Name: Autore in primo piano: Rilevamento del DNA di Leptospira nell'acqua per l'analisi ambientale e la sorveglianza delle malattie
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Siamo in debito con la collezione Leptospira del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Facoltà di Medicina Veterinaria e Zootecnica, Università Nazionale Autonoma del Messico. Siamo grati per la generosa donazione dei ceppi di riferimento Leptospira ; Leptospira fainei sierotipo Hurstbridge ceppo BUT6 e Leptospira biflexa sierovariante Patoc ceppo Patoc I al Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Ringraziamo il Dott. José Antonio Ocampo Cervantes, Coordinatore del CIBAC, e il personale per il loro supporto logistico. EDT faceva parte del programma Terminal Project per studenti universitari della Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. Ringraziamo il software Biorender.com per la creazione delle figure 1 e da 3 a 9.

1. Preparazione del campione
<ol><li>Concentrare ogni campione d'acqua in provette da microcentrifuga da 1,5 mL mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Ripetere questo passaggio, tutte le volte che è necessario, per concentrare il campione in un volume di 250 μl.</li>
	<li>Utilizzare il kit di estrazione del DNA secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Eseguire la PCR specifica in base alla sonda dot-blot che verr...

Saggio dot-blot per il rilevamento del DNA di Leptospira in campioni d'acqua

Le fasi critiche della tecnica dot-blot includono (1) immobilizzazione del DNA, (2) blocco dei siti di legame liberi sulla membrana con DNA non omologo, (3) la complementarità tra la sonda e il frammento bersaglio in condizioni di ricottura, (4) rimozione della sonda non ibridata e (5) il rilevamento della molecola reporter41.
La PCR-Dot-blot presenta alcune limitazioni, come la tecnica che non fornisce informazioni sulle dimensioni del frammento37</s...

