Name: Pleins feux sur l’auteur : Détection de l’ADN de leptospira dans l’eau pour l’analyse environnementale et la surveillance des maladies
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Nous sommes redevables à la collection Leptospira du Département de Microbiologie et d’Immunologie, Faculté de Médecine Vétérinaire et de Zootechnie, Université Nationale Autonome du Mexique. Nous sommes reconnaissants pour le généreux don des souches de référence Leptospira  ; Leptospira fainei sérovar Hurstbridge souche BUT6 et Leptospira biflexa sérovar Patoc souche Patoc I au Dr Alejandro de la Peña Moctezuma. Nous remercions le Dr José Antonio Ocampo Cervantes, le coordinateur du CIBAC, et le personnel pour leur soutien logistique. EDT s’inscrivait dans le cadre du programme Terminal Project pour les étudiants de premier cycle de l’Université autonome métropolitaine-Campus Cuajimalpa. Nous remercions le logiciel Biorender.com pour la création des figures 1 et 3 à 9.

1. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Concentrer chaque échantillon d’eau dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Répétez cette étape, autant de fois que nécessaire, pour concentrer l’échantillon dans un volume de 250 μL.</li>
	<li>Utilisez le kit d’extraction d’ADN conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Effectuez la PCR spécifique en fonctio...

Dosage Dot-Blot pour la détection de l’ADN de Leptospira dans des échantillons d’eau

Les étapes critiques de la technique dot-blot comprennent (1) l’immobilisation de l’ADN, (2) le blocage des sites de liaison libres sur la membrane avec de l’ADN non homologue, (3) la complémentarité entre la sonde et le fragment cible dans des conditions de recuit, (4) l’élimination de la sonde non hybridée et (5) la détection de la molécule rapporteure41.
La PCR-Dot-blot présente certaines limites, telles que la technique ne fournit pas d’information...

