Name: מחבר זרקור: זיהוי DNA של לפטוספירה במים לניתוח סביבתי ומעקב אחר מחלות
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

אנו אסירי תודה לאוסף לפטוספירה של המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, הפקולטה לרפואה וטרינרית וזואוטכניקה, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו. אנו אסירי תודה על תרומתם הנדיבה של זני הייחוס לפטוספירה (Leptospira ); Leptospira fainei serovar זן Hurstbridge BUT6 וזן Leptospira biflexa serovar Patoc Patoc I לד"ר Alejandro de la Peña Moctezuma. אנו מודים לד"ר חוסה אנטוניו אוקמפו סרוונטס, מתאם CIBAC, ולצוות על תמיכתם הלוגיסטית. EDT היה תחת תוכנית פרויקט מסוף לסטודנטים לתואר ראשון של האוניברסיטה האוטונומית מטרופוליטן קמפוס Cuajimalpa. אנו מכירים בתוכנת Biorender.com ליצירת איורים 1, 3 עד 9.

1. הכנת מדגם
<ol><li>רכז כל דגימת מים בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל באמצעות צנטריפוגה ב 8,000 x גרם למשך 10 דקות ב -4 ° C. חזור על שלב זה, כמה פעמים שנדרש, כדי לרכז את הדגימה לנפח של 250 μL.</li>
	<li>השתמש בערכת מיצוי ה- DNA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>בצע את ה- PCR הספצ?...

בדיקת Dot-Blot לזיהוי DNA של לפטוספירה בדגימות מים

השלבים הקריטיים של טכניקת כתם הנקודה כוללים (1) אימוביליזציה של דנ"א, (2) חסימת אתרי הקישור החופשיים על הממברנה עם דנ"א לא הומולוגי, (3) השלמה בין הגשושית לבין מקטע המטרה בתנאי חישול, (4) הסרת הגשושית הבלתי היברידית, ו-(5) גילוי מולקולת הכתב41.
לכתם PCR-Dot-blot יש מגבלות מסוי?...

