Name: Auteur in de schijnwerpers: Leptospira DNA-detectie in water voor milieuanalyse en ziektebewaking
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

We zijn dank verschuldigd aan de Leptospira-collectie van de afdeling Microbiologie en Immunologie, Faculteit Diergeneeskunde en Zoötechniek, Nationale Autonome Universiteit van Mexico. We zijn dankbaar voor de genereuze donatie van de referentie Leptospira-stammen ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge stam BUT6 en Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I aan Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Wij danken Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, de CIBAC-coördinator, en het personeel voor hun logistieke steun. EDT maakte deel uit van het Terminal Project-programma voor niet-gegradueerde studenten van de Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. We erkennen de Biorender.com software voor het maken van figuren 1 en 3 tot en met 9.

1. Voorbereiding van het monster
<ol><li>Concentreer elk watermonster in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml door centrifugatie bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Herhaal deze stap, zo vaak als nodig is, om het monster te concentreren tot een volume van 250 μl.</li>
	<li>Gebruik de DNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Voer de specifieke PCR uit volgens de dot-blot-sonde die zal worden gebruikt (tabel 1</str...

Dot-Blot-test voor detectie van Leptospira-DNA in watermonsters

De kritieke stappen van de dot-blot-techniek omvatten (1) DNA-immobilisatie, (2) blokkering van de vrije bindingsplaatsen op het membraan met niet-homoloog DNA, (3) de complementariteit tussen de sonde en het doelfragment onder gloeiomstandigheden, (4) verwijdering van de niet-gehybridiseerde sonde en (5) de detectie van het reportermolecuul41.
De PCR-Dot-blot heeft bepaalde beperkingen, zoals het feit dat de techniek geen informatie geeft over de grootte van het gehybr...

