Name: Autor im Rampenlicht: Leptospira-DNA-Nachweis in Wasser für die Umweltanalytik und Krankheitsüberwachung
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Wir sind der Leptospira-Sammlung der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie der Fakultät für Veterinärmedizin und Tierzucht der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko zu Dank verpflichtet. Wir danken für die großzügige Spende der Referenz-Leptospira-Stämme ; Leptospira fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 und Leptospira biflexa Serovar Patoc Stamm Patoc I an Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Wir danken Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, dem CIBAC-Koordinator, und dem Personal für ihre logistische Unterstützung. EDT war Teil des Terminal-Projektprogramms für Studenten im Grundstudium der Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. Wir weisen auf die Biorender.com Software für die Erstellung der Abbildungen 1 und 3 bis 9 hin.

1. Vorbereitung der Probe
<ol><li>Jede Wasserprobe wird in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C konzentriert. Wiederholen Sie diesen Schritt so oft wie nötig, um die Probe auf ein Volumen von 250 μl zu konzentrieren.</li>
	<li>Verwenden Sie das DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Führen Sie die spezifische PCR entsprechend der zu verwendenden Dot-Blot-Sonde durch ...

Dot-Blot-Assay zum Nachweis von Leptospiren-DNA in Wasserproben

Zu den kritischen Schritten der Dot-Blot-Technik gehören (1) DNA-Immobilisierung, (2) Blockierung der freien Bindungsstellen auf der Membran mit nicht-homologer DNA, (3) die Komplementarität zwischen der Sonde und dem Zielfragment unter Annealing-Bedingungen, (4) die Entfernung der nicht hybridisierten Sonde und (5) der Nachweis des Reportermoleküls41.
Der PCR-Dot-Blot weist bestimmte Einschränkungen auf, wie z.B. dass die Technik keine Informationen über die Grö?...

