Name: Forfatter Spotlight: Leptospira DNA-deteksjon i vann for miljøanalyse og sykdomsovervåking
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00
Description: The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Vi står i gjeld til Leptospira-samlingen ved Institutt for mikrobiologi og immunologi, Fakultet for veterinærmedisin og zooteknikk, National Autonomous University of Mexico. Vi er takknemlige for den sjenerøse donasjonen av referansen Leptospira-stammer ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 og Leptospira biflexa serovar Patoc stamme Patoc I til Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Vi takker Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, CIBAC-koordinator, og personellet for deres logistiske støtte. EDT var under Terminal Project-programmet for bachelorstudenter ved Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. Vi anerkjenner den Biorender.com programvaren for opprettelsen av figur 1 og 3 til 9.

1. Forberedelse av prøver
<ol><li>Konsentrer hver vannprøve i 1,5 ml mikrosentrifugerør ved sentrifugering ved 8000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Gjenta dette trinnet, så mange ganger som nødvendig, for å konsentrere prøven til et volum på 250 μL.</li>
	<li>Bruk DNA-ekstraksjonssettet i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell).</li>
	<li>Utfør den spesifikke PCR i henhold til dot-blot-sonden som skal brukes (tabell 1).<ol><li>Utfør...

Dot-Blot-analyse for påvisning av Leptospira-DNA i vannprøver

De kritiske trinnene i dot-blot-teknikken inkluderer (1) DNA-immobilisering, (2) blokkering av de frie bindingsstedene på membranen med ikke-homologt DNA, (3) komplementariteten mellom sonden og målfragmentet under glødningsbetingelser, (4) fjerning av den uhybridiserte sonden og (5) påvisning av reportermolekylet41.
PCR-Dot-blot har visse begrensninger, for eksempel at teknikken ikke gir informasjon om størrelsen på det hybridiserte fragmentet37...

