller dyrt udstyr. Denne undersøgelse har til formål at anvende den digoxigeninbaserede dot-blot til identifikation af de tre Leptospira-klader i vandprøver indsamlet fra naturlige vandområder.
Bakteriestammer Tolv Leptospira serovarer (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi og Wolffi) blev inkluderet i denne undersøgelse. Disse serovarer er en del af samlingen på Institut for Mikrobiologi og Immunologi, Det Veterinærmedicinske Fakultet og Zooteknik, National Autonomous University of Mexico, og de bruges i øjeblikket i mikroagglutinationstesten (MAT).
Alle Leptospira serovarer blev dyrket i EMJH, og deres DNA blev ekstraheret ved hjælp af et kommercielt DNA-ekstraktionssæt (se materialetabel). En genomisk DNA-blanding af de tolv serovarer blev anvendt som en positiv kontrol for den Leptospira-patogene klade. Som en positiv kontrol af Leptospira-mellemkladen blev genomisk DNA fra Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stammen BUT6 inkluderet, og som en positiv kontrol for Leptospira-saprofytkladen blev genomisk DNA fra Leptospira biflexa serovar Patoc-stammen Patoc I også inkluderet.
Negative kontroller bestod af et tomt plasmid, DNA fra ikke-relaterede bakterier (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii og Escherichia coli) og vand af PCR-kvalitet, der fungerede som ikke-skabelonkontrol.
Vandprøver Tolv prøvetagningsprøver blev indsamlet ved hjælp af en stratificeret-tilfældig prøveudtagningsmetode fra Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Disse prøver blev opnået på tre dybder: overfladisk, 10 og 30 cm (figur 1A, B). Vandopsamlingsprocedurerne påvirkede ikke nogen truede eller beskyttede arter. Hver prøve blev opsamlet i et sterilt 15 ml mikrocentrifugeglas. For at indsamle prøven blev hvert rør forsigtigt nedsænket i vandet, fyldt på den valgte dybde og derefter forseglet. Prøverne blev opbevaret ved 22 °C og straks transporteret til laboratoriet til forarbejdning.
Hver prøve blev koncentreret ved centrifugering i sterile 1,5 ml mikrocentrifugeglas ved 8000 x g i 20 minutter ved stuetemperatur. Dette trin blev gentaget, indtil alle prøverne var koncentreret i et rør, som derefter blev brugt til DNA-ekstraktion (figur 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> Figur 1: Koncentration af vandprøver ved centrifugering. (A) Vandprøvetagningsdamme, og (B) Naturlige vandløb. C) Centrifugeringsbaseret behandling af vandprøver i gentagne trin så mange gange som nødvendigt (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
DNA-ekstraktion Total DNA blev isoleret ved hjælp af et kommercielt genomisk DNA-sæt i henhold til producentens instruktioner (se materialetabel). DNA-ekstraktioner blev elueret i 20 μL elueringsbuffer, og DNA-koncentrationen blev bestemt af et UV-spektrofotometer ved 260-280 nm og opbevaret ved 4 °C indtil brug.
PCR-forstærkning PCR-målene var generne 16S rRNA, lipL41 og lipL32, som identificerer DNA fra slægten Leptospira og tillader sondring mellem de tre klader: patogen, saprofytisk og mellemliggende. Både primere og sondedesign var baseret på de tidligere værker af Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. og Branger et al.33,34,35,36,37. Sekvensen af hver sonde, primer og forstærket fragment er beskrevet i tabel 1, og deres tilpasning til referencesekvenser er angivet i supplerende fil 1, supplerende fil 2, supplerende fil 3, supplerende fil 4 og supplerende fil 5. PCR-reagenserne og termocykelbetingelserne er beskrevet i protokolafsnittet.
Amplifikationsprodukter blev visualiseret ved elektroforetisk separation på en 1% agarosegel i TAE (40 mM Tris-base, 20 mM eddikesyre og 1 mM EDTA; pH 8,3) ved 60 V i 45 minutter med ethidiumbromiddetektion, som vist i supplerende figur 1. Genomisk DNA opnået fra hver serovar blev anvendt med koncentrationer fra 6 x 106 til 1 x 104 genomiske ækvivalente kopier (GEq) i hver PCR-reaktion baseret på genomstørrelsen af L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for patogen Leptospira, genomstørrelsen af L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprofytisk Leptospira, og genomstørrelsen af L. fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 (4.267, 324 bp) med tiltrædelsesnummer AKWZ00000000.2.
Sondernes følsomhed blev vurderet med DNA fra hver patogen serovar, L. biflexa serovar Patoc stamme Patoc I og L. fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 i hvert forsøg. For at vurdere specificiteten af PCR- og dot-blot-hybridiseringsanalysen blev DNA fra ikke-relaterede bakterier inkluderet.
Tabel 1: PCR-primere og sonder til forstærkning af produkter til identifikation af patogene, saprofytiske og mellemliggende klader af Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Dot-blot hybridiseringsassay Teknikken kaldes dot-blot, fordi hullerne, hvori DNA-prøven er placeret, har en prikform, og når de suges til at blive fastgjort på plads ved vakuumsugning, får de denne form. Denne teknik blev udviklet af Kafatos et al.40. Teknikken muliggør semikvantificering af Leptospira i hver PCR-positiv prøve. Protokollen består af en denaturering med NaOH 0,4 M ved stuetemperatur, prøver med Leptospira DNA fra 30 ng til 0,05 ng, svarende til 6 x 106 til 1 x 104 leptospirer, blottes på en nylonmembran med et 96-brønds dot-blot-apparat. Efter immobilisering bindes DNA'et til membranen ved udsættelse for 120 mJ UV-lys. Hver DNA-sonde konjugeres med digoxigenin-11 dUTP ved et terminalt transferasekatalysetrin i 3'-enden (Digoxigenin er et plantesteroid opnået fra Digitalis purpurea, der anvendes som reporter41). Efter den strenge hybridisering af den mærkede DNA-sonde (50 pmol) ved den specifikke temperatur på mål-DNA'et visualiseres DNA-hybriderne ved kemiluminescensreaktionen med anti-digoxigenin alkalisk fosfataseantistof kovalent konjugeret med dets substrat CSPD. Luminescensen fanges ved udsættelse for en røntgenfilm (figur 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> Figur 2: Trin i proceduren for PCR-dot-blot-assayet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