Leptospirose bij de mens is voornamelijk afkomstig van milieubronnen 1,2. De aanwezigheid van Leptospira in meren, rivieren en beken is een indicator van de overdracht van leptospirose onder dieren in het wild en huisdieren en productiedieren die uiteindelijk in contact kunnen komen met deze watermassa's 1,3,4. Bovendien is Leptospira geïdentificeerd in niet-natuurlijke bronnen, waaronder rioolwater, stilstaand en kraanwater 5,6.
Leptospira is een wereldwijd verspreide bacterie 7,8, en de rol van het milieu bij het behoud en de overdracht ervan is algemeen erkend. Leptospira kan overleven in drinkwater met een variabele pH en mineralen9, en in natuurlijke waterlichamen1. Het kan ook lange tijd overleven in gedestilleerd water10, en onder een constante pH (7,8) kan het tot 152 dagen overleven11. Bovendien kan Leptospira interageren in bacteriële consortia om barre omstandigheden te overleven12,13. Het kan deel uitmaken van biofilms in zoet water met Azospirillum en Sphingomonas en is zelfs in staat om te groeien en temperaturen van meer dan 49 °C14,15 te doorstaan. Het kan zich ook vermenigvuldigen in drassige grond en tot 379 dagen levensvatbaar blijven16, waardoor het vermogen om de ziekte te veroorzaken tot een jaar lang behouden blijft17,18. Er is echter weinig bekend over de ecologie in waterlichamen en hoe deze daarin is verdeeld.
Sinds de ontdekking was de studie van het geslacht Leptospira gebaseerd op serologische tests. Pas in de huidige eeuw kwamen moleculaire technieken steeds vaker voor in de studie van deze spirochaete. De dot-blot is nauwelijks gebruikt voor zijn identificatie met behulp van (1) een isotopische sonde op basis van het 16S rRNA en op een inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) als een op nanogoud gebaseerde immunoassay voor menselijke leptospirose toegepast op urine21, of (3) als een op antilichamen gebaseerde test voor runderurinemonsters22. De techniek raakte in onbruik omdat deze oorspronkelijk gebaseerd was op isotopische sondes. Het is echter een bekende techniek die, in combinatie met PCR, verbeterde resultaten oplevert en als veilig wordt beschouwd vanwege het gebruik van niet-isotopische sondes. PCR speelt een cruciale rol bij de verrijking van het Leptospira-DNA door een specifiek DNA-fragment te amplificeren dat in sporenhoeveelheden in een monster kan worden aangetroffen. Tijdens elke PCR-cyclus wordt de hoeveelheid van het beoogde DNA-fragment in de reactie verdubbeld. Aan het einde van de reactie is het amplicon vermenigvuldigd met een factor van meer dan een miljoen23. Het door PCR geamplificeerde product, vaak niet zichtbaar bij agarose-elektroforese, wordt zichtbaar door specifieke hybridisatie met een DIG-gelabelde sonde in de dot-blot 24,25,26.
De dot-blot-techniek is eenvoudig, robuust en geschikt voor tal van monsters, waardoor het toegankelijk is voor laboratoria met beperkte middelen. Het is gebruikt in een verscheidenheid aan bacteriestudies, waaronder (1) orale bacteriën27, (2) andere soorten monsters zoals voedsel en ontlasting28, en (3) de identificatie van niet-kweekbare bacteriën29, vaak in overeenstemming met andere moleculaire technieken. Een van de voordelen van de dot-blot-techniek zijn: (1) Het membraan heeft een hoge bindingscapaciteit, in staat om meer dan 200 μg/cm2 nucleïnezuren en tot 400 μg/cm2 te binden; (2) Dot-blot-resultaten kunnen visueel worden geïnterpreteerd zonder dat er speciale apparatuur nodig is, en (3) ze kunnen gemakkelijk jarenlang bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard.
Het geslacht Leptospira is ingedeeld in pathogene, intermediaire en saprofytische clades30,31. Het onderscheid tussen deze clades kan worden bereikt op basis van specifieke genen zoals lipL41, lipL32 en het 16S rRNA. LipL32 is aanwezig in de pathogene clades en vertoont een hoge gevoeligheid in verschillende serologische en moleculaire instrumenten, terwijl het afwezig is in saprofytensoorten21. Het huishoudgen lipL41 staat bekend om zijn stabiele expressie en wordt gebruikt in moleculaire technieken32, terwijl het 16S rRNA-gen wordt gebruikt voor hun classificatie.
Deze methodologie kan worden toegepast op grote hoeveelheden water nadat ze zijn geconcentreerd door centrifugeren. Het maakt het mogelijk om verschillende punten en diepten in een waterlichaam te beoordelen om de aanwezigheid van leptospiraalvormig DNA en de clade waartoe het behoort te detecteren. Deze tool is waardevol voor zowel ecologische als algemene screeningsdoeleinden en kan ook worden gebruikt om andere niet-kweekbare bacteriën te detecteren die in water aanwezig kunnen zijn.
Bovendien zijn PCR- en dot-blot-assays technisch en economisch betaalbaar voor een breed scala aan laboratoria, zelfs voor laboratoria die niet over geavanceerde of dure apparatuur beschikken. Deze studie heeft tot doel de op digoxigenine gebaseerde dot-blot toe te passen voor de identificatie van de drie Leptospira-clades in watermonsters die zijn verzameld uit natuurlijke waterlichamen.
Bacteriestammen Twaalf Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi en Wolffi) werden in deze studie opgenomen. Deze serovars maken deel uit van de collectie van de afdeling Microbiologie en Immunologie, Faculteit Diergeneeskunde en Zoötechniek, Nationale Autonome Universiteit van Mexico, en ze worden momenteel gebruikt in de microagglutinatietest (MAT).
Alle Leptospira-serovars werden gekweekt in EMJH en hun DNA werd geëxtraheerd met behulp van een commerciële DNA-extractiekit (zie Materiaaltabel). Een genomische DNA-mix van de twaalf serovars werd gebruikt als positieve controle voor de pathogene clade van Leptospira . Als positieve controle van de Leptospira-intermediaire clade werd ook genoom-DNA van Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stam BUT6 opgenomen, en als positieve controle voor de Leptospira-saprofytenclade werd ook genomisch DNA van Leptospira biflexa serovar Patoc-stam Patoc I opgenomen.
Negatieve controles bestonden uit een leeg plasmide, DNA van niet-verwante bacteriën (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii en Escherichia coli), en water van PCR-kwaliteit, dat diende als niet-sjablooncontrole.
Monsters van water Twaalf proefmonsters werden verzameld met behulp van een gestratificeerde-lukrake bemonsteringsmethode van het Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Deze monsters werden verkregen op drie diepten: oppervlakkig, 10 en 30 cm (figuur 1A, B). De procedures voor het verzamelen van water hadden geen invloed op bedreigde of beschermde diersoorten. Elk monster werd verzameld in een steriele microcentrifugebuis van 15 ml. Om het monster te verzamelen, werd elke buis voorzichtig ondergedompeld in het water, op de geselecteerde diepte gevuld en vervolgens verzegeld. De monsters werden op 22 °C gehouden en onmiddellijk naar het laboratorium vervoerd voor verwerking.
Elk monster werd geconcentreerd door centrifugatie in steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 ml bij 8000 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Deze stap werd herhaald totdat alle monsters waren geconcentreerd in één buis, die vervolgens werd gebruikt voor DNA-extractie (Figuur 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> Figuur 1: Concentratie van watermonsters door centrifugatie. (A) Waterbemonsteringsvijvers en (B) Natuurlijke beken. (C) Verwerking van watermonsters op basis van centrifugatie in herhaalde stappen, zo vaak als nodig is (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
DNA-extractie Totaal DNA werd geïsoleerd met behulp van een in de handel verkrijgbare genomische DNA-kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). DNA-extracties werden geëlueerd in 20 μL elutiebuffer en de DNA-concentratie werd bepaald door een UV-spectrofotometer bij 260-280 nm en bewaard bij 4 °C tot gebruik.
PCR-amplificatie De PCR-doelen waren de 16S rRNA-, lipL41- en lipL32-genen, die DNA van het geslacht Leptospira identificeren en het onderscheid tussen de drie clades mogelijk maken: pathogeen, saprofytische en intermediairen. Zowel de primers als de sondeontwerpen waren gebaseerd op de eerdere werken van Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., en Branger et al.33,34,35,36,37. De volgorde van elke sonde, primer en geamplificeerd fragment wordt beschreven in tabel 1 en hun uitlijning met referentiesequenties wordt gegeven in aanvullend bestand 1, aanvullend bestand 2, aanvullend bestand 3, aanvullend bestand 4 en aanvullend bestand 5. De PCR-reagentia en thermocyclusvoorwaarden worden beschreven in het protocolgedeelte.
Amplificatieproducten werden gevisualiseerd door elektroforetische scheiding op een 1% agarosegel in TAE (40 mM Tris-base, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA; pH 8,3), bij 60 V gedurende 45 minuten met ethidiumbromidedetectie, zoals weergegeven in aanvullende figuur 1. Genoom-DNA verkregen van elke serovar werd gebruikt met concentraties variërend van 6 x 106 tot 1 x 104 genomische equivalente kopieën (GEq) in elke PCR-reactie, gebaseerd op de genoomgrootte van L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 voor pathogene Leptospira, de genoomgrootte van L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 voor saprofytische Leptospira, en de genoomgrootte van L. fainei serovar Hurstbridge-stam BUT6 (4, 267, 324 bp) met toetredingsnummer AKWZ00000000.2.
De gevoeligheid van de sondes werd beoordeeld met DNA van elke pathogene serovar, L. biflexa serovar Patoc stam Patoc I en L. fainei serovar Hurstbridge-stam BUT6 in elk experiment. Om de specificiteit van de PCR- en dot-blot-hybridisatietest te beoordelen, werd DNA van niet-verwante bacteriën opgenomen.
Tabel 1: PCR-primers en -sondes om producten te amplificeren voor het identificeren van de pathogene, saprofyt- en intermediaire clades van Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Dot-blot hybridisatie-test De techniek wordt dot-blot genoemd omdat de gaten waarin het DNA-monster wordt geplaatst een puntvorm hebben, en wanneer ze worden opgezogen om op hun plaats te worden gefixeerd door vacuümzuiging, krijgen ze deze vorm. Deze techniek is ontwikkeld door Kafatos et al.40. De techniek maakt de semi-kwantificering van Leptospira in elk PCR-positief monster mogelijk. Het protocol bestaat uit een denaturatie met NaOH 0,4 M bij kamertemperatuur, monsters met Leptospira-DNA van 30 ng tot 0,05 ng, overeenkomend met 6 x 106 tot 1 x 104 leptospiren, worden gedept op een nylon membraan met een dot-blot-apparaat met 96 putjes. Na immobilisatie wordt het DNA aan het membraan gebonden door blootstelling aan 120 mJ UV-licht. Elke DNA-sonde wordt geconjugeerd met digoxigenine-11 dUTP door een terminale transferasekatalysestap aan het 3'-uiteinde (Digoxigenine is een plantaardige steroïde verkregen uit Digitalis purpurea, gebruikt als verslaggever41). Na de strikte hybridisatie van de gelabelde DNA-sonde (50 pmol) bij de specifieke temperatuur op het doel-DNA, worden de DNA-hybriden gevisualiseerd door de chemiluminescentiereactie met het anti-digoxigenine alkalische fosfatase-antilichaam dat covalent is geconjugeerd met zijn substraat CSPD. De luminescentie wordt vastgelegd door blootstelling aan een röntgenfilm (figuur 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> Figuur 2: Stappen van de procedure voor de PCR-dot-blot-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

