Name: 著者スポットライト:環境分析と疾患監視のための水中の レプトスピラ DNA検出
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

メキシコ国立自治大学獣医学部微生物学・免疫学科のレプトスピラコレクションに恩義を感じています。参照レプトスピラ株の寛大な寄付に感謝します。Leptospira fainei serovar Hurstbridge株BUT6およびLeptospira biflexa serovar Patoc株Patoc IからAlejandro de la Peña Moctezuma博士へ。CIBACコーディネーターのホセ・アントニオ・オカンポ・セルバンテス博士と、後方支援をしてくれた職員に感謝します。EDTは、メトロポリタン自治大学キャンパスクアジマルパの学部生向けのターミナルプロジェクトプログラムの下にありました。図1、図3から図9の作成にソフトウェア Biorender.com を認めます。

1.サンプル調製
<ol><li>各水サンプルを1.5 mLの微量遠心チューブに濃縮し、8,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 このステップを必要な回数繰り返して、サンプルを250 μLの容量に濃縮します。</li>
	<li>製造元の指示に従ってDNA抽出キットを使用してください( 材料の表を参照)。</li>
	<li>使用するドットブロットプローブに従って特異的PCRを実施します(表1...

水サンプル中の レプトスピラ DNAを検出するためのドットブロットアッセイ

ドットブロット技術の重要なステップには、(1)DNA固定化、(2)非相同DNAによる膜上の自由結合部位のブロッキング、(3)アニーリング条件下でのプローブと標的フラグメントとの間の相補性、(4)非ハイブリダイズプローブの除去、および(5)レポーター分子の検出が含まれます41。
PCR−ドット−ブロットは、ある種の限界を有し、例えば、この技術は、ハイブ...