La leptospirosi nell'uomo ha origine principalmente da fonti ambientali 1,2. La presenza di Leptospira in laghi, fiumi e torrenti è un indicatore della trasmissione della leptospirosi tra la fauna selvatica e gli animali domestici e da produzione che possono eventualmente entrare in contatto con questi corpi idrici 1,3,4. Inoltre, Leptospira è stata identificata in fonti non naturali, tra cui acque reflue, stagnanti e di rubinetto 5,6.
Leptospira è un batterio distribuito in tutto il mondo 7,8 e il ruolo dell'ambiente nella sua conservazione e trasmissione è stato ben riconosciuto. La Leptospira può sopravvivere nell'acqua potabile a pH e minerali variabili9 e nei corpi idrici naturali1. Può anche sopravvivere per lunghi periodi in acqua distillata10 e, a pH costante (7,8), può sopravvivere fino a 152 giorni11. Inoltre, Leptospira può interagire in consorzi batterici per sopravvivere a condizioni difficili12,13. Può far parte di biofilm in acqua dolce con Azospirillum e Sphingomonas ed è anche in grado di crescere e sopportare temperature superiori a 49 °C14,15. Può anche moltiplicarsi in terreni impregnati d'acqua e rimanere vitale fino a 379 giorni16, preservando la sua capacità di causare la malattia fino a un anno17,18. Tuttavia, si sa poco sull'ecologia all'interno dei corpi idrici e su come è distribuita al loro interno.
Fin dalla sua scoperta, lo studio del genere Leptospira si è basato su test sierologici. Non è stato fino al secolo in corso che le tecniche molecolari sono diventate più diffuse nello studio di questa spirocheta. Il dot-blot è stato scarsamente utilizzato per la sua identificazione utilizzando (1) una sonda isotopica basata sull'rRNA 16S e su una ripetizione di sequenza intersemplice (ISSR)19,20, (2) come test immunologico basato su nanogold per la leptospirosi umana applicata all'urina21, o (3) come test basato su anticorpi per campioni di urina bovina22. La tecnica cadde in disuso perché originariamente si basava su sonde isotopiche. Tuttavia, è una tecnica ben nota che, abbinata alla PCR, produce risultati migliori ed è considerata sicura grazie all'uso di sonde non isotopiche. La PCR svolge un ruolo cruciale nell'arricchimento del DNA di Leptospira amplificando uno specifico frammento di DNA che può essere trovato in tracce in un campione. Durante ogni ciclo di PCR, la quantità del frammento di DNA bersaglio viene raddoppiata nella reazione. Alla fine della reazione, l'amplicone è stato moltiplicato per un fattore di oltre un milione23. Il prodotto amplificato mediante PCR, spesso non visibile nell'elettroforesi dell'agarosio, diventa visibile attraverso un'ibridazione specifica con una sonda marcata con DIG nel dot-blot 24,25,26.
La tecnica del dot-blot è semplice, robusta e adatta a numerosi campioni, rendendola accessibile ai laboratori con risorse limitate. È stato impiegato in una varietà di studi sui batteri, tra cui (1) batteri orali27, (2) altri tipi di campioni come cibo e feci28 e (3) l'identificazione di batteri non coltivabili29, spesso in accordo con altre tecniche molecolari. Tra i vantaggi offerti dalla tecnica del dot-blot ci sono: (1) La membrana ha un'elevata capacità legante, in grado di legare oltre 200 μg/cm2 di acidi nucleici e fino a 400 μg/cm2; (2) I risultati del dot-blot possono essere interpretati visivamente senza richiedere attrezzature speciali e (3) possono essere comodamente conservati per anni a temperatura ambiente (RT).
Il genere Leptospira è stato classificato in cladi patogeni, intermedi e saprofiti30,31. La distinzione tra questi cladi può essere ottenuta in base a geni specifici come lipL41, lipL32 e l'rRNA 16S. LipL32 è presente nei cladi patogeni e mostra un'elevata sensibilità in vari strumenti sierologici e molecolari, mentre è assente nelle specie di saprofiti21. Il gene housekeeping lipL41 è noto per la sua espressione stabile e utilizzato nelle tecniche molecolari32, mentre il gene 16S rRNA è utilizzato per la loro classificazione.
Questa metodologia può essere applicata a grandi volumi d'acqua una volta che sono stati concentrati per centrifugazione. Consente la valutazione di vari punti e profondità all'interno di un corpo idrico per rilevare la presenza di DNA leptospirale e del clade a cui appartiene. Questo strumento è prezioso sia per scopi ecologici che di screening generale e può essere utilizzato anche per rilevare altri batteri non coltivabili che possono essere presenti nell'acqua.
Inoltre, i test PCR e dot-blot sono tecnicamente ed economicamente accessibili a un'ampia gamma di laboratori, anche a quelli privi di attrezzature sofisticate o costose. Questo studio mira ad applicare il dot-blot a base di digoxigenina per l'identificazione dei tre cladi di Leptospira in campioni d'acqua raccolti da corpi idrici naturali.
Ceppi batterici In questo studio sono stati inclusi dodici sierotipi di Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi e Wolffi). Questi sierotipi fanno parte della collezione del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Facoltà di Medicina Veterinaria e Zootecnica, Università Nazionale Autonoma del Messico, e sono attualmente utilizzati nel test di microagglutinazione (MAT).
Tutti i sierotipi di Leptospira sono stati coltivati in EMJH e il loro DNA è stato estratto utilizzando un kit commerciale per l'estrazione del DNA (vedi Tabella dei materiali). Una miscela di DNA genomico dei dodici sierotipi è stata utilizzata come controllo positivo per il clade patogeno Leptospira . Come controllo positivo del clade intermedio di Leptospira , è stato incluso il DNA genomico del ceppo BUT6 del sierotipo Hurstbridge di Leptospira fainei e, come controllo positivo per il clade saprofita di Leptospira , è stato incluso anche il DNA genomico del ceppo Patoc Patoc I.
I controlli negativi consistevano in un plasmide vuoto, DNA di batteri non imparentati (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii ed Escherichia coli) e acqua di grado PCR, che fungeva da controllo non stampo.
Campioni d'acqua Dodici campioni di prova sono stati raccolti utilizzando un metodo di campionamento stratificato e casuale dal Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Questi campioni sono stati ottenuti a tre profondità: superficiale, 10 e 30 cm (Figura 1A, B). Le procedure di raccolta dell'acqua non hanno avuto alcun impatto su alcuna specie in via di estinzione o protetta. Ogni campione è stato raccolto in una provetta sterile da microcentrifuga da 15 ml. Per raccogliere il campione, ogni tubo è stato delicatamente immerso nell'acqua, riempito alla profondità selezionata e quindi sigillato. I campioni sono stati mantenuti a 22 °C e prontamente trasportati in laboratorio per l'elaborazione.
Ogni campione è stato concentrato mediante centrifugazione in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 mL a 8000 x g per 20 minuti a temperatura ambiente. Questo passaggio è stato ripetuto fino a quando tutti i campioni sono stati concentrati in una provetta, che è stata poi utilizzata per l'estrazione del DNA (Figura 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> Figura 1: Concentrazione di campioni d'acqua per centrifugazione. (A) Stagni di campionamento dell'acqua e (B) Corsi d'acqua naturali. (C) Trattamento del campione d'acqua basato sulla centrifugazione in fasi ripetute tutte le volte necessarie (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Estrazione del DNA Il DNA totale è stato isolato utilizzando un kit di DNA genomico commerciale secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali). Le estrazioni di DNA sono state eluite in 20 μL di tampone di eluizione e la concentrazione di DNA è stata determinata da uno spettrofotometro UV a 260-280 nm e conservata a 4 °C fino all'uso.
Amplificazione PCR I bersagli della PCR erano i geni 16S rRNA, lipL41 e lipL32, che identificano il DNA del genere Leptospira e consentono la distinzione tra i tre cladi: patogeno, saprofita e intermedio. Sia i primer che i progetti delle sonde si basavano sui precedenti lavori di Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. e Branger et al.33,34,35,36,37. La sequenza di ciascuna sonda, primer e frammento amplificato è descritta nella Tabella 1 e il loro allineamento con le sequenze di riferimento è fornito nel File supplementare 1, nel File supplementare 2, nel File supplementare 3, nel File supplementare 4 e nel File supplementare 5. I reagenti PCR e le condizioni di termociclo sono descritti nella sezione del protocollo.
I prodotti di amplificazione sono stati visualizzati mediante separazione elettroforetica su un gel di agarosio all'1% in TAE (40 mM di base Tris, 20 mM di acido acetico e 1 mM di EDTA; pH 8,3), a 60 V per 45 minuti con rilevamento di etidio-bromuro, come mostrato nella Figura 1 supplementare. Il DNA genomico ottenuto da ciascun sierotipo è stato utilizzato con concentrazioni comprese tra 6 x 106 e 1 x 104 copie genomiche equivalenti (GEq) in ciascuna reazione di PCR, in base alla dimensione del genoma di L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 per la Leptospira patogena, la dimensione del genoma di L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 per la Leptospira saprofita, e la dimensione del genoma del sierotipo di L. fainei ceppo di Hurstbridge BUT6 (4, 267, 324 bp) con numero di adesione AKWZ00000000.2.
La sensibilità delle sonde è stata valutata con il DNA di ciascun sierotipo patogeno, L. biflexa sierotipo Patoc ceppo Patoc I e L. fainei sierotipo Hurstbridge ceppo BUT6 in ogni esperimento. Per valutare la specificità del test di ibridazione PCR e dot-blot, è stato incluso il DNA di batteri non correlati.
Tabella 1: Primer e sonde PCR per amplificare i prodotti per l'identificazione dei cladi patogeni, saprofiti e intermedi di Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Saggio di ibridazione dot-blot La tecnica è chiamata dot-blot perché i fori in cui viene posizionato il campione di DNA hanno una forma a punti, e quando vengono aspirati per essere fissati in posizione mediante aspirazione sottovuoto, acquisiscono questa forma. Questa tecnica è stata sviluppata da Kafatos et al.40. La tecnica consente la semi-quantificazione di Leptospira in ogni campione positivo alla PCR. Il protocollo consiste in una denaturazione con NaOH 0,4 M a temperatura ambiente, campioni con DNA di Leptospira da 30 ng a 0,05 ng, corrispondenti a 6 x 106 a 1 x 104 leptospiri, vengono tamponati su una membrana di nylon con un apparato dot-blot a 96 pozzetti. Dopo l'immobilizzazione, il DNA viene legato alla membrana mediante esposizione a 120 mJ di luce UV. Ogni sonda di DNA è coniugata con digoxigenina-11 dUTP mediante una fase di catalisi della transferasi terminale all'estremità 3' (la digoxigenina è uno steroide vegetale ottenuto dalla Digitalis purpurea, usato come reporter41). A seguito della rigorosa ibridazione della sonda di DNA marcata (50 pmol) alla temperatura specifica sul DNA bersaglio, gli ibridi di DNA vengono visualizzati mediante la reazione di chemiluminescenza con l'anticorpo anti-digoxigenina fosfatasi alcalina coniugato in modo covalente con il suo substrato CSPD. La luminescenza viene catturata dall'esposizione a una pellicola radiografica (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> Figura 2: Fasi della procedura per il test PCR-dot-blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