לפטוספירוזיס בבני אדם מקורו בעיקר במקורות סביבתיים 1,2. נוכחותה של לפטוספירה באגמים, נהרות ונחלים היא אינדיקטור להעברת לפטוספירוזיס בקרב חיות בר, וחיות בית וייצור שעלולות בסופו של דבר לבוא במגע עם גופי מים אלה 1,3,4. יתר על כן, לפטוספירה זוהתה במקורות לא טבעיים, כולל ביוב, עומדים ומי ברז 5,6.
לפטוספירה הוא חיידקמופץ ברחבי העולם 7,8, ותפקיד הסביבה בשימורו ובהעברתו מוכר היטב. לפטוספירה יכולה לשרוד במי שתייה תחת pH משתנה ומינרלים9, ובמקווי מים טבעיים1. הוא יכול לשרוד גם תקופות ארוכות במים מזוקקים10, ותחת pH קבוע (7.8), הוא עשוי לשרוד עד 152 ימים11. יתר על כן, לפטוספירה עשויה לקיים אינטראקציה בקונסורציום חיידקים כדי לשרוד בתנאים קשים12,13. זה עשוי להיות חלק biofilms במים מתוקים עם Azospirillum ו Sphingomonas והוא אפילו מסוגל לגדול ולסבול טמפרטורות מעל 49 °C (75 °F)14,15. הוא יכול גם להתרבות בקרקע ספוגה במים ולהישאר בר קיימא עד 379 ימים16, תוך שמירה על יכולתו לגרום למחלה למשך שנה17,18. עם זאת, מעט ידוע על האקולוגיה בתוך גופי מים וכיצד היא מופצת בתוכם.
מאז גילויו, המחקר של הסוג Leptospira התבסס על בדיקות סרולוגיות. זה לא היה עד המאה הנוכחית כי טכניקות מולקולריות הפך נפוץ יותר במחקר של spirochaete זה. כתם הנקודה כמעט ולא שימש לזיהויו באמצעות (1) בדיקה איזוטופית המבוססת על rRNA 16S ועל רצף בין-פשוט חוזר (ISSR)19,20, (2) כבדיקה חיסונית מבוססת ננו-זהב עבור לפטוספירוזיס אנושי המיושמת על שתן21, או (3) כבדיקה מבוססת נוגדנים לדגימות שתן של בקר22. הטכניקה יצאה מכלל שימוש מכיוון שהתבססה במקור על בדיקות איזוטופיות. עם זאת, זוהי טכניקה ידועה, יחד עם PCR, מניב תוצאות משופרות, וזה נחשב בטוח בשל השימוש של בדיקות לא איזוטופיות. PCR ממלא תפקיד מכריע בהעשרת ה- DNA של לפטוספירה על ידי הגברת מקטע DNA ספציפי שעשוי להימצא בכמויות זעירות בדגימה. במהלך כל מחזור PCR, כמות מקטע הדנ"א הממוקד מוכפלת בתגובה. בסוף התגובה, האמפליקון הוכפל פי יותר ממיליון23. המוצר המוגבר על ידי PCR, לעתים קרובות לא נראה באלקטרופורזה אגרוז, הופך גלוי באמצעות הכלאה ספציפית עם בדיקה מסומנת DIG בכתם נקודה 24,25,26.
טכניקת כתם הנקודה פשוטה, חזקה ומתאימה לדגימות רבות, מה שהופך אותה לנגישה למעבדות עם משאבים מוגבלים. הוא שימש במגוון מחקרי חיידקים, כולל (1) חיידקים אוראליים27, (2) סוגי דגימות אחרים כגון מזון וצואה28, ו-(3) זיהוי חיידקים בלתי ניתנים לגידול29, לעתים קרובות בהסכמה עם טכניקות מולקולריות אחרות. בין היתרונות המוצעים על ידי טכניקת dot-blot הם: (1) לממברנה יכולת קשירה גבוהה, המסוגלת לקשור מעל 200 מיקרוגרם / ס"מ2 של חומצות גרעין ועד 400 מיקרוגרם / ס"מ2; (2) תוצאות כתם נקודה ניתנות לפירוש חזותי ללא צורך בציוד מיוחד, ו-(3) ניתן לאחסן אותן בנוחות במשך שנים בטמפרטורת החדר (RT).
הסוג Leptospira סווג לקלאדים פתוגניים, בינוניים וספרופיטיים30,31. ההבחנה בין קלאדים אלה יכולה להיות מושגת על בסיס גנים ספציפיים כגון lipL41, lipL32, ואת 16S rRNA. LipL32 קיים בקלאדיות הפתוגניות ומפגין רגישות גבוהה בכלים סרולוגיים ומולקולריים שונים, בעוד שהוא נעדר במיני ספרופיטים21. הגן lipL41 ידוע בביטוי היציב שלו ומשמש בטכניקות מולקולריות32, בעוד הגן 16S rRNA מנוצל לסיווגם.
מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כמויות גדולות של מים לאחר שהם רוכזו על ידי צנטריפוגה. הוא מאפשר להעריך נקודות ועומקים שונים בתוך גוף המים כדי לזהות את נוכחותו של DNA לפטוספירלי ואת הקלאדה שאליה הוא שייך. כלי זה הוא בעל ערך הן למטרות אקולוגיות והן למטרות סינון כלליות וניתן להשתמש בו גם כדי לזהות חיידקים אחרים שאינם ניתנים להתרבות שעשויים להימצא במים.
בנוסף, בדיקות PCR ו-dot-blot משתלמות מבחינה טכנית וכלכלית למגוון רחב של מעבדות, גם כאלה שאין להן ציוד מתוחכם או יקר. מחקר זה נועד ליישם את כתם הנקודות המבוסס על דיגוקסיגנין לזיהוי שלושת קלאדי הלפטוספירה בדגימות מים שנאספו מגופי מים טבעיים.
זני חיידקים במחקר זה נכללו שנים עשר סרוברים של לפטוספירה (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi ו-Wolffi). סרוברים אלה הם חלק מהאוסף במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, הפקולטה לרפואה וטרינרית וזואוטכניקה, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו, והם משמשים כיום במבחן microagglutination (MAT).
כל הסרוברים של לפטוספירה גודלו בתרבית EMJH, והדנ"א שלהם הופק באמצעות ערכת מיצוי DNA מסחרית (ראו טבלת חומרים). תערובת DNA גנומית של שנים-עשר הסרוברים שימשה כבקרה חיובית עבור הקלאדה הפתוגנית של לפטוספירה (Leptospira ). כבקרה חיובית של Leptospira intermediate clade, נכלל DNA גנומי מזן Leptospira fainei serovar Hurstbridge BUT6, וכבקרה חיובית עבור Leptospira saprophyte clade, נכלל גם DNA גנומי של זן Leptospira biflexa serovar Patoc Patoc I.
הבקרות השליליות כללו פלסמיד ריק, DNA מחיידקים שאינם קשורים זה לזה (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii ו-Escherichia coli), ומים בדרגת PCR, ששימשו כבקרה שאינה תבנית.
דגימות מים שתים עשרה דגימות ניסוי נאספו בשיטת דגימה מרובדת-אקראית ממרכז המחקר הביולוגי והחקלאות הימית Cuemanco (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). הדגימות האלה התקבלו בשלושה עומקים: שטחי, 10 ו-30 ס"מ (איור 1A, B). נהלי איסוף המים לא השפיעו על אף מין בסכנת הכחדה או מוגן. כל דגימה נאספה בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל. כדי לאסוף את הדגימה, כל צינור היה שקוע בעדינות במים, מלא בעומק שנבחר, ולאחר מכן נאטם. הדגימות נשמרו בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס והועברו מייד למעבדה לעיבוד.
כל דגימה רוכזה על ידי צנטריפוגה בצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים של 1.5 מ"ל ב 8000 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. השלב הזה חזר על עצמו עד שכל הדגימות רוכזו בצינור אחד, ששימש לאחר מכן למיצוי דנ"א (איור 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> איור 1: ריכוז דגימות מים באמצעות צנטריפוגה. (A) בריכות דיגום מים, ו-(B) נחלים טבעיים. (C) עיבוד דגימות מים מבוססות צנטריפוגה בשלבים חוזרים ונשנים כמה פעמים לפי הצורך (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מיצוי DNA סה"כ DNA בודד באמצעות ערכת DNA גנומית מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). מיצויי DNA נמהלו ב-20 μL של חיץ אלוציה, וריכוז הדנ"א נקבע על ידי ספקטרופוטומטר UV ב-260-280 ננומטר, ואוחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
הגברה PCR מטרות ה-PCR היו הגנים 16S rRNA, lipL41 ו-lipL32, המזהים DNA מהסוג Leptospira ומאפשרים הבחנה בין שלושת הקלאדים: פתוגני, ספרופיטי וביניים. הן הפריימרים והן עיצובי הגשושית התבססו על עבודותיהם הקודמות של אחמד ואחרים, אזאלי ואחרים, בורהי ואחרים, וייס ואחרים וברנגר ואחרים 33,34,35,36,37. הרצף של כל בדיקה, פריימר ומקטע מוגבר מתוארים בטבלה 1, ויישורם עם רצפי הייחוס מופיע בקובץ משלים 1, קובץ משלים 2, קובץ משלים 3, קובץ משלים 4 וקובץ משלים 5. ריאגנטים PCR ותנאי thermocycling מתוארים בסעיף פרוטוקול.
מוצרי הגברה הודגמו על-ידי הפרדה אלקטרופורטית על ג'ל אגרוז 1% ב-TAE (בסיס טריס של 40 מילימטר, חומצה אצטית של 20 מילימטר ו-1 מילימטר EDTA; pH 8.3), במתח של 60 וולט למשך 45 דקות עם זיהוי אתידיום-ברומיד, כפי שמוצג באיור משלים 1. דנ"א גנומי שהתקבל מכל סרובר שימש בריכוזים הנעים בין 6 x 106 ל 1 x 104 עותקים גנומיים שווי ערך (GEq) בכל תגובת PCR, בהתבסס על גודל הגנום של L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 עבור לפטוספירה פתוגנית, גודל הגנום של L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 עבור לפטוספירה ספרופיטית, וגודל הגנום של זן L. fainei serovar Hurstbridge BUT6 (4, 267, 324 bp) עם מספר הצטרפות AKWZ00000000.2.
רגישות הגשושיות הוערכה באמצעות DNA מכל סרובר פתוגני, זן L. biflexa serovar Patoc Patoc I וזן L. fainei serovar Hurstbridge BUT6 בכל ניסוי. כדי להעריך את הספציפיות של בדיקת PCR והכלאת כתם נקודה, נכלל DNA מחיידקים שאינם קשורים.
טבלה 1: פריימרים ובדיקות PCR להגברת מוצרים לזיהוי קלאדים פתוגניים, ספרופיטים ובינוניים של לפטוספירה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
בדיקת הכלאה של כתם נקודה הטכניקה נקראת dot-blot מכיוון שלחורים שבהם דגימת הדנ"א ממוקמת יש צורת נקודה, וכאשר הם נשאבים כדי להתקבע במקומם על ידי שאיבת ואקום, הם מקבלים צורה זו. טכניקה זו פותחה על ידי Kafatos et al.40. הטכניקה מאפשרת כימות למחצה של לפטוספירה בכל דגימה חיובית ל-PCR. הפרוטוקול מורכב מדנטורציה עם NaOH 0.4 M בטמפרטורת החדר, דגימות עם DNA של לפטוספירה מ 30 ng עד 0.05 ng, המתאים 6 x 106 ל 1 x 104 leptospires, מוכתמים על קרום ניילון עם מנגנון 96 באר נקודה כתם. לאחר אימוביליזציה, הדנ"א נקשר לממברנה על ידי חשיפה לאור UV של 120 mJ. כל בדיקת DNA מצומדת עם digoxigenin-11 dUTP על ידי שלב קטליזה transferase מסוף בקצה 3' (Digoxigenin הוא סטרואיד צמחי המתקבל מ Digitalis purpurea, המשמש ככתב41). לאחר ההכלאה המחמירה של בדיקת הדנ"א המסומנת (50 pmol) בטמפרטורה הספציפית על גבי דנ"א המטרה, הכלאות הדנ"א מודגמות על ידי תגובת הכימילומינסנציה עם נוגדן האנטי-דיגוקסיגנין אלקליין פוספטאז מצומד באופן קוולנטי עם המצע CSPD שלו. ההארה נלכדת על-ידי חשיפה לסרט רנטגן (איור 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> איור 2: שלבי ההליך עבור בדיקת PCR-dot-blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