Leptospirose hos mennesker stammer hovedsakelig fra miljøkilder 1,2. Tilstedeværelsen av Leptospira i innsjøer, elver og bekker er en indikator på leptospiroseoverføring blant dyreliv og husdyr og produksjonsdyr som til slutt kan komme i kontakt med disse vannmassene 1,3,4. Videre har Leptospira blitt identifisert i ikke-naturlige kilder, inkludert kloakk, stillestående og vann fra springen 5,6.
Leptospira er en verdensomspennende distribuert bakterie 7,8, og miljøets rolle i bevaring og overføring har blitt godt anerkjent. Leptospira kan overleve i drikkevann under variabel pH og mineraler9, og i naturlige vannmasser1. Den kan også overleve i lange perioder i destillert vann10, og under konstant pH (7,8) kan den overleve opptil 152 dager11. Videre kan Leptospira samhandle i bakterielle konsortier for å overleve tøffe forhold12,13. Det kan være en del av biofilm i ferskvann med Azospirillum og Sphingomonas og er til og med i stand til å vokse og tåle temperaturer over 49 ° C14,15. Det kan også formere seg i vannmettet jord og forbli levedyktig i opptil 379 dager16, og bevare sin evne til å forårsake sykdommen så lenge som et år17,18. Imidlertid er lite kjent om økologien i vannlegemer og hvordan den er fordelt i dem.
Siden oppdagelsen var studien av slekten Leptospira basert på serologiske tester. Det var ikke før det nåværende århundre at molekylære teknikker ble mer utbredt i studiet av denne spirochaete. Dot-blot har knapt blitt brukt til identifikasjon ved hjelp av (1) en isotopisk sonde basert på 16S rRNA og på en inter-enkel sekvensrepetisjon (ISSR) 19,20, (2) som en nanogoldbasert immunoassay for human leptospirose anvendt på urin21, eller (3) som en antistoffbasert analyse for storfe urinprøver22. Teknikken falt ut av bruk fordi den opprinnelig var basert på isotopiske prober. Det er imidlertid en velkjent teknikk som, kombinert med PCR, gir forbedrede resultater, og det anses som trygt på grunn av bruk av ikke-isotopiske prober. PCR spiller en avgjørende rolle i anrikningen av Leptospira DNA ved å amplifisere et spesifikt DNA-fragment som kan finnes i spormengder i en prøve. Under hver PCR-syklus dobles mengden av det målrettede DNA-fragmentet i reaksjonen. På slutten av reaksjonen har amplikonen blitt multiplisert med en faktor på mer enn en million23. Produktet forsterket av PCR, ofte ikke synlig i agaroseelektroforese, blir synlig gjennom spesifikk hybridisering med en DIG-merket sonde i dot-blot 24,25,26.
Dot-blot-teknikken er enkel, robust og egnet for mange prøver, noe som gjør den tilgjengelig for laboratorier med begrensede ressurser. Det har blitt brukt i en rekke bakteriestudier, inkludert (1) orale bakterier27, (2) andre prøvetyper som mat og avføring28, og (3) identifisering av unculturable bakterier29, ofte i samsvar med andre molekylære teknikker. Blant fordelene som tilbys av dot-blot-teknikken er: (1) Membranen har en høy bindingskapasitet, i stand til å binde over 200 μg / cm2 nukleinsyrer og opptil 400 μg / cm2; (2) Dot-blot-resultater kan tolkes visuelt uten å kreve spesialutstyr, og (3) de kan enkelt lagres i årevis ved romtemperatur (RT).
Slekten Leptospira har blitt klassifisert i patogene, mellomliggende og saprofytiske klader30,31. Skillet mellom disse kladene kan oppnås basert på spesifikke gener som lipL41, lipL32 og 16S rRNA. LipL32 er tilstede i de patogene kladene og utviser høy sensitivitet i ulike serologiske og molekylære verktøy, mens den er fraværende i saprofyttarter21. Housekeeping-genet lipL41 er kjent for sitt stabile uttrykk og brukes i molekylære teknikker32, mens 16S rRNA-genet brukes til klassifisering.
Denne metoden kan brukes på store mengder vann når de har blitt konsentrert ved sentrifugering. Det tillater vurdering av ulike punkter og dybder i en vannkropp for å oppdage tilstedeværelsen av leptospiralt DNA og kladen som den tilhører. Dette verktøyet er verdifullt for både økologiske og generelle screeningformål, og kan også brukes til å oppdage andre ikke-dyrkbare bakterier som kan være tilstede i vann.
I tillegg er PCR- og dot-blot-analyser teknisk og økonomisk rimelige for et bredt spekter av laboratorier, selv de som mangler sofistikert eller dyrt utstyr. Denne studien tar sikte på å anvende digoksigeninbasert dot-blot for identifisering av de tre Leptospira-klader i vannprøver samlet fra naturlige vannmasser.
Bakterielle stammer Tolv Leptospira serovarer (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, og Wolffi) ble inkludert i denne studien. Disse serovarene er en del av samlingen ved Institutt for mikrobiologi og immunologi, Fakultet for veterinærmedisin og zooteknikk, National Autonomous University of Mexico, og de brukes for tiden i mikroagglutineringstesten (LAR).
Alle Leptospira serovarer ble dyrket i EMJH, og deres DNA ble ekstrahert ved hjelp av et kommersielt DNA-ekstraksjonssett (se materialtabell). En genomisk DNA-blanding av de tolv serovarene ble brukt som en positiv kontroll for den patogene kladen Leptospira . Som positiv kontroll av mellomkladen Leptospira ble genomisk DNA fra Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stamme BUT6 inkludert, og som positiv kontroll for Leptospira-saprofyttkladen ble også genomisk DNA fra Leptospira biflexa serovar Patoc-stammen Patoc I, inkludert.
Negative kontroller besto av et tomt plasmid, DNA fra ikke-relaterte bakterier (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii og Escherichia coli) og PCR-gradig vann, som fungerte som ikke-malkontroll.
Vannprøver Tolv prøvetakingsprøver ble samlet inn ved hjelp av en stratifisert-tilfeldig prøvetakingsmetode fra Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Disse prøvene ble tatt på tre dybder: overfladisk, 10 og 30 cm (figur 1A, B). Vanninnsamlingsprosedyrene påvirket ingen truede eller beskyttede arter. Hver prøve ble samlet i et sterilt 15 ml mikrosentrifugerør. For å samle prøven ble hvert rør forsiktig nedsenket i vannet, fylt på den valgte dybden og deretter forseglet. Prøvene ble oppbevart ved 22 °C og straks transportert til laboratoriet for behandling.