De dot-blot is een eenvoudige, snelle, gevoelige en veelzijdige techniek die de identificatie mogelijk maakt van minimale hoeveelheden DNA die specifiek het doelwit zijn van sondehybridisatie in aanwezigheid van drager-DNA. Het is gebaseerd op de overdracht van een bekende hoeveelheid DNA op een inerte vaste drager, zoals een nylon membraan, met behulp van het dot-blot-apparaat en zonder elektroforetische scheiding. Nylonmembranen hebben het voordeel van een hoog nucleïnezuurbindend vermogen (400 μg/cm2), een hoge sterkte en zijn positief of neutraal geladen. De gebruikte sonde is een zeer specifiek ssDNA-fragment van 18 tot 20 basen dat lang is gelabeld met digoxigenine (DIG). De sonde zal zich conjugeren met het Leptospira-DNA . Zodra de sonde is gehybridiseerd met het doel-DNA, wordt deze gedetecteerd door een anti-digoxigenine-antilichaam, waardoor deze gemakkelijk kan worden gedetecteerd door de emissies die worden onthuld in een röntgenfilm. De stippen met een emissie komen overeen met de DNA-fragmenten die van belang zijn. Deze methode maakt gebruik van de niet-isotopische etikettering van de sonde, die een zeer lange halfwaardetijd kan hebben. Het nadeel van dit standaard immunolabel is een lagere gevoeligheid dan isotopensondes. Desalniettemin wordt het beperkt door polymerasekettingreactie (PCR) en dot-blot-assays te koppelen. Deze aanpak maakt de verrijking van de doelsequentie en de detectie ervan mogelijk. Bovendien kan het worden gebruikt als een kwantitatieve toepassing in vergelijking met een seriële verdunning van een bekende standaard. Een dot-blot-toepassing om Leptospira te detecteren van de drie belangrijkste clades in watermonsters wordt hier gepresenteerd. Deze methodologie kan worden toegepast op grote hoeveelheden water nadat ze zijn geconcentreerd door centrifugatie om bewijs te leveren van de aanwezigheid van Leptospiral DNA. Dit is een waardevol en bevredigend hulpmiddel voor algemene screeningsdoeleinden en kan worden gebruikt voor andere niet-kweekbare bacteriën die in water aanwezig kunnen zijn, waardoor het begrip van het ecosysteem wordt verbeterd.