Die Leptospirose beim Menschen hat hauptsächlich ihren Ursprung in der Umwelt 1,2. Das Vorkommen von Leptospira in Seen, Flüssen und Bächen ist ein Indikator für die Übertragung von Leptospirose unter Wildtieren sowie Haus- und Nutztieren, die schließlich mit diesen Gewässern in Kontakt kommen können 1,3,4. Darüber hinaus wurde Leptospira in nicht-natürlichen Quellen wie Abwasser, stehendem Wasser und Leitungswasser nachgewiesen 5,6.
Leptospira ist ein weltweit verbreitetes Bakterium 7,8, und die Rolle der Umwelt bei ihrer Erhaltung und Übertragung ist allgemein anerkannt. Leptospira kann im Trinkwasser bei variablem pH-Wert und unterschiedlichen Mineralienüberleben 9 und in natürlichen Gewässern1. Es kann auch über lange Zeiträume in destilliertem Wasserüberleben 10, und bei konstantem pH-Wert (7,8) kann es bis zu 152 Tage überleben11. Darüber hinaus können Leptospiren in bakteriellen Konsortien interagieren, um unter rauen Bedingungen zu überleben12,13. Es kann Teil von Biofilmen im Süßwasser mit Azospirillum und Sphingomonas sein und ist sogar in der Lage, zu wachsen und Temperaturen von über 49 °C zu ertragen14,15. Sie kann sich auch in durchnässten Böden vermehren und bis zu 379 Tage lang lebensfähig bleiben16, wobei ihre Fähigkeit, die Krankheit zu verursachen, bis zu einem Jahr lang erhalten bleibt17,18. Über die Ökologie in Gewässern und deren Verteilung in den Gewässern ist jedoch nur wenig bekannt.
Seit ihrer Entdeckung basierte die Erforschung der Gattung Leptospira auf serologischen Untersuchungen. Erst in diesem Jahrhundert wurden molekulare Techniken bei der Erforschung dieser Spirochäten immer häufiger eingesetzt. Der Dot-Blot wurde bisher kaum für seine Identifizierung verwendet, wobei (1) eine Isotopensonde auf der Basis der 16S rRNA und ein Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)19,20, (2) als Nanogold-basierter Immunoassay für humane Leptospirose, der auf Urin angewendet wurde21, oder (3) als Antikörper-basierter Assay für Rinderurinprobenverwendet wurde 22. Die Technik geriet in Vergessenheit, da sie ursprünglich auf Isotopensonden basierte. Es handelt sich jedoch um eine bekannte Technik, die in Verbindung mit der PCR verbesserte Ergebnisse liefert und aufgrund der Verwendung von nicht-isotopischen Sonden als sicher gilt. Die PCR spielt eine entscheidende Rolle bei der Anreicherung der Leptospira-DNA, indem ein spezifisches DNA-Fragment amplifiziert wird, das in Spuren in einer Probe vorkommen kann. Während jedes PCR-Zyklus wird die Menge des Ziel-DNA-Fragments in der Reaktion verdoppelt. Am Ende der Reaktion wurde das Amplikon mit dem Faktor von mehr als einer Millionmultipliziert 23. Das durch PCR amplifizierte Produkt, das in der Agaroseelektrophorese oft nicht sichtbar ist, wird durch spezifische Hybridisierung mit einer DIG-markierten Sonde im Dot-Blot 24,25,26 sichtbar.
Die Dot-Blot-Technik ist einfach, robust und für zahlreiche Proben geeignet, so dass sie auch für Labore mit begrenzten Ressourcen zugänglich ist. Es wurde in einer Vielzahl von Bakterienstudien eingesetzt, einschließlich (1) oraler Bakterien27, (2) anderer Probentypen wie Lebensmittel und Kot28 und (3) der Identifizierung von nicht kultivierbaren Bakterien29, oft in Übereinstimmung mit anderen molekularen Techniken. Zu den Vorteilen der Dot-Blot-Technik gehören: (1) Die Membran hat eine hohe Bindungskapazität und kann über 200 μg/cm2 Nukleinsäuren und bis zu 400 μg/cm2 binden; (2) Dot-Blot-Ergebnisse können visuell interpretiert werden, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind, und (3) sie können bequem jahrelang bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.
Die Gattung Leptospira wurde in pathogene, intermediäre und saprophytische Kladen eingeteilt 30,31. Die Unterscheidung zwischen diesen Kladen kann anhand spezifischer Gene wie lipL41, lipL32 und der 16S rRNA erreicht werden. LipL32 ist in den pathogenen Kladen vorhanden und zeigt eine hohe Sensitivität in verschiedenen serologischen und molekularen Werkzeugen, während es in Saprophytenspezies21 nicht vorhanden ist. Das Housekeeping-Gen lipL41 ist für seine stabile Expression bekannt und wird in molekularen Verfahren32 verwendet, während das16 S rRNA-Gen für ihre Klassifizierung verwendet wird.
Diese Methode kann auf große Wassermengen angewendet werden, sobald sie durch Zentrifugation konzentriert wurden. Es ermöglicht die Beurteilung verschiedener Punkte und Tiefen innerhalb eines Gewässers, um das Vorhandensein von leptospiraliger DNA und der Klade, zu der sie gehört, nachzuweisen. Dieses Instrument ist sowohl für ökologische als auch für allgemeine Screening-Zwecke wertvoll und kann auch zum Nachweis anderer nicht kultivierbarer Bakterien eingesetzt werden, die möglicherweise im Wasser vorhanden sind.
Darüber hinaus sind PCR- und Dot-Blot-Assays für eine Vielzahl von Laboren technisch und wirtschaftlich erschwinglich, selbst für solche, die nicht über hochentwickelte oder teure Geräte verfügen. Ziel dieser Studie ist es, den Digoxigenin-basierten Dot-Blot zur Identifizierung der drei Leptospira-Kladen in Wasserproben einzusetzen, die aus natürlichen Gewässern entnommen wurden.
Bakterienstämme Zwölf Leptospira-Serovare (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi und Wolffi) wurden in diese Studie eingeschlossen. Diese Serovare sind Teil der Sammlung der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie der Fakultät für Veterinärmedizin und Tierzucht der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko und werden derzeit im Mikroagglutinationstest (MAT) verwendet.
Alle Leptospira-Serovare wurden in EMJH kultiviert, und ihre DNA wurde mit einem kommerziellen DNA-Extraktionskit extrahiert (siehe Materialtabelle). Ein genomischer DNA-Mix der zwölf Serovare wurde als Positivkontrolle für die pathogene Leptospira-Klade verwendet. Als Positivkontrolle der Leptospira-Intermediärklade wurde die genomische DNA von Leptospira fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 eingeschlossen, und als Positivkontrolle für die Leptospira Saprophytenklade wurde auch die genomische DNA von Leptospira biflexa serovar Patoc Stamm Patoc I eingeschlossen.
Die Negativkontrollen bestanden aus einem leeren Plasmid, DNA von nicht verwandten Bakterien (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii und Escherichia coli) und Wasser in PCR-Qualität, das als Nicht-Template-Kontrolle diente.
Wasserproben Zwölf Versuchsproben wurden unter Verwendung einer geschichtet-zufälligen Probenahmemethode vom Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W) entnommen. Diese Proben wurden in drei Tiefen entnommen: oberflächlich, 10 und 30 cm (Abbildung 1A, B). Die Wasserentnahmeverfahren hatten keine Auswirkungen auf gefährdete oder geschützte Arten. Jede Probe wurde in einem sterilen 15-ml-Mikrozentrifugenröhrchen entnommen. Um die Probe zu entnehmen, wurde jedes Röhrchen vorsichtig in das Wasser getaucht, in der gewählten Tiefe gefüllt und dann verschlossen. Die Proben wurden bei 22 °C gehalten und umgehend zur Verarbeitung ins Labor transportiert.
Jede Probe wurde durch Zentrifugation in sterilen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen bei 8000 x g für 20 min bei Raumtemperatur konzentriert. Dieser Schritt wurde wiederholt, bis alle Proben in einem Röhrchen konzentriert waren, das dann für die DNA-Extraktion verwendet wurde (Abbildung 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Konzentration der Wasserproben durch Zentrifugation. (A) Wasserprobenteiche und (B) Natürliche Bäche. (C) Zentrifugationsbasierte Verarbeitung von Wasserproben in wiederholten Schritten so oft wie nötig (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
DNA-Extraktion Die Gesamt-DNA wurde mit einem handelsüblichen genomischen DNA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert (siehe Materialtabelle). DNA-Extraktionen wurden in 20 μl Elutionspuffer eluiert, und die DNA-Konzentration wurde mit einem UV-Spektrophotometer bei 260-280 nm bestimmt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.
PCR-Amplifikation Die PCR-Ziele waren die 16Gene S rRNA, lipL41 und lipL32, die DNA der Gattung Leptospira identifizieren und die Unterscheidung zwischen den drei Kladen pathogen, saprophytisch und intermediär ermöglichen. Sowohl die Primer als auch die Sondendesigns basierten auf den früheren Arbeiten von Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. und Branger et al.33,34,35,36,37. Die Sequenz jeder Sonde, jedes Primers und jedes amplifizierten Fragments ist in Tabelle 1 beschrieben, und ihre Ausrichtung mit den Referenzsequenzen ist in der Zusatzdatei 1, der Zusatzdatei 2, der Zusatzdatei 3, der Zusatzdatei 4 und der Zusatzdatei 5 angegeben. Die PCR-Reagenzien und Thermocycling-Bedingungen werden im Abschnitt Protokoll beschrieben.
Die Amplifikationsprodukte wurden durch elektrophoretische Trennung an einem 1%igen Agarosegel in TAE (40 mM Trisbase, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA; pH 8,3) bei 60 V für 45 min mit Ethidium-Bromid-Detektion visualisiert, wie in der ergänzenden Abbildung 1 gezeigt. Genomische DNA, die aus jedem Serovar gewonnen wurde, wurde mit Konzentrationen von 6 x 106 bis 1 x 104 genomischen Äquivalentkopien (GEq) in jeder PCR-Reaktion verwendet, basierend auf der Genomgröße von L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 für pathogene Leptospira, der Genomgröße von L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 für saprophytische Leptospira, und die Genomgröße des L . fainei Serovars Hurstbridge Stamm BUT6 (4, 267, 324 bp) mit der Zugangsnummer AKWZ00000000.2.
Die Sensitivität der Sonden wurde in jedem Experiment mit DNA aus jedem pathogenen Serovar, dem L . biflexa Serovar Patoc Stamm Patoc I und dem L. fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 bewertet. Um die Spezifität des PCR- und Dot-Blot-Hybridisierungsassays zu beurteilen, wurde DNA von nicht verwandten Bakterien einbezogen.
Tabelle 1: PCR-Primer und -Sonden zur Amplifikation von Produkten zur Identifizierung der pathogenen, Saprophyten- und intermediären Kladen von Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Dot-Blot-Hybridisierungs-Assay Die Technik wird als Dot-Blot bezeichnet, da die Löcher, in die die DNA-Probe gelegt wird, eine Punktform haben, und wenn sie angesaugt werden, um durch Vakuumsaugen fixiert zu werden, erhalten sie diese Form. Diese Technik wurde von Kafatos et al.40 entwickelt. Die Technik ermöglicht die Semi-Quantifizierung von Leptospiren in jeder PCR-positiven Probe. Das Protokoll besteht aus einer Denaturierung mit NaOH 0,4 M bei Raumtemperatur, Proben mit Leptospira-DNA von 30 ng bis 0,05 ng, entsprechend 6 x 106 bis 1 x 104 Leptospiren, werden mit einem 96-Well-Dot-Blot-Gerät auf eine Nylonmembran blott. Nach der Immobilisierung wird die DNA durch Einwirkung von 120 mJ UV-Licht an die Membran gebunden. Jede DNA-Sonde wird durch einen terminalen Transferase-Katalyseschritt am 3'-Ende mit Digoxigenin-11 dUTP konjugiert (Digoxigenin ist ein pflanzliches Steroid, das aus Digitalis purpurea gewonnen wird und als Reporter41 verwendet wird). Nach der stringenten Hybridisierung der markierten DNA-Sonde (50 pmol) bei der spezifischen Temperatur auf die Ziel-DNA werden die DNA-Hybride durch die Chemilumineszenzreaktion mit dem anti-Digoxigenin-alkalischen Phosphatase-Antikörper, der kovalent mit seinem Substrat CSPD konjugiert ist, sichtbar gemacht. Die Lumineszenz wird durch Belichtung mit einem Röntgenfilm erfasst (Abbildung 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Schritte des Ablaufs für den PCR-Dot-Blot-Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