Hver prøve ble konsentrert ved sentrifugering i sterile 1,5 ml mikrosentrifugerør ved 8000 x g i 20 minutter ved romtemperatur. Dette trinnet ble gjentatt til alle prøvene ble konsentrert i ett rør, som deretter ble brukt til DNA-ekstraksjon (figur 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> Figur 1: Konsentrasjon av vannprøver ved sentrifugering. (A) Vannprøvedammer, og (B) Naturlige bekker. (C) Sentrifugeringsbasert vannprøvebehandling i gjentatte trinn så mange ganger som nødvendig (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
DNA-ekstraksjon Totalt DNA ble isolert ved hjelp av et kommersielt genomisk DNA-sett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell). DNA-ekstraksjoner ble eluert i 20 μL elueringsbuffer, og DNA-konsentrasjon ble bestemt av et UV-spektrofotometer ved 260-280 nm, og lagret ved 4 °C til bruk.
PCR-amplifikasjon PCR-målene var 16S rRNA-, lipL41- og lipL32-gener, som identifiserer DNA fra slekten Leptospira og tillater skillet mellom de tre kladene: patogen, saprofytisk og mellomliggende. Både primere og sondedesign var basert på tidligere arbeider av Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. og Branger et al.33,34,35,36,37. Sekvensen av hver sonde, primer og forsterkede fragment er beskrevet i tabell 1, og deres tilpasning til referansesekvenser er gitt i tilleggsfil 1, tilleggsfil 2, tilleggsfil 3, tilleggsfil 4 og tilleggsfil 5. PCR-reagensene og termosyklusforholdene er beskrevet i protokollavsnittet.
Forsterkningsprodukter ble visualisert ved elektroforetisk separasjon på en 1% agarosegel i TAE (40 mM Tris-base, 20 mM eddiksyre og 1 mM EDTA; pH 8,3), ved 60 V i 45 minutter med ethidiumbromiddeteksjon, som vist i tilleggsfigur 1. Genomisk DNA oppnådd fra hver serovar ble brukt med konsentrasjoner fra 6 x 106 til 1 x 104 genomiske ekvivalente kopier (GEq) i hver PCR-reaksjon, basert på genomstørrelsen til L. interrogans (4, 691, 184 bp) 38 for patogen Leptospira, genomstørrelsen til L. biflexa (3, 956, 088 bp) 39 for saprofytisk Leptospira, og genomstørrelsen til L. fainei serovar Hurstbridge-stamme BUT6 (4, 267, 324 bp) med tiltredelsesnummer AKWZ00000000.2.
Sensitiviteten til sondene ble vurdert med DNA fra hver patogen serovar, L. biflexa serovar Patoc stamme Patoc I og L. fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 i hvert eksperiment. For å vurdere spesifisiteten til PCR- og dot-blot-hybridiseringsanalysen ble DNA fra ikke-relaterte bakterier inkludert.
Tabell 1: PCR-primere og prober for å amplifisere produkter for å identifisere de patogene, saprofyte og mellomliggende klader av Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Dot-blot hybridiseringsanalyse Teknikken kalles dot-blot fordi hullene der DNA-prøven er plassert har en prikkform, og når de suges for å festes på plass ved vakuumsuging, får de denne formen. Denne teknikken ble utviklet av Kafatos et al.40. Teknikken tillater semi-kvantifisering av Leptospira i hver PCR-positiv prøve. Protokollen består av en denaturering med NaOH 0,4 M ved romtemperatur, prøver med Leptospira DNA fra 30 ng til 0,05 ng, tilsvarende 6 x 106 til 1 x 104 leptospirer, blir blottet på en nylonmembran med et 96-brønns dot-blot-apparat. Etter immobilisering er DNA bundet til membranen ved eksponering for 120 mJ UV-lys. Hver DNA-sonde er konjugert med digoksigenin-11 dUTP ved et terminalt transferasekatalysetrinn i 3'-enden (Digoxigenin er et plantesteroid oppnådd fra Digitalis purpurea, brukt som reporter41). Etter den strenge hybridiseringen av den merkede DNA-sonden (50 pmol) ved den spesifikke temperaturen på mål-DNA, visualiseres DNA-hybridene ved kjemiluminescensreaksjonen med det alkaliske fosfataseantistoffet mot digoksigenin kovalent konjugert med dets substrat CSPD. Luminescensen fanges opp ved eksponering for røntgenfilm (figur 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> Figur 2: Trinn i prosedyren for PCR-dot-blot-analysen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K182002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, grade 1,</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11417240001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Base EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>S1368JAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptospira Enrichment EMJH</td>
			<td>Difco</td>
			<td>BD 279510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5&#8242;-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate</td>
			<td>Merk</td>
			<td>11755633001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from herring sperm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D3159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX5158621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-ddUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11363905910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixer Carestream</td>
			<td>Carestream Health Inc</td>
			<td>GBX 5158605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-9150</td>
			<td>It is an anionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal transferase, recombinant</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3289869103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSPE 20X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2015-1L</td>
			<td>It can be Home-made following Supplementary File 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>On demand</td>
			<td>Follow table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1-14K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 &#181;l, 20-200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU:F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 600 &#181;l microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette tips 1-200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TR-222-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dot-Blot apparatus Bio-Dot</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Hergom Suction</td>
			<td>Hergom</td>
			<td>7E-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PH90-115V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>UVC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler</td>
			<td>Hybaid</td>
			<td>HBPX110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiographic cassette with IP Plate14 X 17</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polymerase chain reaction and dot-blot hybridization for leptospira detection in water samples