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Auteur in de schijnwerpers: Leptospira DNA-detectie in water voor milieuanalyse en ziektebewaking

Polymerasekettingreactie en dot-blot-hybridisatie voor leptospira-detectie in watermonsters

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

Om de effectiviteit van de techniek te beoordelen, werd genomisch DNA uit zuivere culturen van elke Leptospira serovar gebruikt, samen met de clade-specifieke sonde. Membranen werden geprepareerd met 100 ng genoom-DNA per PCR-reactie voor elke serovar, gevolgd door acht genomische DNA van niet-verwante bacteriën en variabele concentraties genomisch DNA van de ad-hoc Leptospira-serovars . Elke test omvatte positieve, negatieve en niet-sjablooncontrole. Dit niet-verwante genomische DNA vertoonde geen aff...

In deze studie werd een dot-blot-applicatie ontworpen om Leptospira te detecteren van de drie belangrijkste clades in watermonsters. Deze methode maakt de identificatie mogelijk van minimale DNA-hoeveelheden die specifiek het doelwit zijn van een digoxigenine-gelabelde sonde, die gemakkelijk kan worden gedetecteerd door een anti-digoxigenine-antilichaam. Deze aanpak is een waardevol en bevredigend instrument voor screeningsdoeleinden.

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Dit protocol is ontworpen om de aanwezigheid van Leptospira-DNA in watermonsters te identificeren. Hiervoor wordt de dot-blot-techniek gebruikt, die een nauwkeurige detectie en analyse van het DNA mogelijk maakt. De dot-blot is een eenvoudige en veelzijdige niet-isotopische techniek en kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de verspreiding van Leptospira in het milieu.Deze methode heeft het potentieel om enorme waterlichamen te beoordelen en te helpen bij het toezicht op ziekten.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.