La leptospirose chez l’homme provient principalement de sources environnementales 1,2. La présence de Leptospira dans les lacs, les rivières et les ruisseaux est un indicateur de la transmission de la leptospirose chez les animaux sauvages et les animaux domestiques et de production qui peuvent éventuellement entrer en contact avec ces plans d’eau 1,3,4. De plus, Leptospira a été identifié dans des sources non naturelles, notamment dans les eaux usées, l’eau stagnante et l’eau du robinet 5,6.
Leptospira est une bactérie distribuée dans le monde entier 7,8, et le rôle de l’environnement dans sa préservation et sa transmission a été bien reconnu. Leptospira peut survivre dans l’eau potable sous un pH variable et des minéraux9, et dans des plans d’eau naturels1. Il peut également survivre pendant de longues périodes dans l’eau distillée10, et sous un pH constant (7,8), il peut survivre jusqu’à 152 jours11. De plus, Leptospira peut interagir dans des consortiums bactériens pour survivre à des conditions difficiles12,13. Il peut faire partie de biofilms en eau douce avec Azospirillum et Sphingomonas et est même capable de croître et de supporter des températures supérieures à 49 °C14,15. Il peut également se multiplier dans un sol gorgé d’eau et rester viable jusqu’à 379 jours16, préservant sa capacité à provoquer la maladie jusqu’à un an17,18. Cependant, on sait peu de choses sur l’écologie des masses d’eau et sur la façon dont elle y est distribuée.
Depuis sa découverte, l’étude du genre Leptospira s’est basée sur des tests sérologiques. Ce n’est qu’au cours du siècle actuel que les techniques moléculaires sont devenues plus répandues dans l’étude de ce spirochète. Le dot-blot a été à peine utilisé pour son identification à l’aide (1) d’une sonde isotopique basée sur l’ARNr 16S et sur une répétition de séquence inter-simple (ISSR)19,20, (2) en tant qu’immunodosage basé sur le nanogold pour la leptospirose humaine appliquée à l’urine21, ou (3) en tant que test basé sur des anticorps pour des échantillons d’urine bovine22. La technique est tombée en désuétude car elle était à l’origine basée sur des sondes isotopiques. Cependant, il s’agit d’une technique bien connue qui, associée à la PCR, donne de meilleurs résultats et est considérée comme sûre en raison de l’utilisation de sondes non isotopiques. La PCR joue un rôle crucial dans l’enrichissement de l’ADN de Leptospira en amplifiant un fragment d’ADN spécifique qui peut être trouvé à l’état de traces dans un échantillon. Au cours de chaque cycle de PCR, la quantité du fragment d’ADN ciblé est doublée dans la réaction. À la fin de la réaction, l’amplicon a été multiplié par un facteur de plus d’un million23. Le produit amplifié par PCR, souvent non visible dans l’électrophorèse de l’agarose, devient visible par hybridation spécifique avec une sonde marquée DIG dans le dot-blot 24,25,26.
La technique dot-blot est simple, robuste et adaptée à de nombreux échantillons, ce qui la rend accessible aux laboratoires disposant de ressources limitées. Il a été utilisé dans une variété d’études sur les bactéries, y compris (1) les bactéries buccales27, (2) d’autres types d’échantillons tels que les aliments et les matières fécales28, et (3) l’identification de bactéries incultivables29, souvent en accord avec d’autres techniques moléculaires. Parmi les avantages offerts par la technique dot-blot figurent : (1) La membrane a une capacité de liaison élevée, capable de lier plus de 200 μg/cm2 d’acides nucléiques et jusqu’à 400 μg/cm2 ; (2) Les résultats Dot-blot peuvent être interprétés visuellement sans nécessiter d’équipement spécial, et (3) ils peuvent être stockés pendant des années à température ambiante (RT).
Le genre Leptospira a été classé en clades pathogènes, intermédiaires et saprophytes30,31. La distinction entre ces clades peut être obtenue sur la base de gènes spécifiques tels que lipL41, lipL32 et l’ARNr 16S. LipL32 est présent dans les clades pathogènes et présente une grande sensibilité dans divers outils sérologiques et moléculaires, alors qu’il est absent chez les espèces de saprophytes21. Le gène ménager lipL41 est connu pour son expression stable et utilisé dans les techniques moléculaires32, tandis que le gène de l’ARNr 16S est utilisé pour leur classification.
Cette méthodologie peut être appliquée à de grands volumes d’eau une fois qu’ils ont été concentrés par centrifugation. Il permet d’évaluer différents points et profondeurs au sein d’un plan d’eau afin de détecter la présence d’ADN leptospiralé et du clade auquel il appartient. Cet outil est précieux à des fins de dépistage écologique et général et peut également être utilisé pour détecter d’autres bactéries non cultivables qui peuvent être présentes dans l’eau.
De plus, les tests PCR et dot-blot sont techniquement et économiquement abordables pour un large éventail de laboratoires, même ceux qui ne disposent pas d’équipements sophistiqués ou coûteux. Cette étude vise à appliquer le dot-blot à base de digoxigénine pour l’identification des trois clades de Leptospira dans des échantillons d’eau prélevés dans des plans d’eau naturels.
Souches bactériennes Douze sérovars de Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi et Wolffi) ont été inclus dans cette étude. Ces sérotypes font partie de la collection du Département de microbiologie et d’immunologie de la Faculté de médecine vétérinaire et de zootechnie de l’Université nationale autonome du Mexique, et ils sont actuellement utilisés dans le test de microagglutination (MAT).
Tous les sérotypes de Leptospira ont été cultivés dans l’EMJH, et leur ADN a été extrait à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN commerciale (voir le tableau des matériaux). Un mélange d’ADN génomique des douze sérovars a été utilisé comme contrôle positif pour le clade pathogène de Leptospira . En tant que contrôle positif du clade intermédiaire de Leptospira , l’ADN génomique de la souche BUT6 du sérotype Hurstbridge de Leptospira fainei a été inclus, et en tant que contrôle positif du clade des saprophytes de Leptospira , l’ADN génomique de la sérotype de Leptospira biflexa de la souche Patoc I a également été inclus.
Les témoins négatifs étaient constitués d’un plasmide vide, d’ADN provenant de bactéries non apparentées (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii et Escherichia coli) et d’eau de qualité PCR, qui a servi de témoin non matriciel.
Échantillons d’eau Douze échantillons choisis ont été prélevés à l’aide d’une méthode d’échantillonnage stratifié-aléatoire du Centre de recherche biologique et aquacole de Cuemanco (CIBAC) (19° 16' 54 » N 99° 6' 11 » O). Ces échantillons ont été obtenus à trois profondeurs : superficielle, 10 et 30 cm (figures 1A, B). Les procédures de collecte de l’eau n’ont eu aucun impact sur les espèces menacées ou protégées. Chaque échantillon a été prélevé dans un tube à microcentrifuger stérile de 15 ml. Pour recueillir l’échantillon, chaque tube a été doucement immergé dans l’eau, rempli à la profondeur sélectionnée, puis scellé. Les échantillons ont été maintenus à 22 °C et rapidement transportés au laboratoire pour être traités.
Chaque échantillon a été concentré par centrifugation dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL à 8000 x g pendant 20 min à température ambiante. Cette étape a été répétée jusqu’à ce que tous les échantillons soient concentrés dans un seul tube, qui a ensuite été utilisé pour l’extraction de l’ADN (figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> Figure 1 : Concentration des échantillons d’eau par centrifugation. (A) Bassins d’échantillonnage d’eau, et (B) Cours d’eau naturels. (C) Traitement d’échantillons d’eau par centrifugation en plusieurs étapes autant de fois que nécessaire (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Extraction de l’ADN L’ADN total a été isolé à l’aide d’un kit d’ADN génomique commercial conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Les extractions d’ADN ont été éluées dans 20 μL de tampon d’élution, et la concentration d’ADN a été déterminée par un spectrophotomètre UV à 260-280 nm, et stockée à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
Amplification par PCR Les cibles de la PCR étaient les 16 gènes de l’ARNrS, lipL41 et lipL32, qui identifient l’ADN du genre Leptospira et permettent de distinguer les trois clades : pathogène, saprophyte et intermédiaire. Les conceptions des amorces et des sondes étaient basées sur les travaux antérieurs d’Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., et Branger et al.33,34,35,36,37. La séquence de chaque sonde, amorce et fragment amplifié est décrite dans le Tableau 1, et leur alignement avec les séquences de référence est fourni dans le Fichier supplémentaire 1, le Fichier supplémentaire 2, le Fichier supplémentaire 3, le Fichier supplémentaire 4 et le Fichier supplémentaire 5. Les réactifs de PCR et les conditions de thermocyclage sont décrits dans la section protocole.
Les produits d’amplification ont été visualisés par séparation électrophorétique sur un gel d’agarose à 1 % dans un TAE (40 mM de base Tris, 20 mM d’acide acétique et 1 mM d’EDTA ; pH 8,3), à 60 V pendant 45 min avec détection au bromure d’éthidium, comme le montre la figure supplémentaire 1. L’ADN génomique obtenu à partir de chaque sérotype a été utilisé avec des concentrations allant de 6 x 106 à 1 x 104 copies équivalentes génomiques (GEq) dans chaque réaction PCR, sur la base de la taille du génome de L. interrogans (4 691, 184 pb)38 pour Leptospira pathogène, de la taille du génome de L. biflexa (3 956, 088 pb)39 pour Leptospira saprophyte, et la taille du génome de la souche BUT6 du sérovar de L. fainei Hurstbridge (4 267, 324 pb) avec le numéro d’accession AKWZ00000000,2.
La sensibilité des sondes a été évaluée à l’aide de l’ADN de chaque sérotype pathogène, de la souche sérovar Patoc I de L. biflexa et de la souche BUT6 de Hurstbridge sérovar de L. fainei . Pour évaluer la spécificité de la PCR et de l’essai d’hybridation par transfert de points, on a inclus de l’ADN de bactéries non apparentées.
Tableau 1 : Amorces et sondes PCR pour amplifier les produits d’identification des clades pathogènes, saprophytes et intermédiaires de Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Essai d’hybridation dot-blot La technique est appelée dot-blot car les trous dans lesquels l’échantillon d’ADN est placé ont une forme de point, et lorsqu’ils sont aspirés pour être fixés en place par aspiration sous vide, ils acquièrent cette forme. Cette technique a été mise au point par Kafatos et al.40. La technique permet la semi-quantification de Leptospira dans chaque échantillon positif à la PCR. Le protocole consiste en une dénaturation avec du NaOH 0,4 M à température ambiante, des échantillons avec de l’ADN de Leptospira de 30 ng à 0,05 ng, correspondant à 6 x 106 à 1 x 104 leptospires, sont tamponnés sur une membrane en nylon avec un appareil de transfert de points de 96 puits. Après l’immobilisation, l’ADN est lié à la membrane par l’exposition à une lumière UV de 120 mJ. Chaque sonde d’ADN est conjuguée avec la digoxigénine-11 dUTP par une étape de catalyse terminale de la transférase à l’extrémité 3' (la digoxigénine est un stéroïde végétal obtenu à partir de Digitalis purpurea, utilisé comme rapporteur41). Suite à l’hybridation rigoureuse de la sonde d’ADN marquée (50 pmol) à la température spécifique sur l’ADN cible, les hybrides d’ADN sont visualisés par la réaction de chimiluminescence avec l’anticorps anti-digoxigénine phosphatase alcaline conjugué de manière covalente avec son substrat CSPD. La luminescence est capturée par l’exposition à un film radiographique (figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> Figure 2 : Étapes de la procédure pour le test PCR-dot-blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