Dot-blot er en enkel, rask, sensitiv og allsidig teknikk som muliggjør identifisering av minimale mengder DNA spesifikt målrettet ved sondehybridisering i nærvær av bærer-DNA. Den er basert på overføring av en kjent mengde DNA til en inert fast støtte, slik som en nylonmembran, ved bruk av dot-blot-apparatet og uten elektroforetisk separasjon. Nylonmembraner har fordelen av høy nukleinsyrebindingskapasitet (400 μg / cm2), høy styrke, og er positivt eller nøytralt ladet. Sonden som brukes er et svært spesifikt ssDNA-fragment på 18 til 20 baser som lenge er merket med digoksigenin (DIG). Sonden vil konjugere med Leptospira DNA. Når sonden har hybridisert med mål-DNA, detekteres den av et anti-digoksigeninantistoff, slik at den enkelt kan detekteres gjennom utslippene som avsløres i en røntgenfilm. Prikkene med en utslipp vil tilsvare DNA-fragmentene av interesse. Denne metoden benytter sondens ikke-isotopiske merking, som kan ha en svært lang halveringstid. Ulempen med denne standard immunetiketten er en lavere følsomhet enn isotopiske prober. Likevel reduseres det ved kobling av polymerasekjedereaksjon (PCR) og dot-blot-analyser. Denne tilnærmingen muliggjør berikelse av målsekvensen og dens deteksjon. I tillegg kan den brukes som en kvantitativ applikasjon sammenlignet med en seriell fortynning av en velkjent standard. En dot-blot-applikasjon for å oppdage Leptospira fra de tre hovedkladene i vannprøver presenteres her. Denne metoden kan brukes på store mengder vann når de har blitt konsentrert ved sentrifugering for å gi bevis på tilstedeværelsen av leptospiralt DNA. Dette er et verdifullt og tilfredsstillende verktøy for generelle screeningformål, og kan brukes til andre ikke-dyrkbare bakterier som kan være tilstede i vann, noe som øker forståelsen av økosystemet.