Dot-blot er en enkel, hurtig, følsom og alsidig teknik, der muliggør identifikation af minimale mængder DNA, der specifikt er målrettet mod sondehybridisering i nærvær af bærer-DNA. Det er baseret på overførsel af en kendt mængde DNA til en inert fast støtte, såsom en nylonmembran, ved hjælp af dot-blot-apparatet og uden elektroforetisk adskillelse. Nylonmembraner har fordelen ved høj nukleinsyrebindingskapacitet (400 μg /cm2), høj styrke og er positivt eller neutralt ladede. Den anvendte sonde er et meget specifikt ssDNA-fragment på 18 til 20 baser langt mærket med digoxigenin (DIG). Sonden vil konjugere med Leptospira DNA. Når sonden er hybridiseret med mål-DNA'et, detekteres den af et anti-digoxigenin-antistof, hvilket gør det let at detektere det gennem dets emissioner afsløret i en røntgenfilm. Prikkerne med en emission svarer til DNA-fragmenterne af interesse. Denne metode anvender den ikke-isotopiske mærkning af sonden, som kan have en meget lang halveringstid. Ulempen ved denne standard immunetiket er en lavere følsomhed end isotopprober. Ikke desto mindre afbødes det ved kobling af polymerasekædereaktion (PCR) og dot-blot-assays. Denne fremgangsmåde muliggør berigelse af målsekvensen og dens detektion. Derudover kan det bruges som en kvantitativ anvendelse sammenlignet med en seriel fortynding af en velkendt standard. En dot-blot-applikation til påvisning af Leptospira fra de tre hovedklader i vandprøver præsenteres her. Denne metode kan anvendes på store mængder vand, når de er blevet koncentreret ved centrifugering for at give bevis for tilstedeværelsen af leptospiral-DNA. Dette er et værdifuldt og tilfredsstillende værktøj til generelle screeningsformål og kan bruges til andre ikke-dyrkelige bakterier, der kan være til stede i vand, hvilket forbedrer forståelsen af økosystemet.

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Forfatter Spotlight: Leptospira DNA-detektion i vand til miljøanalyse og sygdomsovervågning

Polymerasekædereaktion og dot-blot-hybridisering til detektion af leptospira i vandprøver

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

For at vurdere effektiviteten af teknikken blev genomisk DNA fra rene kulturer af hver Leptospira serovar anvendt sammen med den kladespecifikke sonde. Membraner blev fremstillet med 100 ng genomisk DNA pr. PCR-reaktion for hver serovar, efterfulgt af otte genomisk DNA fra ikke-beslægtede bakterier og variable koncentrationer af genomisk DNA fra ad hoc Leptospira serovarer. Hver analyse omfattede positiv, negativ og ikke-skabelonkontrol. Disse ikke-relaterede genomiske DNA viste ikke en affinitet for d...

I denne undersøgelse blev en dot-blot-applikation designet til at detektere Leptospira fra de tre hovedklader i vandprøver. Denne metode gør det muligt at identificere minimale DNA-mængder, der specifikt er målrettet mod en digoxigenin-mærket sonde, der let detekteres af et anti-digoxigenin-antistof. Denne tilgang er et værdifuldt og tilfredsstillende redskab til screeningsformål.

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Denne protokol er designet til at identificere tilstedeværelsen af Leptospira DNA i vandprøver. Dot-blot-teknikken bruges til dette formål, hvilket muliggør nøjagtig detektion og analyse af DNA'et. Dot-blot er en nem og alsidig ikke-isotopisk teknik og kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om miljøfordelingen af Leptospira.Denne metode har potentiale til at vurdere enorme vandområder og hjælpe med sygdomsovervågning.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.