Der Dot-Blot ist eine einfache, schnelle, empfindliche und vielseitige Technik, die die Identifizierung minimaler DNA-Mengen ermöglicht, die spezifisch durch Sondenhybridisierung in Gegenwart von Träger-DNA anvisiert werden. Es basiert auf der Übertragung einer bekannten Menge an DNA auf einen inerten festen Träger, wie z. B. eine Nylonmembran, unter Verwendung der Dot-Blot-Apparatur und ohne elektrophoretische Trennung. Nylonmembranen haben den Vorteil einer hohen Nukleinsäurebindungskapazität (400 μg/cm2), einer hohen Festigkeit und sind positiv oder neutral geladen. Bei der verwendeten Sonde handelt es sich um ein hochspezifisches ssDNA-Fragment von 18 bis 20 Basen mit einer Länge, das mit Digoxigenin (DIG) markiert ist. Die Sonde wird mit der Leptospira-DNA konjugieren. Sobald die Sonde mit der Ziel-DNA hybridisiert ist, wird sie von einem Anti-Digoxigenin-Antikörper detektiert, was einen einfachen Nachweis durch ihre Emissionen ermöglicht, die in einem Röntgenfilm sichtbar sind. Die Punkte mit einer Emission entsprechen den interessierenden DNA-Fragmenten. Bei dieser Methode wird die nicht-isotopische Markierung der Sonde verwendet, die eine sehr lange Halbwertszeit haben kann. Der Nachteil dieser Standard-Immunmarkierung ist eine geringere Empfindlichkeit als Isotopensonden. Dennoch wird sie durch die Kopplung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Dot-Blot-Assays gemildert. Dieser Ansatz ermöglicht die Anreicherung der Zielsequenz und deren Detektion. Darüber hinaus kann es als quantitative Anwendung im Vergleich zu einer seriellen Verdünnung eines bekannten Standards verwendet werden. Eine Dot-Blot-Anwendung zum Nachweis von Leptospira aus den drei Hauptkladen in Wasserproben wird hier vorgestellt. Diese Methode kann auf große Wassermengen angewendet werden, sobald sie durch Zentrifugation konzentriert wurden, um den Nachweis des Vorhandenseins von leptospiraler DNA zu erbringen. Dies ist ein wertvolles und zufriedenstellendes Instrument für allgemeine Screening-Zwecke und kann für andere nicht kultivierbare Bakterien verwendet werden, die im Wasser vorhanden sein können, um das Verständnis des Ökosystems zu verbessern.