Leptospirosis in humans mainly originates from environmental sources1,2. The presence of Leptospira in lakes, rivers, and streams is an indicator of leptospirosis transmission among wildlife, and domestic and production animals that may eventually come into contact with these bodies of water1,3,4. Furthermore, Leptospira has been identified in non-natural sources, including sewage, stagnant and tap water5,6.
Leptospira is a worldwide distributed bacteria7,8, and the role of the environment in its preservation and transmission has been well recognized. Leptospira can survive in drinking water under variable pH and minerals9, and in natural bodies of water1. It can also survive for long periods in distilled water10, and under constant pH (7.8), it may survive up to 152 days11. Moreover, Leptospira may interact in bacterial consortiums to survive harsh conditions12,13.&#160;It may be part of biofilms in freshwater with Azospirillum and Sphingomonas and is even capable of growing and enduring temperatures exceeding 49 &#176;C14,15. It can also multiply in waterlogged soil and remain viable for up to 379 days16, preserving its ability to cause the disease for as long as a year17,18. However, little is known about the ecology within water bodies and how it is distributed within them.
Since its discovery, the study of the genus Leptospira was based on serological tests. It was not until the current century that molecular techniques became more prevalent in the study of this spirochaete. The dot-blot has been scarcely used for its identification using (1) an isotopic probe based on the 16S rRNA and on an inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) as a nanogold based immunoassay for human leptospirosis applied to urine21, or (3) as an antibody-based assay for bovine urine samples22. The technique fell in disuse because it was originally based on isotopic probes. However, it is a well-known technique that, coupled with PCR, yields enhanced results, and it is considered safe due to the use of non-isotopic probes. PCR plays a crucial role in the enrichment of the Leptospira DNA by amplifying a specific DNA fragment that may be found in trace amounts in a sample. During each PCR cycle, the amount of the targeted DNA fragment is doubled in the reaction. At the end of the reaction, the amplicon has been multiplied by a factor of more than a million23. The product amplified by PCR, often not visible in agarose electrophoresis, becomes visible through specific hybridization with a DIG-labeled probe in the dot-blot24,25,26.
The dot-blot technique is simple, robust, and suitable for numerous samples, making it accessible to laboratories with limited resources. It has been employed in a variety of bacteria studies, including (1) oral bacteria27, (2) other sample types such as food and feces28, and (3) the identification of unculturable bacteria29, often in agreement with other molecular techniques. Among the advantages offered by the dot-blot technique are: (1) The membrane has a high binding capacity, capable of binding over 200 &#956;g/cm2 of nucleic acids and up to 400 &#956;g/cm2; (2) Dot-blot results can be visually interpreted without requiring special equipment, and (3) they can be conveniently stored for years at room temperature (RT).
The genus Leptospira has been classified into pathogenic, intermediate, and saprophytic clades30,31. The distinction among these clades can be achieved based on specific genes such as lipL41, lipL32, and the 16S&#160;rRNA. LipL32 is present in the pathogenic clades and exhibits high sensitivity in various serological and molecular tools, whereas it is absent in saprophyte species21. The housekeeping gene lipL41 is&#160;known for its stable expression and used in molecular techniques32, while the 16S&#160;rRNA gene is utilized for their classification.
This methodology can be applied to large volumes of water once they have been concentrated by centrifugation. It allows the assessment of various points and depths within a water body to detect the presence of leptospiral DNA and the clade to which it belongs. This tool is valuable for both ecological and general screening purposes and can also be employed to detect other non-culturable bacteria that may be present in water.
Additionally, PCR and dot-blot assays are technically and economically affordable to a wide range of laboratories, even those lacking sophisticated or expensive equipment. This study aims to apply the digoxigenin-based dot-blot for the identification of the three Leptospira clades in water samples collected from natural bodies of water.
Bacterial strains 
Twelve Leptospira serovars (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, and Wolffi) were included in this study. These serovars are part of the collection at the Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National Autonomous University of Mexico,&#160;and they are currently used in the microagglutination test (MAT).
All Leptospira serovars were cultured in EMJH, and their DNA was extracted using a commercial DNA extraction kit (see Table of Materials). A genomic DNA mix of the twelve serovars was used as a positive control for the Leptospira pathogenic clade. As a positive control of the Leptospira intermediate clade, genomic DNA from Leptospira fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 was included, and as a positive control for the Leptospira saprophyte clade, genomic DNA of Leptospira biflexa serovar Patoc strain Patoc I, was also included.