ヒトのレプトスピラ症は、主に環境源に由来します1,2。湖、川、小川でのレプトスピラの存在は、野生生物、および最終的にこれらの水域と接触する可能性のある家畜および生産動物の間でのレプトスピラ症の伝播の指標です1,3,4。さらに、レプトスピラは、下水、停滞水、水道水などの非天然水源で確認されています5,6。
レプトスピラは世界中に分布する細菌であり7,8、その保存と伝播における環境の役割はよく認識されています。レプトスピラは、さまざまなpHとミネラル9の飲料水、および天然の水域1で生存できます。また、蒸留水10中で長期間生存することができ、一定のpH(7.8)下では、最大152日間生存する可能性があります11。さらに、レプトスピラは、過酷な条件を生き残るために細菌コンソーシアムで相互作用する可能性があります12,13。アゾスピリルムやスフィンゴモナスを含む淡水中のバイオフィルムの一部である可能性があり、49°Cを超える温度に成長し、耐えることさえできます14,15。また、浸水した土壌で増殖し、最大379日間生存し続けることができ16、17,18年もの間病気を引き起こす能力を維持します。しかし、水域内の生態学と、それが水域内でどのように分布しているかについてはほとんど知られていません。
その発見以来、レプトスピラ属の研究は血清学的検査に基づいていました。分子技術がこのスピロヘータの研究でより普及したのは今世紀になってからでした。ドットブロットは、(1)16S rRNAおよび単純配列反復(ISSR)に基づく同位体プローブ19,20、(2)尿に適用されるヒトレプトスピラ症に対するナノゴールドベースの免疫測定法21、または(3)ウシ尿サンプル22に対する抗体ベースのアッセイとして、その同定にはほとんど使用されていません.この技術は、もともと同位体プローブに基づいていたため、使用されなくなりました。しかし、PCRと組み合わせることで、より高度な結果が得られることはよく知られた技術であり、非同位体プローブを使用しているため安全であると考えられています。PCRは、サンプル中に微量に見られる可能性のある特定のDNA断片を増幅することにより、レプトスピラDNAの濃縮に重要な役割を果たします。各PCRサイクル中に、標的DNA断片の量が反応で2倍になります。反応の終わりに、アンプリコンは100万倍以上になりました23。PCRによって増幅された生成物は、アガロース電気泳動では見えないことが多いが、ドットブロット24,25,26のDIG標識プローブとの特異的ハイブリダイゼーションによって見えるようになる。
ドットブロット法は、シンプルで堅牢で、多数のサンプルに適しているため、リソースが限られているラボでも利用することができます。これは、(1)口腔細菌27、(2)食物や糞便などの他のサンプルタイプ28、および(3)培養不可能な細菌の同定29を含むさまざまな細菌研究で採用されており、多くの場合、他の分子技術と一致しています。ドットブロット技術によって提供される利点の中には、(1)メンブレンは高い結合能力を持ち、200μg/ cm2 以上の核酸および最大400μg / cm2に結合することができる。(2)ドットブロットの結果は、特別な機器を必要とせずに視覚的に解釈でき、(3)室温(RT)で何年も保存することができます。
レプトスピラ属は、病原性、中間性、および腐生性のクレードに分類されています30,31。これらのクレード間の区別は、lipL41、lipL32、および16S rRNAなどの特定の遺伝子に基づいて達成できます。LipL32は病原性クレードに存在し、さまざまな血清学的および分子的ツールで高い感受性を示しますが、腐生植物種には存在しません21。ハウスキーピング遺伝子lipL41は、その安定した発現で知られており、分子技術32に使用され、16S rRNA遺伝子はそれらの分類に利用されています。
この方法は、遠心分離によって濃縮された大量の水に適用できます。これにより、水域内のさまざまなポイントと深さを評価して、レプトスパイラルDNAの存在とそれが属するクレードを検出できます。このツールは、生態学的および一般的なスクリーニング目的の両方に有用であり、水中に存在する可能性のある他の培養不可能な細菌を検出するためにも使用できます。
さらに、PCRおよびドットブロットアッセイは、高度な機器や高価な機器を持たないラボであっても、幅広いラボにとって技術的および経済的に手頃な価格です。この研究は、ジゴキシゲニンベースのドットブロットを、天然の水域から収集された水サンプル中の3つの レプトスピラ クレードの同定に適用することを目的としています。
細菌株 12の レプトスピラ 血清型動物(Autumnalis、Bataviae、Bratislava、Canicola、Celledoni、Grippothyphosa、Hardjoprajitno、Icterohaemorrhagiae、Pomona、Pyrogenes、Tarassovi、およびWolffi)がこの研究に含まれました。これらの血清型は、メキシコ国立自治大学獣医学部微生物学・免疫学科のコレクションの一部であり、現在、微小凝集試験(MAT)に使用されています。
すべての レプトスピラ 血清型動物はEMJHで培養され、それらのDNAは市販のDNA抽出キットを使用して抽出されました( 材料の表を参照)。12種類の血清型のゲノムDNA混合物を 、レプトスピラ 病原性クレードのポジティブコントロールとして使用した。 レプトスピラ 中間体クレードのポジティブコントロールとして、 Leptospira fainei serovar Hurstbridge株BUT6由来のゲノムDNAが含まれ、 レプトスピラ 腐生菌クレードのポジティブコントロールとして、 Leptospira biflexa serovar Patoc Patoc株Patoc IのゲノムDNAも含まれていた。
ネガティブコントロールは、空のプラスミド、非血縁細菌(Ureaplasma urealyticum、黄色ブドウ球菌、Brucella abortus、Salmonella typhimurium、赤痢菌、肺炎桿菌、Acinetobacter baumannii、 および 大腸菌 )のDNA、および非テンプレートコントロールとして機能するPCRグレードの水で構成されていました。
水のサンプル 12の試験グラブサンプルは、Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center(CIBAC)から層別でたらめなサンプリング法を使用して収集されました(19°16'54" N 99°6'11" W)。これらのサンプルは、表層、10、30 cmの3つの深さで採取されました(図1A、B)。水の収集手順は、絶滅危惧種や保護種に影響を与えませんでした。各サンプルは、滅菌済みの15 mL微量遠心チューブに収集しました。サンプルを採取するために、各チューブを水に静かに沈め、選択した深さで充填してから密封しました。サンプルは22°Cに維持され、処理のためにすぐに実験室に運ばれました。
各サンプルは、滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブに8000 x g で20分間遠心分離して濃縮しました。このステップは、すべてのサンプルが1本のチューブに濃縮されるまで繰り返され、DNA抽出に使用されました(図1C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> 図1:遠心分離による水サンプルの濃度(A)採水池、(B)自然の流れ。(C)遠心分離ベースの水サンプル処理を必要な回数だけ繰り返します(n)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
DNA抽出 全DNAは、製造元の指示に従って市販のゲノムDNAキットを使用して単離しました( 材料の表を参照)。DNA抽出物を20μLの溶出緩衝液中で溶出し、DNA濃度をUV分光光度計で260〜280nmで測定し、使用するまで4°Cで保存した。
PCR増幅 PCRターゲットは、16個のS rRNA、lipL41、およびlipL32遺伝子であり、レプトスピラ属のDNAを同定し、病原性、腐生性、および中間体の3つのクレードを区別することができます。プライマーとプローブの設計は、Ahmedら、Azaliら、Bourhyら、Weissら、およびBrangerらによる以前の研究に基づいていました33,34,35,36,37。各プローブ、プライマー、および増幅フラグメントの配列は、表1に記載され、参照配列とのアラインメントは、補足ファイル1、補足ファイル2、補足ファイル3、補足ファイル4、および補足ファイル5に記載されている。PCR試薬とサーモサイクル条件は、プロトコルのセクションに記載されています。
増幅産物は、TAE(40 mM Tris 塩基、20 mM 酢酸、1 mM EDTA、pH 8.3)中の 1% アガロースゲル上で電気泳動分離し、エチジウムブロマイド検出を行い、エチジウムブロマイド検出を行い、補足図 1 に示すように可視化しました。各血清型から得られたゲノムDNAは、病原性レプトスピラのL.インターロガン(4, 691, 184 bp)38、腐生性レプトスピラのL. biflexa(3, 956, 088 bp)39のゲノムサイズに基づいて、各PCR反応において6 x 106から1 x 104ゲノム当量コピー(GEq)の範囲の濃度で使用されました。 L. fainei serovar Hurstbridge株BUT6(4、267、324 bp)のゲノムサイズ(アクセッション番号AKWZ00000000.2)。
プローブの感度は、各実験で各病原性血清型、 L. biflexa serovar Patoc Patoc I株、および L. fainei serovar Hurstbridge株BUT6のDNAで評価されました。PCRおよびドットブロットハイブリダイゼーションアッセイの特異性を評価するために、非血縁細菌由来のDNAを含めました。
表1:レプトスピラの病原性、腐生菌、および中間クレードを同定するための産物を増幅するためのPCRプライマーおよびプローブ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイ DNAサンプルを入れる穴がドット状になっており、真空吸引で所定の位置に固定するように吸引すると、この形状になることからドットブロットと呼ばれる手法です。この手法は、Kafatos et al.40によって開発されました。この技術により、各PCR陽性サンプル中のレプトスピラを半定量化できます。プロトコルは、室温でNaOH 0.4Mによる変性で構成され、6 x 106〜104レプトスパイアに対応する30ng〜0.05ngのレプトスピラDNAを含むサンプルを、96ウェルドットブロット装置でナイロンメンブレンにブロットします。固定化後、DNAは120mJのUV光にさらされることによって膜に結合します。各DNAプローブは、3'末端の末端トランスフェラーゼ触媒ステップによってジゴキシゲニン-11dUTPと結合される(ジゴキシゲニンは、レポーターとして使用されるジギタリス・プルプレアから得られる植物ステロイドである41)。標識されたDNAプローブ(50 pmol)を特定の温度で標的DNAに厳密にハイブリダイズした後、DNAハイブリッドは、その基質CSPDと共有結合した抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ抗体との化学発光反応によって可視化されます。発光は、X線フィルムへの曝露によって捕捉されます(図2)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> 図2:PCRドットブロットアッセイの手順のステップ。 この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