כתם הנקודות הוא טכניקה פשוטה, מהירה, רגישה ורב-תכליתית המאפשרת זיהוי כמויות מינימליות של DNA הממוקדות ספציפית על ידי הכלאת בדיקה בנוכחות DNA נשא. הוא מבוסס על העברת כמות ידועה של DNA לתמיכה מוצקה אינרטית, כגון קרום ניילון, תוך שימוש במנגנון כתם הנקודה וללא הפרדה אלקטרופורטית. לקרומי ניילון יש יתרון של יכולת קשירה גבוהה של חומצות גרעין (400 מיקרוגרם לסמ"ק2), חוזק גבוה, והם טעונים חיובית או ניטרלית. הגשושית המשמשת היא מקטע ssDNA ספציפי ביותר של 18 עד 20 בסיסים ארוכים המסומנים בדיגוקסיגנין (DIG). הגשושית תצומד לדנ"א של לפטוספירה (Leptospira ). לאחר שהגשושית ביצעה הכלאה עם דנ"א המטרה, היא מזוהה על ידי נוגדן אנטי-דיגוקסיגנין, המאפשר את זיהויו בקלות באמצעות פליטותיו המתגלות בסרט רנטגן. הנקודות עם הפליטה יתאימו למקטעי הדנ"א המעניינים. שיטה זו משתמשת בתיוג לא איזוטופי של הבדיקה, אשר עשוי להיות זמן מחצית חיים ארוך מאוד. החיסרון של תווית חיסונית סטנדרטית זו הוא רגישות נמוכה יותר מאשר בדיקות איזוטופיות. עם זאת, היא מתמתנת על ידי צימוד תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ומבחני כתם נקודה. גישה זו מאפשרת העשרת רצף המטרה ואיתורו. בנוסף, ניתן להשתמש בו כיישום כמותי בהשוואה לדילול סדרתי של תקן ידוע. יישום נקודתי לזיהוי לפטוספירה משלושת הקלאדים העיקריים בדגימות מים מוצג כאן. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כמויות גדולות של מים לאחר שהם רוכזו על ידי צנטריפוגה כדי לספק ראיות לנוכחות של DNA לפטוספירלי. זהו כלי בעל ערך ומספק למטרות סינון כלליות, וניתן להשתמש בו עבור חיידקים אחרים שאינם ניתנים לגידול שעשויים להימצא במים, ובכך לשפר את הבנת המערכת האקולוגית.