Negative controls consisted of an empty plasmid, DNA from non-related bacteria (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Escherichia coli), and PCR-grade water, which served as non-template control.
Water samples 
Twelve trial grab samples were collected using a stratified-haphazard sampling method from the Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19&#176; 16&#39; 54&#34; N 99&#176; 6&#39; 11&#34; W). These samples were obtained at three depths: superficial, 10, and 30 cm (Figure 1A, B). The water collection procedures did not impact any endangered or protected species. Each sample was collected in a sterile 15 mL microcentrifuge tube. To collect the sample, each tube was gently submerged in the water, filled at the selected depth, and then sealed. The samples were maintained at 22 &#176;C and promptly transported to the laboratory for processing.
Each sample was concentrated by centrifugation in sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes at 8000 x g for 20 min at room temperature. This step was repeated until all the samples were concentrated into one tube, which was then used for DNA extraction (Figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Concentration of water samples by centrifugation. (A) Water sampling ponds, and (B) Natural streams. (C) Centrifugation-based water sample processing in repeated steps as many times as needed (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
DNA extraction 
Total DNA was isolated using a commercial Genomic DNA kit according to the manufacturer&#39;s instructions (see Table of Materials). DNA extractions were eluted in 20 &#181;L of elution buffer, and DNA concentration was determined by a UV Spectrophotometer at 260-280 nm, and stored at 4 &#176;C until use.
PCR amplification 
The PCR targets were the 16S rRNA, lipL41, and lipL32 genes, which identify DNA from the genus Leptospira and allow the distinction among the three clades: pathogenic, saprophytic, and intermediate. Both primers and probe designs were based on the previous works by Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., and Branger et al.33,34,35,36,37. The sequence of each probe, primer, and amplified fragment are described in Table 1, and their alignment with reference sequences are provided in Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, and Supplementary File 5. The PCR reagents and thermocycling conditions are described in the protocol section.
Amplification products were visualized by electrophoretic separation on a 1% agarose gel in TAE (40 mM Tris base, 20 mM Acetic acid, and 1 mM EDTA; pH 8.3), at 60 V for 45 min with ethidium-bromide detection, as shown in Supplementary Figure 1. Genomic DNA obtained from each serovar was used with concentrations ranging from 6 x 106 to 1 x 104 genomic equivalent copies (GEq) in each PCR reaction, based on the genome size of L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 for pathogenic Leptospira, the genome size of L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 for saprophytic Leptospira, and the genome size of L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) with accession number AKWZ00000000.2.
The sensitivity of the probes was assessed with DNA from each pathogenic serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I, and L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 in each experiment. To assess the specificity of the PCR and dot-blot hybridization assay, DNA from non-related bacteria was included.
Table 1: PCR primers and probes to amplify products for identifying the pathogenic, saprophyte, and intermediate clades of Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_ 7th_PR_ EMCC.xlsx" target="_blank">Please click here to download this Table.</a>
Dot-blot hybridization assay 
The technique is called dot-blot because the holes in which the DNA sample is placed have a dot shape, and when they are sucked to be fixed in place by vacuum suction, they acquire this shape. This technique was developed by Kafatos et al.40. The technique allows the semi-quantification of Leptospira in each PCR-positive sample. The protocol consists of a denaturation with NaOH 0.4 M at room temperature, samples with Leptospira DNA from 30 ng to 0.05 ng, corresponding to 6 x 106 to 1 x 104 leptospires, are blotted onto a nylon membrane with a 96-well dot-blot apparatus. After immobilization, the DNA is bound to the membrane by exposure to 120 mJ UV light. Each DNA probe is conjugated with digoxigenin-11 dUTP by a terminal transferase catalysis step at the 3&#39; end (Digoxigenin is a plant steroid obtained from Digitalis purpurea, used&#160;as a reporter41). Following the stringent hybridization of the labeled DNA probe (50 pmol) at the specific temperature onto the target DNA, the DNA hybrids are visualized by the chemiluminescence reaction with the anti-digoxigenin alkaline phosphatase antibody covalently conjugated with its substrate CSPD. The luminescence is captured by exposure to an X-ray film (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg" /> 
Figure 2: Steps of the procedure for the PCR-dot-blot assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Forfatter Spotlight: Leptospira DNA-deteksjon i vann for miljøanalyse og sykdomsovervåking