Il dot-blot è una tecnica semplice, veloce, sensibile e versatile che consente l'identificazione di quantità minime di DNA specificamente bersaglio dell'ibridazione della sonda in presenza di DNA vettore. Si basa sul trasferimento di una quantità nota di DNA su un supporto solido inerte, come una membrana di nylon, utilizzando l'apparato dot-blot e senza separazione elettroforetica. Le membrane in nylon hanno il vantaggio di un'elevata capacità di legame dell'acido nucleico (400 μg/cm2), un'elevata resistenza e sono caricate positivamente o neutramente. La sonda utilizzata è un frammento di ssDNA altamente specifico di 18-20 basi lunghe marcate con digossigenina (DIG). La sonda si coniugherà con il DNA di Leptospira . Una volta che la sonda si è ibridata con il DNA bersaglio, viene rilevata da un anticorpo anti-digossigenina, consentendone una facile rilevazione attraverso le sue emissioni rivelate in una pellicola radiografica. I punti con un'emissione corrisponderanno ai frammenti di DNA di interesse. Questo metodo impiega la marcatura non isotopica della sonda, che può avere un'emivita molto lunga. Lo svantaggio di questa immuno-marcatura standard è una sensibilità inferiore rispetto alle sonde isotopiche. Tuttavia, è mitigato dall'accoppiamento della reazione a catena della polimerasi (PCR) e dai saggi dot-blot. Questo approccio consente l'arricchimento della sequenza di destinazione e il relativo rilevamento. Inoltre, può essere utilizzato come applicazione quantitativa se confrontato con una diluizione seriale di uno standard noto. Qui viene presentata un'applicazione dot-blot per rilevare Leptospira dai tre cladi principali nei campioni d'acqua. Questa metodologia può essere applicata a grandi quantità di acqua una volta che sono state concentrate mediante centrifugazione per fornire prove della presenza di DNA leptospirale. Questo è uno strumento prezioso e soddisfacente per scopi di screening generali e può essere utilizzato per altri batteri non coltivabili che possono essere presenti nell'acqua, migliorando la comprensione dell'ecosistema.