ドットブロットは、キャリアDNAの存在下でプローブハイブリダイゼーションによって特異的に標的とされる最小限の量のDNAの同定を可能にする、シンプル、高速、高感度、および汎用性の高い技術です。これは、ナイロン膜などの不活性固体支持体に既知の量のDNAを、ドットブロット装置を利用して電気泳動分離なしで転写することに基づいています。ナイロン膜は、高い核酸結合能(400μg / cm2)、高強度、および正または中性に帯電しているという利点があります。使用されるプローブは、ジゴキシゲニン(DIG)で標識された18〜20塩基の非常に特異的なssDNAフラグメントです。プローブは レプトスピラ DNAと結合します。プローブが標的DNAとハイブリダイズすると、抗ジゴキシゲニン抗体によって検出され、X線フィルムで明らかになった発光によって簡単に検出できます。発光のあるドットは、目的のDNA断片に対応します。この方法では、プローブの非同位体標識を採用しており、半減期が非常に長い場合があります。この標準的な免疫標識の欠点は、同位体プローブよりも感度が低いことです。それにもかかわらず、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とドットブロットアッセイを組み合わせることで軽減されます。このアプローチにより、ターゲット配列の濃縮とその検出が可能になります。さらに、よく知られている標準の段階希釈と比較した場合の定量的アプリケーションとして使用できます。ここでは、水サンプル中の3つの主要なクレードから レプトスピラ を検出するためのドットブロットアプリケーションを紹介します。この方法論は、遠心分離によって濃縮された大量の水に適用して、レプトスパイラルDNAの存在の証拠を提供することができます。これは、一般的なスクリーニング目的にとって貴重で満足のいくツールであり、水中に存在する可能性のある他の培養不可能な細菌に使用できるため、生態系の理解が向上します。