Polymerasekjedereaksjon og dot-blot-hybridisering for Leptospira-deteksjon i vannprøver

This protocol is designed to identify the presence of Leptospira DNA in water samples. The dot-blot technique is utilized for this purpose, which enables accurate detection and analysis of the DNA. The dot-blot is an easy and versatile non-isotopic technique and may help to answer key questions about the environmental distribution of Leptospira.This method has the potential to assess huge water bodies and aid in disease surveillance.

For å vurdere effektiviteten av teknikken ble genomisk DNA fra rene kulturer av hver Leptospira serovar brukt, sammen med den kladespesifikke sonden. Membraner ble fremstilt med 100 ng genomisk DNA per PCR-reaksjon for hver serovar, etterfulgt av åtte genomiske DNA av ikke-relaterte bakterier og variable konsentrasjoner av genomisk DNA av ad hoc Leptospira serovarer. Hver analyse inkluderte positiv, negativ og ikke-malkontroll. Disse ikke-relaterte genomiske DNA-ene viste ikke en affinitet for dot-blo...

I denne studien ble en dot-blot-applikasjon designet for å oppdage Leptospira fra de tre hovedkladene i vannprøver. Denne metoden tillater identifisering av minimale DNA-mengder spesifikt målrettet av en digoksigenin-merket sonde, lett detekteres av et anti-digoksigeninantistoff. Denne tilnærmingen er et verdifullt og tilfredsstillende verktøy for screeningformål.

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Denne protokollen er utformet for å identifisere tilstedeværelsen av Leptospira DNA i vannprøver. Dot-blot-teknikken brukes til dette formålet, noe som muliggjør nøyaktig deteksjon og analyse av DNA. Prikkflekken er en enkel og allsidig ikke-isotopisk teknikk og kan bidra til å svare på viktige spørsmål om miljøfordelingen av Leptospira.Denne metoden har potensial til å vurdere store vannforekomster og hjelpe til med sykdomsovervåking.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

JoVE Journal

Biology

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by probe hybridization in the presence of carrier DNA. It is based on the transfer of a known amount of DNA onto an inert solid support, such as a nylon membrane, utilizing the dot-blot apparatus and without electrophoretic separation. Nylon membranes have the advantage of high nucleic acid binding capacity (400 &#181;g/cm2), high strength, and are positively or neutrally charged. The probe used is a highly specific ssDNA fragment of 18 to 20 bases long labeled with digoxigenin (DIG). The probe will conjugate with the Leptospira DNA. Once the probe has hybridized with the target DNA, it is detected by an anti-digoxigenin antibody, allowing its easy detection through its emissions revealed in an X-ray film. The dots with an emission will correspond to the DNA fragments of interest. This method employs the non-isotopic labeling of the probe, which may have a very long half-life. The drawback of this standard immuno-label is a lower sensitivity than isotopic probes. Nevertheless, it is mitigated by coupling polymerase chain reaction (PCR) and dot-blot assays. This approach enables the enrichment of the target sequence and its detection. Additionally, it may be used as a quantitative application when compared against a serial dilution of a well-known standard. A dot-blot application to detect Leptospira from the three main clades in water samples is presented here. This methodology can be applied to large amounts of water once they have been concentrated by centrifugation to provide evidence of the presence of Leptospiral DNA. This is a valuable and satisfactory tool for general screening purposes, and may be used for other non-culturable bacteria that may be present in water, enhancing the comprehension of the ecosystem.

In this study, a dot-blot application was designed to detect Leptospira from the three main clades in water samples. This method allows for the identification of minimal DNA quantities specifically targeted by a digoxigenin-labeled probe, easily detected by an anti-digoxigenin antibody. This approach is a valuable and satisfactory tool for screening purposes.