Le dot-blot est une technique simple, rapide, sensible et polyvalente qui permet d’identifier des quantités minimales d’ADN spécifiquement ciblées par hybridation par sonde en présence d’ADN porteur. Il est basé sur le transfert d’une quantité connue d’ADN sur un support solide inerte, tel qu’une membrane en nylon, à l’aide de l’appareil dot-blot et sans séparation électrophorétique. Les membranes en nylon ont l’avantage d’avoir une capacité de liaison élevée des acides nucléiques (400 μg/cm2), une résistance élevée et une charge positive ou neutre. La sonde utilisée est un fragment d’ADNsb très spécifique de 18 à 20 bases de long marqué à la digoxigénine (DIG). La sonde se conjuguera avec l’ADN de Leptospira . Une fois que la sonde s’est hybridée avec l’ADN cible, elle est détectée par un anticorps anti-digoxigénine, ce qui permet sa détection facile grâce à ses émissions révélées dans un film radiographique. Les points avec une émission correspondront aux fragments d’ADN d’intérêt. Cette méthode utilise le marquage non isotopique de la sonde, qui peut avoir une demi-vie très longue. L’inconvénient de cet immuno-marqueur standard est une sensibilité plus faible que celle des sondes isotopiques. Néanmoins, elle est atténuée par le couplage de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et des tests dot-blot. Cette approche permet l’enrichissement de la séquence cible et sa détection. De plus, il peut être utilisé comme une application quantitative par rapport à une dilution en série d’un étalon bien connu. Une application dot-blot pour détecter Leptospira dans les trois clades principaux dans des échantillons d’eau est présentée ici. Cette méthodologie peut être appliquée à de grandes quantités d’eau une fois qu’elles ont été concentrées par centrifugation pour fournir des preuves de la présence d’ADN leptospiralé. Il s’agit d’un outil précieux et satisfaisant à des fins de dépistage général, et il peut être utilisé pour d’autres bactéries non cultivables qui peuvent être présentes dans l’eau, améliorant ainsi la compréhension de l’écosystème.