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

著者スポットライト:環境分析と疾患監視のための水中の レプトスピラ DNA検出

水サンプル中の レプトスピラ 検出のためのポリメラーゼ連鎖反応とドットブロットハイブリダイゼーション

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

この技術の有効性を評価するために、各レプトスピラ血清型の純粋培養物からのゲノムDNAを、クレード特異的プローブとともに使用しました。膜は、各血清型のPCR反応ごとに100ngのゲノムDNAで調製され、続いて非関連細菌の8つのゲノムDNAとアドホックなレプトスピラ血清のゲノムDNAの可変濃度が続きました。各アッセイには、ポジティブ、ネガティブ、および非テンプレートコ?...

この研究では、水サンプル中の3つの主要なクレードから レプトスピラ を検出するために、ドットブロットアプリケーションを設計しました。この方法により、ジゴキシゲニン標識プローブによって特異的に標的とされる最小限のDNA量を同定でき、抗ジゴキシゲニン抗体によって容易に検出されます。このアプローチは、スクリーニングの目的にとって貴重で満足のいくツールです。

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

このプロトコルは、水サンプル中のレプトスピラDNAの存在を特定するように設計されています。この目的のためにドットブロット技術が利用され、DNAの正確な検出と分析が可能になります。ドットブロットは、簡単で汎用性の高い非同位体法であり、レプトスピラの環境分布に関する重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この方法は、巨大な水域を評価し、病気の監視に役立つ可能性があります。

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.

著者スポットライト:環境分析と疾患監視のための水中の レプトスピラ DNA検出

著者スポットライト:環境分析と疾患監視のための水中のレプトスピラ DNA検出