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

מחבר זרקור: זיהוי DNA של לפטוספירה במים לניתוח סביבתי ומעקב אחר מחלות

תגובת שרשרת פולימראז והכלאה של כתם נקודה לזיהוי לפטוספירה בדגימות מים

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

כדי להעריך את יעילות הטכניקה, נעשה שימוש בדנ"א גנומי מתרביות טהורות של כל לסרובר לפטוספירה (Leptospira serovar), יחד עם הגשושית הספציפית לקלייד. הממברנות הוכנו עם 100 ננוגרם של DNA גנומי לכל תגובת PCR עבור כל סרובר, ולאחר מכן שמונה דנ"א גנומי של חיידקים שאינם קשורים וריכוזים משתנים של DNA גנומי של סרו?...

במחקר זה, יישום כתם נקודה תוכנן לזהות לפטוספירה משלושת הקלאדים העיקריים בדגימות מים. שיטה זו מאפשרת זיהוי של כמויות DNA מינימליות הממוקדות באופן ספציפי על ידי בדיקה המסומנת בדיגוקסיגנין, המזוהה בקלות על ידי נוגדן אנטי דיגוקסיגנין. גישה זו היא כלי רב ערך ומספק למטרות מיון.

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

פרוטוקול זה נועד לזהות נוכחות של DNA לפטוספירה בדגימות מים. טכניקת כתם הנקודה משמשת למטרה זו, המאפשרת זיהוי וניתוח מדויק של הדנ"א. כתם הנקודות הוא טכניקה קלה ורב-תכליתית שאינה איזוטופית ועשוי לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ההתפלגות הסביבתית של לפטוספירה.לשיטה זו יש פוטנציאל להעריך גופי מים ענקיים ולסייע במעקב אחר מחלות.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.