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor im Rampenlicht: Leptospira-DNA-Nachweis in Wasser für die Umweltanalytik und Krankheitsüberwachung

Polymerase-Kettenreaktion und Dot-Blot-Hybridisierung zum Nachweis von Leptospiren in Wasserproben

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

Um die Wirksamkeit der Technik zu bewerten, wurde genomische DNA aus Reinkulturen jedes Leptospira-Serovars zusammen mit der kladespezifischen Sonde verwendet. Die Membranen wurden mit 100 ng genomischer DNA pro PCR-Reaktion für jedes Serovar hergestellt, gefolgt von acht genomischen DNA-Partikeln von nicht verwandten Bakterien und variablen Konzentrationen genomischer DNA der Ad-hoc-Leptospira-Serovare. Jeder Assay umfasste Positiv-, Negativ- und Nicht-Template-Kontrollen. Diese nicht verwandte genomi...

In dieser Studie wurde eine Dot-Blot-Anwendung entwickelt, um Leptospira aus den drei Hauptkladen in Wasserproben nachzuweisen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung minimaler DNA-Mengen, die spezifisch auf eine Digoxigenin-markierte Sonde abzielen und von einem Anti-Digoxigenin-Antikörper leicht nachgewiesen werden können. Dieser Ansatz ist ein wertvolles und zufriedenstellendes Instrument für Screening-Zwecke.

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Dieses Protokoll dient dazu, das Vorhandensein von Leptospira-DNA in Wasserproben zu identifizieren. Zu diesem Zweck wird die Dot-Blot-Technik verwendet, die einen genauen Nachweis und eine genaue Analyse der DNA ermöglicht. Der Dot-Blot ist eine einfache und vielseitige nicht-isotopische Technik und kann helfen, wichtige Fragen zur Verteilung von Leptospiren in der Umwelt zu beantworten.Diese Methode hat das Potenzial, riesige Gewässer zu bewerten und die Krankheitsüberwachung zu unterstützen.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.