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autore in primo piano: Rilevamento del DNA di Leptospira nell'acqua per l'analisi ambientale e la sorveglianza delle malattie

Reazione a catena della polimerasi e ibridazione dot-blot per la rilevazione di leptospira in campioni d'acqua

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

Per valutare l'efficacia della tecnica, è stato utilizzato DNA genomico da colture pure di ciascun sierotipo di Leptospira , insieme alla sonda specifica per clade. Le membrane sono state preparate con 100 ng di DNA genomico per reazione PCR per ciascun sierotipo, seguito da otto DNA genomico di batteri non correlati e concentrazioni variabili di DNA genomico dei sierotipi Leptospira ad hoc . Ogni test includeva un controllo positivo, negativo e non modello. Questi DNA genomici non correlati non hanno ...

In questo studio, è stata progettata un'applicazione di dot-blot per rilevare Leptospira dai tre cladi principali nei campioni d'acqua. Questo metodo consente l'identificazione di quantità minime di DNA specificamente bersaglio di una sonda marcata con digossigenina, facilmente rilevabili da un anticorpo anti-digossigenina. Questo approccio è uno strumento prezioso e soddisfacente ai fini dello screening.

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Questo protocollo è progettato per identificare la presenza di DNA di Leptospira nei campioni d'acqua. A questo scopo viene utilizzata la tecnica del dot-blot, che consente un rilevamento e un'analisi accurati del DNA. Il dot-blot è una tecnica non isotopica facile e versatile e può aiutare a rispondere a domande chiave sulla distribuzione ambientale di Leptospira.Questo metodo ha il potenziale per valutare enormi corpi idrici e aiutare nella sorveglianza delle malattie.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.