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Pleins feux sur l’auteur : Détection de l’ADN de leptospira dans l’eau pour l’analyse environnementale et la surveillance des maladies

Réaction en chaîne par polymérase et hybridation par transfert de points pour la détection de leptospires dans des échantillons d’eau

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

Pour évaluer l’efficacité de la technique, l’ADN génomique de cultures pures de chaque sérovar de Leptospira a été utilisé, ainsi que la sonde spécifique au clade. Des membranes ont été préparées avec 100 ng d’ADN génomique par réaction PCR pour chaque sérotype, suivis de huit ADN génomiques de bactéries non apparentées et de concentrations variables d’ADN génomique des sérovars ad hoc de Leptospira. Chaque test comprenait des contrôles positifs, négatifs et non matrimoniau...

Dans cette étude, une application dot-blot a été conçue pour détecter Leptospira dans les trois clades principaux dans des échantillons d’eau. Cette méthode permet d’identifier des quantités minimales d’ADN spécifiquement ciblées par une sonde marquée à la digoxigénine, facilement détectées par un anticorps anti-digoxigénine. Cette approche est un outil précieux et satisfaisant à des fins de dépistage.

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Ce protocole est conçu pour identifier la présence d’ADN de Leptospira dans les échantillons d’eau. La technique dot-blot est utilisée à cette fin, ce qui permet une détection et une analyse précises de l’ADN. Le dot-blot est une technique non isotopique facile et polyvalente qui peut aider à répondre à des questions clés sur la distribution environnementale de Leptospira.Cette méthode a le potentiel d’évaluer d’énormes étendues d’eau et de contribuer à la surveillance des maladies.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.